OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS PARASITARIOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DE TREMATODOSIS BOVINAS MEDIANTE ELECTROELUCIÓN

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1 OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS PARASITARIOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DE TREMATODOSIS BOVINAS MEDIANTE ELECTROELUCIÓN FRANCISCO, I., LOMBA, C., PARDO, M., PEDREIRA, J., SUÁREZ, J.L., SÁNCHEZ- ANDRADE, R., DÍAZ, P., ARIAS, M., PAZ-SILVA, A., MORRONDO, M.P., DÍEZ- BAÑOS, P. Parasitología y Enfermedades Parasitarias, Dpto. Patología Animal. Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 272-Lugo (SPAIN). INTRODUCCIÓN Se han desarrollado ensayos sobre la respuesta inmunitaria ante supuestos de infección por F. hepatica (Keegan y Trudgett, 992; Arias, 2; Lomba, 25) en los que se ha demostrado que durante la infección por F. hepatica se liberan productos de excreción/secreción con actividad antigénica, puesto que estimulan la formación de anticuerpos que reaccionen frente a antígenos del trematodo. Esto ha supuesto un avance importante en el diagnóstico de algunas enfermedades parasitariasmediante procedimientos que ofrecen facilidad de empleo, rapidez y economía, como la detección de anticuerpos con técnicas inmunoenzimáticas como el ELISA (enzyme linked-immunoassay). Sin embargo, la detección de estos anticuerpos mediante técnicas inmunoenzimáticas como el ELISA-indirecto plantea algunos inconvenientes, en especial derivados de la utilización de antígenos excesivamente complejos, que pueden reducir la especificidad. Peña (994) y Abbas et al. (999) demostraron que la respuesta inmunitaria frente a diferentes antígenos también incluía la presencia de anticuerpos inespecíficos. Conviene destacar asimismo el hecho de que, en algunas especies animales, se han observado situaciones de reactividad cruzada o respuesta inmunitaria cruzada (Boyce et al., 988; Kennedy et al., 989; Romasanta et al., 23). En éstas, los anticuerpos de animales infectados con un agente parasitario, reaccionan también frente a antígenos de otras especies parásitas, lo que puede suponer un problema en su diagnóstico específico basado en la detección de anticuerpos frente a productos antigénicos. Se ha comprobado la existencia de reactividad cruzada entre F. hepatica y otros parásitos como Schistosoma (Sirisriro et al., 22), Paramphistomum (Maji et al., 999; Lomba, 2), Ascaris suum y/o Toxocara canis (Arias, 2; Rokni et al., 23). El principal objetivo del presente estudio consistió en el análisis de antígenos purificados de F. hepatica, Calicophoron daubneyi y Dicrocoelium dendriticum para el diagnóstico específico de fasciolosis, paranfistomosis y dicroceliosis en ganado vacuno. MATERIAL Y MÉTODOS Se obtuvieron antígenos de trematodos adultos de F. hepatica, D. dendriticum y C. daubneyi a partir de vacas sacrificadas en matadero. Para ello, se recogieron las formas parasitarias del hígado, vesícula biliar y rumen de los bóvidos, se lavaron en PBS, y se incubaron en medio RPMI a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5%, para obtener los productos de excreción/secreción. Estos antígenos se fraccionaron mediante la técnica de eletroforesis en condiciones reductoras (SDS-PAGE), empleando geles al 2%. A continuación, los péptidos se extrajeron de los geles empleando un Whole Gel Eluter (Bio-Rad).

2 Las diferentes fracciones de cada uno de los antígenos obtenidos se valoraron con la técnica ELISA, empleando sueros de bovinos de raza Rubia Gallega con monoinfección por cada uno de los trematodos mencionados. Se usaron sueros de terneros de 6 meses que nunca habían salido al pasto, como testigos negativos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La utilización del Whole Gel Eluter permitió obtener cantidades importantes de cada una de las fracciones de los antígenos parasitarios, que se emplearon como antígenos mediante ELISA. De cada uno de los antígenos de excreción/secreción se obtuvieron 4 fracciones, de peso molecular entre 5 y 7 kda, lo que coincide con diferentes investigaciones (Poitou et al., 992; Ruiz et al., 23). Como se puede observar en la Figura, mediante el ELISA se comprobó que las fracciones más útiles para el diagnóstico diferencial de estas trematodosis eran las de peso molecular más bajo (<35 kda) (fracciones 7-4), ya que se establecían las mayores diferencias entre los sueros positivos y los negativos. Estos resultados coinciden con experiencias previas en las que se demostró la utilidad de moléculas de bajo peso molecular, componentes del antígeno de ES de F. hepatica, para el diagnóstico de rumiantes y de otras especies (Hillyer y Soler, 988) y también en antígeno de F. gigantica (Arafa et al., 999; Mousa, 2). Ibarra et al. (998) y Maji et al. (999), en vacunos y búfalos, y Arias (2) y Lomba (2) en ovino y rata, respectivamente, comprobaron la existencia de reacciones cruzadas entre Fasciola y Calicophoron.

