M508 MERCIA TOXOPLASMA G

Transcripción

1 REF M508 MERCIA TOXOPLASMA G 96 IVD 0088 INTENDED USE Mercia Toxoplasma G is an enzyme immunoassay (EIA) for the detection and semi-quantification of IgG antibodies to Toxoplasma gondii in human serum or plasma samples. The assay is intended for professional use only BUF WASH 40x Wash Buffer. 40 x concentrate. M508e 50mL PRINCIPLE OF THE TEST CONJ M508f 14mL The test employs polystyrene microwells coated with Toxoplasma antigen. Sample diluent is added to the wells followed by serum or plasma specimens. During the first incubation, any specific anti- Toxoplasma antibodies present in the specimen will bind to the Toxoplasma antigen on the plate. Unbound components are removed by a wash step. During the second incubation, immobilised anti-toxoplasma IgG antibodies are specifically detected by binding horseradish peroxidase (HRP) labelled monoclonal anti-human IgG. After washing away any unbound conjugate, the presence of attached enzyme is shown using the substrate TMB/peroxide to produce a coloured product. The intensity of the colour is proportional to the amount of Toxoplasma IgG antibody present in the original sample. The reaction is stopped by the addition of acid and the results read photometrically at 450nm with a nm reference filter. The Mercia Toxoplasma-G assay has been standardised against the WHO 3 rd International Standard for anti-toxoplasma serum, human (TOXM) with a cut-off calibrator set at 12 International Units (IU) per ml. Toxoplasma G Conjugate (Green fluid). Murine monoclonal antihuman IgG HRP. Preserved with non-mercury based preservative. SUBS M508g Substrate (TMB/peroxide). (Brown bottle, pink fluid) SOLN M508h Stop Solution. 0.5M sulphuric acid DIL TMB STOP SAMP M508k 14mL 14mL 50mL Sample Diluent (Purple fluid). Preserved with 0.02% Bronidox. CONTROL M508m 130µL CONT MT PLATE KIT PRESENTATION M508a 1x96 well Semi-quantification Control (Purple Cap). Sample containing IU/mL of anti-toxoplasma IgG. Preserved with 0.099% sodium azide. Instructions for Use Toxoplasma G Microwell Plate: 12 x 8 microwell strips coated with Toxoplasma antigen, sealed in a foil pouch with desiccant. CAL 500 M508b 130µL Toxoplasma G Positive Calibrator (Red Cap). Serum containing 500 IU/mL of anti-toxoplasma IgG. Preserved with 0.099% sodium azide. CAL 12 M508c 130µL Toxoplasma G Cut-off Calibrator (Yellow Cap). Serum containing 12IU/mL of anti-toxoplasma IgG. Preserved with 0.099% sodium azide. Resealable bags Materials and Equipment required but not provided Calibrated pipettes with disposable tips 37 C incubator (± 1 C) Automatic plate washer (see Procedural Note 12 for washing specifications) Microplate reader with dual wavelength capability (450nm and nm) Timer Microplate shaker (optional) Appropriate personal protective equipment Mercia EIA Data Calculator M500 (optional) CONTROL - M508d 130µL Toxoplasma G Negative Control (Blue Cap). Serum containing <90% of anti-toxoplasma IgG present in the cut-off. Preserved with 0.099% sodium azide.

