IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES DE ALERGIA (ALÉRGENOS) Y DE PARÁSITOS (MARCADORES DE PATOGENICIDAD) POR MEDIO DE
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- Rafael Álvarez del Río
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1 IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES DE ALERGIA (ALÉRGENOS) Y DE PARÁSITOS (MARCADORES DE PATOGENICIDAD) POR MEDIO DE rtpcr, EN ALIMENTOS DIRIGIDOS AL CONSUMO HUMANO. Ponente: JORGE MARTÍNEZ QUESADA (jorge.martinez@ehu.eus) IDOIA POSTIGO RESA ESTER SUÑÉN PARDO MARTA GABRIEL DA FONSECA Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia. Laboratorio de Parasitología e Inmunoalergia. Centro Investigación Lascaray. UPV/EHU. CONTROL /EVALUACIÓN DE RIESGOS BIOLÓGICOS/QUÍMICOS
2 ALÉRGENOS. Específicos de fuente alergénica Alt a 1: marcador de severidad de asma/rinitis Asp f 3: marcador de asma/rinitis Asp f 6: marcador de ABPA Ani s 1: marcador de alergia/parasitismo con larvas vivas Ara h 1: marcador de anafilaxia otros Reactividad cruzada nsltp: Marcador de riesgo (anafilaxia, SAO) Profilina: Marcador de SAO PR10: Marcador alergia respiratoria, SAO (polen frutas) Tropomiosina: marcador de reactividad cruzada (ácaros, marisco, insectos) otros
3 PARÁSITOS. Hísticos de difícil diagnostico parasitológico Toxocara canis otros TES-32: Marcador especie/género-específico de diagnóstico y patogenicidad TES-70: Marcador especie/género-específico de diagnóstico y patogenicidad (urticarias) Ambos son alérgenos (que se unen específicamente a IgE)
4 1. Detección de los alérgenos anafilácticos LTP y profilinaen alimentos procesados preparados para el consumo humano mediante rtpcr Diseño de iniciadores específicos. Consenso
5 Diseño de iniciadores específicos Genes que codifican Pru p 3. Consenso secuencias homólogas
6 Diseño de iniciadores específicos Genes que codifican Pru p 4. Consenso secuencias homólogas
7 Resultados. Identificación alérgenos en alimentos preparados para el consumo (yogurt, zumo y preparados para bebés) Prup 3 148pb LTP_FW 5 -CAAGRAC*********-3 LTP_RV 5 -TGGWRG*********-3 Prup pb PROF_FW 5 -CGTSGAY*********-3 PROF_RV 5 -CACC************ pbltp 148 pbltp Los resultados de secuenciación mostraron una identidad >80% con las respectivas secuencias
8 2. Detección del alérgenos contaminantes 2.1. Alta 1 en naranjas (Citrus sinensis) Evolución de la infección de naranjas por Alternaria alternata.
9 Diseño de iniciadores específicos Genes que codifican Alt a 1. Consenso secuencias homólogas
10 Diseño de iniciadores específicos Genes que codifican Alt a 1. Consenso secuencias homólogas
11 Identificación Alt a 1. ELISA vs rtpcr
12 Detección y cuantificación de Alta 1 en naranjas infectadas por A. alternata, mediante ELISA Análisis de la expresión del gen de expresión de Alta 1 por rtpcr M: marcador de PM. Calles 1-20: muestras infectadas con A. alternata. C+: control positivo con A. alternata. C-: cotrol negativo naranja sin infectar. Cesp: control especificidad, P. chrysogenum
13 Identificación de Alt a 1 en frutas destinadas al consumo cultivo rtpcralta 1 positivo negativo TOTAL positivo negativo TOTAL cultivo ELISA Alta 1 positivo negativo TOTAL positivo negativo TOTAL
14 2. Detección del alérgenos contaminantes 2.2. Aspn 3 en el fruto de Mangiferaindica Mangifera indica El mango es cultivado en más de 90 países, la india produce el 83,7% Su popularidad está creciendo en los países desarrollados Alto contenido en azúcares y nutrientes y bajo ph crean las condiciones perfectas para el crecimiento de hongos Fruto muy perecedero y susceptible a infecciones En países desarrollados se pierde el 20-25% de la cosecha tras la recogida Alérgeno Homólogo de Asp f 3 (alérgeno mayor de Aspergillus) Proteína peroxisomal de membrana A. fumigatus: A. niger: 34 alérgenos 10 alérgenos