3 Fig. a. Diagnóstico de fasciolosis con las fracciones de menos de 35 kda.,3 F F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F F F2 F3 F4 Fig. b. Diagnóstico de dicroceliosis con las fracciones de menos de 35 kda.,3 F F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F F F2 F3 F4

4 Fig. c. Diagnóstico de paranfistomosis con las fracciones de menos de 35 kda.,3 F F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F F F2 F3 F4 CONCLUSIONES La técnica de electroelución resulta muy útil para la purificación de antígenos válidos para el diagnóstico de trematodosis bovinas mediante técnicas inmunoenzimáticas como el ELISA. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se financió con los Proyectos de Investigación PGIDTAGR262PR (Xunta de Galicia, España) y AGL (DGICYT, Ministerio de Ciencia y Tecnología, España). BIBLIOGRAFÍA ARAFA, M.S.; ABAZA, S.M.; EL-SHEWY, K.A.; MOHAREB, E.W. y EL-MOAMLY, A.A. (999). Detection of Fasciola-specific excretory/secretory (ES) protein fraction band (49,5 kda.) and its utilization in diagnosis of early fascioliasis using different diagnostic techniques. Journal of the Egyptian Society of Parasitology, 29: ARIAS VÁZQUEZ, M. (2). Estudio de reacciones cruzadas de sueros ovinos con fasciolosis frente a diversos antígenos parasitarios. Memoria de Licenciatura. Facultade de Veterinaria de Lugo. BOYCE, W.M.; BRANSTETTER, B.A. y KAZACOS, K.R. (988). Comparative analysis of larval excretory-secretory antigens of Baylisascaris procyonis, Toxocara canis and Ascaris suum by western blotting and enzyme immunoassay. International Journal of Parasitology, 8 (): 9-3.

5 HILLYER, G.V.; SOLER DE GALANES, M. (988). Identification of a 7-Kilodalton Fasciola hepatica immunodiagnostic antigen by the enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique. Journal of Clinical Microbiology, 26: IBARRA, F.; MONTENEGRO, N.; VERA, Y.; BOULARD, CH.; QUIROZ, H.; FLORES, J. y OCHOA, P. (998). Comparison of three ELISA tests for seropidemiology of bovine fasciolosis. Veterinary Parasitology, 77: KEEGAN, P.S.; TRUDGETT, A. (992). Fasciola hepatica in the rat: immune responses associated with the development of the resistance to infection. Parasite Immunology, 4: KENNEDY, M.W.; QUERESHI, F.; FRASER, E.M.; HASWELL-ELKINS, M.R.; ELKINS, D.B. y SMITH, H.W. (989). Antigenic relationship between the surfaceexposed, secreted and somatic materials of the nematode parasites Ascaris lumbricoides, Ascaris suum and Toxocara canis. Clinical and Experimental Immunology, 75: LOMBA GÓMEZ, C. (2). Reconocimiento de complejos antigénicos de utilidad en el diagnóstico de infecciones parasitarias. Memoria de Licenciatura. Facultade de Veterinaria de Lugo. LOMBA GÓMEZ, C. (25). Caracterización Reconocimiento de complejos antigénicos de utilidad en el diagnóstico de infecciones parasitarias. Memoria de Licenciatura. Facultade de Veterinaria de Lugo. MAJI, B.P.; DWIVEDI, P.; RAO, J.R. y YADAV, S.C. (999). Cross-antigenicity between ruminal and hepatic paramphistomas and liver flukes of buffalo origin. Journal of Applied Animal Research, 6 (): MOUSA, W.M. (2). Evaluation of cercarial antigen for the serodiagnosis of fasciolosis in experimentally and naturally infected sheep. Veterinary Parasitology, 97 (): POITOU, I.; BAEZA, E.; BOULARD, C. (992). Humoral and cellular immune responses in rats during a primary infestation with Fasciola hepatica in the rat. Veterinary Parasitology, 45: ROKNI, M.B.; MASSOUD, J.; HANILO, A. (23). Comparison of adult somatic and cysteine proteinase of Fasciola gigantica in enzyme linked immunosorbent assay for serodiagnosis of human fasciolosis. Acta Tropical, 88 (): ROMASANTA, A.; ROMERO, J.L.; ARIAS, M.; SÁNCHEZ-ANDRADE, R.; LOPEZ, C.; SUÁREZ, J.L.; DÍAZ, P.; DÍEZ-BAÑOS, P.; MORRONDO, P.; PAZ-SILVA, A. (23). Diagnosis of parasite zoonoses by immunoenzymatic assays-analysis of crossreactivity among the excretory-secretory antigens of Fasciola hepatica, Toxocara canis and Ascaris suum. Immunological Investigation, 32 (3): RUÍZ, A.; MOLINA, J.M.; GONZÁLEZ, J.; MARTÍNEZ-MORENO, F.J.; GUTIÉRREZ, P.N.; MARTÍNEZ-MORENO, A. (23). Humoral response (IgG) of goats experimentally infected with Fasciola hepatica against cysteine proteinases of adult fluke. Veterinary Research, 34 (4): SIRISRIRO, A.; GRAMS, R.; VICHASRI-GRAMS, S.; ARDSEUNGNEON, P.; PANKAO, V.; MEEPOOL, A.; CHAITHIRAYANON, K.; VIYANANT, V.; TAN- ARIYA, P.; UPATHAM, E.S.; SOBHON, P. (22). Production and characterization of a monoclonal antibody against recombinant fatty acid binding protein of Fasciola gigantica. Veteriary Parasitology, 5 (2): 9-29.