2 WARNINGS AND PRECAUTIONS Safety 1. This kit is for in vitro diagnostic use only. 2. All patients samples and kit calibrators/controls should be treated as potentially infectious. The materials from which the kit calibrator/control sera were derived were negative for antibodies to HIV-1 and HIV-2, HBsAg and HCV when tested using validated laboratory tests. However no test methods can offer complete assurance that products derived from human blood will not transmit infectious agents. 3. Waste fluids in the washer reservoir and other waste materials should be decontaminated before discarding. This can be achieved with sodium hypochlorite at a final concentration of 3% for 30 minutes. Liquid waste containing acid must be neutralised before treatment. 4. Although the Toxoplasma antigen has been inactivated during the production process, the microwell strips should be handled as though potentially infectious. 5. Avoid contact of reagents with skin or mucous membranes. If this happens, wash immediately with copious amounts of water. 6. Some kit components contain sodium azide as preservative which may react with lead or copper plumbing to form explosive metal azides. Dispose by flushing with a large volume of water to prevent azide build-up. 7. Do not pipette by mouth. Procedural 1. The kit should be used in accordance with these Instructions for Use. 2. Use within expiry date marked on the kit. Do not use microwell strips if desiccant sachet has turned pink. 3. Ensure that all reagents have reached room temperature before use. 4. Do not mix reagents from different batches. 5. Use fresh pipette tips when drawing from different reagent vials or bottles to avoid cross-contamination. 6. Always keep the upper surface of the microwell strips free from excess fluid droplets. 7. Do not allow the microwell to dry out during any stage of the assay. 8. All pipetting devices (manual or automatic) should be regularly calibrated according to the manufacturer s instructions. 9. High ambient temperatures (>25 C) in conjunction with a prolonged interval between sample addition and the first 37 C incubation can lead to amplified optical densities (see also procedural note 10 below). 10. Dispense samples into wells before the kit calibrators and controls, which should be added last. Mix samples in diluent thoroughly. When more than 20 specimens are to be tested on one plate, rapid transfer to the Mercia Toxoplasma G microwells should be facilitated by first pipetting approximately 50µL of each sample into the wells of an empty, uncoated microwell plate. 10µL of each specimen may then be rapidly transferred to the Mercia Toxoplasma G microwells using a multichannel pipette. 11. Addition of serum or plasma to the Mercia Toxoplasma G sample diluent causes a colour change from purple to blue confirming that samples have been added. The colour change can be monitored: a) Visually. Check by eye that each well has changed from purple to blue confirming that all samples have been added. b) By absorbance values. For each plate reader in use, the Sample Addition Verification (SAV) value must be determined: i) Add 200µL Mercia TOXOPLASMA G Sample Diluent to each well required for the assay. ii) Read the absorbance values at nm and iii) calculate the mean SAV value = Mean Absorbance ( nm) x 1.4 Once determined, the SAV value can be used for all Mercia IgG assays providing the same plate reader is used. For routine use of the SAV value, read the absorbance ( nm) of each well containing sample plus Sample Diluent. Any values below the SAV value indicate that the possibility of sample omission must be investigated. Limitations Mercia Toxoplasma G Sample Diluent cannot be used to determine accuracy of sample addition. The Sample Diluent may fail to confirm sample addition with samples containing abnormal protein levels. 12. Rinse cycle Efficient rinsing to remove unbound sample components and kit reagents is essential for optimum results. Automatic plate washers should meet the following criteria. All wells are completely aspirated. Microwells are filled to 350µL during the rinse cycle. Wash buffer is dispensed at a rapid flow rate. For each rinse cycle, the machine should be set to five washes. On completion of the cycle, ensure that all wash buffer has been completely removed from the wells. 