15 Aspn 3 Diseño de iniciadores específicos. Consenso Especie Acceso GenBank Aspergillus niger XM_ Aspergillus terreus XM_ Aspergillus fumigatus U Aspergillus clavatus XM_ Aspergillus nidulans XM_ Aspergillus flavus XM_ Aspergillus oryzae AB Penicillium chrysogenum XM_ Penicillium citrium AF Trichophyton rubrum XM_ Neurospora crassa XM_
16 Diseño de iniciadores específicos Genes que codifican Asp n 3. Consenso secuencias homólogas Iniciadores de la PCR. Gen de Asp n 3 comparado con el consenso de genes utilizados para la creación de los iniciadores, junto con ambos juegos de iniciadores. Región Nucleótidos Nomenclatura Secuencia amplificada Todo el gen 913 Aspn3FL_FW ATCACCTCATGGCGCCGTGGG Aspn3FL_RV TGTTGTCGTAGCTTCGTAAGCGC Región 171 CRPEROX_FW ACAAGAAGGTYRTYCTCKTCGCC* conservada CRPEROX_RV GTTGGCCTTRSCCCARGCRCT* *K=T+G; S=C+G; R=A+G ;Y=C+T NCBI/ BLAST
17 Evolución de la infección por Aspergillusniger. Fotografías tomadas a los 2, 4, 8 y 14 días de incubación. Valores medios de las áreas de lesión durante los 14 días de incubación en las muestras inoculadas con esporas de Aspergillus niger y en los controles negativos.
18 Asp n 3. Resultados rtpcr en frutas contaminadas Asp n 3: Resultados de la PCR para el gen completo. Asp. Nig. Control positivo. Calles 1 a 14: Muestras de mangos inoculados con esporas de Aspergillus niger. Calles B1 y B2: Muestras de mangos no inoculados con esporas de Aspergillus niger. Asp. Fum: Muestra a partir de cultivo puro de Aspergillus fumigatus. C-: Control negativo de la PCR Asp n 3:ResultadosdelaPCRparalazonaconservadadelgen.. Asp. Nig. Control positivo. Calles 1 a 14: Muestras de mangos inoculados con esporas de Aspergillus niger. Calles B1 y B2: Muestras de mangos no inoculados con esporas de Aspergillus niger. Asp. Fum: Muestra a partir de cultivo puro de Aspergillus fumigatus. C-: Control negativo de la PCR
19 3. Parásitos. Toxocaracanis. Detección de marcadores de alergia/patogenicidad/presencia larvas viables en carne de ovinos Parásito de difícil diagnóstico parasitológico Hospedadores accidentales/ paraténicos (humano y ganado) infectados con larvas L2 Clínica infecciosa y alérgica en el hombre TES-32: molécula específica productos de 3excreción-secreción de larvas L2 útil para el diagnóstico TES-32 lectina C involucrada en la evasión de la respuesta inmune
20 PCR para TES-32 en hígados de oveja 760 pb Hígados de ovejas latxa (zona de Navarra). n= 15 hígados de ovejas 3 hígados positivos mediante rtpcr Hígados de corderos estabulados (supermercado). n= 14 hígados de corderos 0 hígados positivos mediante rtpcr Rassier et al. 2013, confirma a los rumiantes como parte del ciclo de T. canis y evidencia el riesgo de transmisión de toxocarosis (1 de cada 4 ovejas positiva a Toxocara por ELISA. Serología) Won et al. 2015, asocia el principal riesgo de padecer toxocarosis con el consumo de carne cruda o poco cocinada de hígado de vaca 1. Marcador 2. Control positivo (plásmido con cdna TES-32) 3. cdna hígado 1 + plásmido con CDNA TES cdna hígado 1 5. cdna hígado 2 + plásmido con cdna TES-32) 6. cdna hígado 2 7. cdna hígado 3 + plásmido con cdna TES-32) 8. cdna hígado 3 9. Control negativo
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