13. Mercia Toxoplasma G may be used with a variety of automatic/semi-automatic processors/liquid handling systems. However, it is essential that such equipment is validated by the user prior to routine use by demonstrating that the results obtained using the instrument are equivalent to those obtained with the same samples using the manual test method. The instrument should be periodically revalidated. STORAGE AND SHELF LIFE Kit components: Store at 2-8 C and do not use beyond the expiration date on the label. The working strength wash buffer can be stored for one week at room temperature, or for four weeks at 2-8 C. Unused microwell strips should be stored with the desiccant sachet in the foil pouch securely resealed with tape. If stored in this way, microwell strips will remain useable for 6 months after opening providing that the desiccant sachet has not turned pink. Specimens: The performance of this product has been validated by the manufacturer for use with serum or plasma (heparin/edta anticoagulants) samples. Samples may be stored at 2-8 C for up to 7 days. For longer storage periods, specimens should be frozen at - 20 C or below. All specimens should be mixed thoroughly before testing, especially if they have been frozen. Haemolysed, lipaemic or contaminated samples may give erroneous results. REAGENT PREPARATION Wash Buffer Dilute the Wash Buffer concentrate with distilled or deionised water, 1 part buffer + 39 parts water. Each strip requires approximately 150mL of working strength wash buffer. All other reagents are supplied at working strength. TEST PROCEDURE 1. Allow all reagents to reach room temperature (18-25 C). 2. The calibrators and controls are supplied as serum equivalents and should follow exactly the same procedure as the test specimens. Test specimens should be loaded on to the plate before calibrators and controls. 3. Select sufficient microwell strips to accommodate test specimens, calibrators and controls. Unused strips should be removed from the frame and stored as directed in the Storage and Stability section. The kit calibrators (Positive, Cut-off and Negative) should be included on each microwell plate. The Cutoff calibrator should always be tested in duplicate. The Positive calibrator should be tested in duplicate if semi-quantitative results are required. 4. Dispense 200µL Sample Diluent (purple fluid) into each well. 5. Dispense 10µL of patient sample into the appropriate wells i.e. BEFORE the calibrators and controls. 6. Dispense 10µL Positive Calibrator (Red Cap) into one or two wells (see 3 above), 10µL Cut-off Calibrator (Yellow Cap) into each of two wells and 10µL Negative Control (Blue Cap) into one well. The optional Semi-quantification Control (40-110IU/mL, Purple Cap) can be added to the set of calibrators and control at this point. 7. MIX WELL to ensure complete dispersion of the sample in the diluent. This can be achieved by placing the plate on a plate shaker for 30 seconds. All wells should change colour from purple to blue indicating that all samples and calibrators have been added. When using an automated system, the

3 sample and diluent can be mixed in probe by pulling up and dispensing 150µL of the mixture. 8. Place the microwell frame into a resealable plastic bag and incubate at 37(±1) C for 30 (±2) minutes. Alternatively, if using an automatic EIA analyser, place the frame into the instrument as directed by the Users Manual. 9. Wash the microwell plate (see Rinse Cycle - Procedural Notes 10. Immediately dispense 100µL Conjugate (green fluid) into each well. When performing the test manually, it is recommended that a multichannel pipette is used for this step. Mix by gently tapping, or on a microwell plate shaker for seconds. 11. Place the microwell frame into a resealable plastic bag and incubate at 37(±1) C for 30 (±2) minutes. Alternatively, if using an automatic EIA analyser, place the frame into the instrument as directed by the Users Manual. 12. Wash the microwell plate (see Rinse Cycle - Procedural Notes 13. Immediately dispense 100µL Substrate (pink fluid) into each well. When performing the test manually, it is recommended that a multichannel pipette is used for this step. Mix by gently tapping, or on a microwell plate shaker for seconds. 14. Incubate at room temperature (18-25 C) for 30 (±2) minutes, protected from direct sunlight. 15. Add 100µL Stop Solution to each well to stop the reaction. Mix by gentle tapping, or on a microwell plate shaker for seconds. Positive samples (blue colour) will change to a uniform yellow on adding Stop Solution. Ensure that the undersides of the wells are dry and that there are no air bubbles in the well contents. 16. Within 30 minutes of stopping, read the absorbance values at 450nm with nm reference filter using a microwell plate reader blanked on air. INTERPRETATION Calculations Calculate the Cut-off value (mean absorbance of the duplicate Cut-off Calibrator wells). Assay validation The assay should be considered valid if: Negative control absorbance < Positive calibrator absorbance The mean Cut-off calibrator absorbance 2 x Negative control absorbance AND Analysis Specimen absorbance values within 10% above or below the Cut-off value should be considered equivocal results. Equivocal samples should be retested in duplicate and by alternative methods. If the result is still equivocal, a fresh sample should be taken from the patient after approximately two weeks and tested. A specimen may be considered reactive for IgG antibodies to Toxoplasma if it gives an absorbance value greater than the Cut-off value and outside the equivocal range. A specimen may be considered non-reactive for IgG antibodies to Toxoplasma if it gives an absorbance value lower than the Cut-off value and outside the equivocal range. Semi-quantification The relative concentration of specific anti-toxoplasma IgG antibody present in the original patient's sample can be estimated using the following calculation. Using the average of the two cut-off calibrator wells as 12IU/mL and the average of the two positive calibrator wells as 500IU/mL, a smoothing spline curve may be drawn which follows the equation: y = mx n Where: y = A450/650nm of the sample x = Sample antibody concentration in IU/mL m = Constant (1) n = Constant (2) patient's samples can be fed into the equation to calculate the approximate concentration of anti-toxoplasma IgG in IU/mL. This can be performed using a computer spreadsheet programme such as Microsoft Excel. Alternatively, Microgen Bioproducts has produced a computer software programme (M500 - available on floppy disc) which will automatically construct the calibration line and calculate the relative concentration in IU/mL of test samples. If the semi-quantification control (M508m) is used, calculate the concentration in IU/mL of the control from the absorbance value. If this falls outside the range IU/mL, the assay should be considered invalid and repeated. LIMITATIONS OF USE 1. Results from the Mercia Toxoplasma G test should not be used in isolation but interpreted by the clinician in the context of all available clinical and laboratory information. 2. A Mercia Toxoplasma G non-reactive result does not preclude the possibility of a very recent infection (within the previous 8 weeks) with Toxoplasma. 3. Babies born to Toxoplasma positive mothers will have maternally-derived circulating Toxoplasma IgG. Toxoplasma IgG in infants less than 10 months old should not therefore be considered indicative of congenital infection. Infants suspected of having congenital Toxoplasma infection should be tested for IgM class antibody. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Mercia Toxoplasma G has been evaluated at Microgen Bioproducts and at two leading microbiology laboratories in the United Kingdom. Study clinical specimens (sera and plasma) were tested at Microgen Bioproducts by Mercia Toxoplasma G in comparison with a wellestablished commercially available EIA for toxoplasma IgG. Any discrepant or equivocal specimens were retested in both assays. Positive Negative Total Commercial Positive 154 1* 155 Assay Negative 1** Total Study 2 Sensitivity 99.4% Specificity 99.4% Diagnostic efficiency 99.4% *1 borderline specimen equivocal/weak positive in commercial assay, weak positive in Dye Test ( Gold Standard reference method) and high negative in Mercia. **1 specimen equivocal/weak positive in Mercia. 88 clinical samples were tested with Mercia Toxoplasma G at a UK Toxoplasma reference laboratory and the results compared with those obtained using the Gold Standard Dye Test. Dye Test Positive Negative Total Positive Negative Total Sensitivity 100% Specificity 100% Diagnostic efficiency 100% + 1 specimen gave an equivocal result in Mercia. For each assay run, constants 1 and 2 can be derived using the mean absorbance values for the positive and cut-off calibrators. Once these constants have been established, absorbances of individual

4 Study 3 86 clinical specimens were tested at a UK Regional Virus Laboratory using Mercia Toxoplasma G and a combination of another commercially available EIA and the reference Dye Test. CONT PRESENTACIÓN DEL KIT Positive Negative Total Reference Positive assays Negative Total Sensitivity 100% Specificity 98.5% Diagnostic efficiency 98.8% ++ 3 specimens were equivocal in Dye Test (1 was equivocal in Mercia). REPRODUCIBILITY Intra-assay reproducibility (repeatability) - This was evaluated by testing multiple replicates of positive and cut-off calibrators using 3 batches of kits. The intra-assay coefficient of variation for the positive calibrator was % and, for the cut-off calibrator, % in the three batches of product. Inter-assay reproducibility - This was established by testing multiple replicates of positive and cut-off calibrators on three separate occasions and calculating the overall coefficient of variation. This evaluation was carried out using three batches of kits. Inter-assay CV's were % for the positive calibrator and % for the cut-off calibrator. MT PLATE M508a 1 x 96 pocillos Placa de micropocillos de Toxoplasma G: 12 x 8 micropocillos revestidos con anfígeno de Toxoplasma, sellados herméticamente en una bolsa de papel aluminio con desecante. CAL 500 M508b 130 µl Calibrador positivo Toxoplasma G (tapón rojo) Suero con un contenido de 500 UI/ml de IgG anti-toxoplasma Conservado con azida sódica al 0,099%. CAL 12 M508c 130 µl Calibrador de corte Toxoplasma G (tapón amarillo) Suero con un contenido de 12 UI/ml de IgG anti-toxoplasma Conservado con azida sódica al 0,099%. CONTROL - M508d 130 µl Control negativo Toxoplasma G (tapón azul) Suero con un contenido de < 90% de IgG anti-toxoplasma presente en el corte. Conservado con azida sódica al 0,099%. BUF WASH 40x M508e 50 ml E Tampón de lavado. Concentrado a 40 x. CONJ M508f 14 ml INDICACIONES DE USO Mercia Toxoplasma G es un enzimoinmunoanálisis (EIA) para la detección y la determinación semicuantitativa de anticuerpos IgG dirigidos contra el Toxoplasma gondii en muestras de plasma o suero humano. Kit para uso únicamente por profesionales. PRINCIPIO DEL ENSAYO El ensayo emplea micropocillos de poliestireno revestidos de anfígeno de Toxoplasma. Se coloca diluyente de la muestra en los pocillos; a continuación, se añaden muestras de suero o plasma. Durante la primera incubación, los anticuerpos específicos anti- Toxoplasma presentes en la muestra se unirán a los anfígenos de Toxoplasma de la placa. Los componentes que no se unen se eliminan mediante un lavado. Durante la segunda incubación, los anticuerpos inmovilizados tipo IgG anti-toxoplasma son detectados específicamente mediante la unión con anticuerpos anti-igg humana marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de lavar los conjugados no unidos, se demuestra la presencia de enzima ligada con el sustrato TMB / peróxido, para obtener un producto coloreado. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgG anti-toxoplasma presentes en la muestra original. La reacción se detiene al añadir ácido y el resultado se mide mediante fotometría a 450 nm, con un filtro de referencia de nm. El ensayo Mercia Toxoplasma-G se ha normalizado contra la 3ª Norma Internacional de la OMS para suero humano anti-toxoplasma (TOXM), con un punto de corte establecido en 12 unidades internacionales (UI) por ml. Conjugado Toxoplasma G (líquido verde). Conjugado de anticuerpo monoclonal murino anti-igg humana y HRP. Contiene conservante no basado en mercurio. SUBS M508g 14 ml Sustrato (TMB / peróxido). (frasco marrón, líquido rosado). SOLN M508h Solución de paro. Ácido sulfúrico 0,5 M DIL TMB STOP SAMP M508k 14 ml 50 ml Diluyente de la muestra (líquido morado). Conservado con Bronidox al 0,02%. CONTROL M508m 130 µl Control de determinación semicuantitativa (tapón morado). Suero con un contenido de UI/ml de IgG anti-toxoplasma Conservado con azida sódica al 0,099%. Instrucciones de uso Bolsas resellables

5 Materiales y equipo necesarios pero que no se suministran Pipeta calibradas y con puntas desechables Incubador a 37 (± 1ºC) Lavadora automática de placas (consultar las instrucciones de lavado en la Nota de procedimiento Lector de microplacas con capacidad de doble longitud de onda (450 y nm) Temporizador Agitador de microplacas (opcional) Equipo adecuado de protección personal Calculadora de datos de EIA M500 de Mercia (opcional) ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Seguridad 1. Este kit es sólo para uso diagnóstico in vitro. 2. Todas las muestras de los pacientes, así como los calibradores y los controles del kit, deberán tratarse como si fueran potencialmente infecciosos. Los materiales a partir de los cuales se han obtenido los sueros de los calibradores y de los controles del kit dieron un resultado negativos a los anticuerpos contra el VIH-1, VIH-2, HBsAg y VHC al ser analizados con pruebas de laboratorio validadas. Sin embargo, ningún método de análisis conocido puede ofrecer la seguridad completa de que los productos obtenidos a partir de sangre humana no transmitan agentes infecciosos. 3. Los líquidos de desecho del depósito de la lavadora y otros materiales de desecho deberán descontaminarse antes de su eliminación. Ello puede realizarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 3%, durante 30 minutos. Los desechos líquidos que contienen ácidos deben neutralizarse antes de su tratamiento. 4. Aunque los antígenos de Toxoplasma se han desactivado durante el proceso de producción, las tiras de micropocillos deberán manipularse como si fueran potencialmente infecciosas. 5. Evítese el contacto de los reactivos con la piel o con las membranas mucosas. Si ello ocurriera, lavar inmediatamente con abundante agua. 6. Algunos componentes del kit contienen azida sódica como conservante, que puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías, para formar azidas metálicas que son potencialmente explosivas.. Debe desecharse lavando con abundante agua para evitar la acumulación de azidas. 7. No pipetear las soluciones con la boca. Notas referentes al procedimiento 1. El kit deberá utilizarse de conformidad con estas instrucciones de uso. 2. Usar antes de la fecha de caducidad marcada en el kit. No usar las tiras de micropocillos si el sobre del desecante ha adquirido un color rosado. 3. Asegurarse de que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiental antes de su uso. 4. No mezclar reactivos de lotes diferentes. 5. Al aspirar viales o frascos de reactivos diferentes, deben utilizarse puntas de pipetas nuevas, para evitar la contaminación cruzada. 6. Manténgase siempre la superficie superior de las tiras de micropocillos sin una cantidad excesiva de gotitas de líquido. 7. No debe permitirse que los micropocillos se sequen en ninguna fase del análisis. 8. Todos los dispositivos para pipetear (manual o automático) deberán calibrarse periódicamente de conformidad con las instrucciones del fabricante. 9. Las temperaturas ambientales altas (> 25 ºC), además de un período prolongado entre la adición de la muestra y la primera incubación a 37 ºC, pueden producir una amplificación de las densidades ópticas (véase también la nota 10, más adelante). 10. Dispensar las muestras en los pocillos antes de los calibradores y los controles del kit, que deberán añadirse al final. Mezclar a conciencia las muestras en diluyente. Si se van a analizar más de 20 muestras en una placa, deberá facilitarse una transferencia rápida a los micropocillos Mercia Toxoplasma G pipeteando primero aproximadamente 50 µl de cada muestra en los pocillos de una placa de micropocillos vacía y sin revestimiento. A continuación, se pueden transferir rápidamente 10 µl de cada muestra a los micropocillos Mercia Toxoplasma G, con una pipeta multicanal. 11. La adición de suero o plasma al diluyente de la muestra Mercia Toxoplasma G produce un cambio de color del morado al azul, lo que confirma que se han añadido muestras. El cambio de color se puede vigilar de las siguientes maneras: a) Visualmente. Comprobar a simple vista que cada pocillo haya cambiado del morado al azul, lo que confirma que se han añadido todas las muestras. b) Por los valores de absorbancia. Debe determinarse el valor de verificación de adición de la muestra (SAV) de cada lector de placas en uso. i) Añadir a cada pocillo requerido para el análisis 200 µl de diluyente de la muestra Mercia Toxoplasma G. ii) Leer los valores de absorbancia a nm y iii) calcular la media. Valor SAV = absorbancia media ( nm) x 1,4 Una vez determinado el valor SAV, se puede utilizar para todos los ensayos Mercia IgG, siempre que se utilice el mismo lector de placas. Para el uso sistemático del valor SAV, leer la absorbancia ( nm) de cada pocillo que contiene muestra más diluyente de la muestra. Todo valor inferior al valor SAV indica que debe investigarse la posibilidad de omisión de las muestras. Limitaciones. El diluyente de la muestra Mercia Toxoplasma G no puede empelarse para determinar la exactitud de la adición de la muestra. Es posible que el diluyente de la muestra no consiga confirmar la adición de las muestras si éstas contienen unas cantidades anormales de proteínas. 12. Ciclo de enjuague. Para obtener unos resultados óptimos, es fundamental un enjuague eficaz a fin de eliminar los componentes de la muestra y los reactivos del kit que no están ligados. Las lavadoras automáticas de placas deben cumplir los siguientes requisitos: Todos los pocillos se aspiran completamente. Los micropocillos se llenan hasta 350 µl durante el ciclo de enjuague. El tampón de lavado se dispensa a una velocidad de flujo rápida. Por cada ciclo de lavado, la máquina debe ajustarse a cinco lavados. Al finalizar el ciclo, asegurarse de que todo el tampón de lavado se haya eliminado completamente de los pocillos. 13. Mercia Toxoplasma G puede emplearse con una variedad de sistemas automáticos y semiautomáticos de procesadores y manipulación de líquidos. Sin embargo, es fundamental que estos equipos sean validados por el usuario antes de su uso sistemático mediante la demostración de que los resultados obtenidos con el instrumento sean equivalentes a los obtenidos con las mismas muestras usando el método de análisis manual. El instrumento deberá revalidarse periódicamente. ALMACENAMIENTO Y VIDA ÚTIL Componentes del kit: Conservar sin abrir entre 2-8 C. No utilizar después de la fecha de caducidad. El tampón de lavado de potencia de trabajo puede conservarse durante una semana a temperatura ambiente o durante cuatro semanas a 2 a 8 ºC. Las tiras de pocillos sin usar deberán conservarse con el sobre de desecante en la bolsa de papel aluminio, bien cerrada herméticamente con cinta adhesiva. Si se conservan de esta manera, las tiras de micropocillos podrán utilizarse durante seis meses después de abrir el envase, siempre que el sobre del desecante no adquiera un color rosado. Muestras: El rendimiento de este producto ha sido validado por el fabricante para su uso con muestras de suero o plasma (con anticoagulantes de heparina o EDTA). Las muestras pueden almacenarse a 2 a 8 ºC, durante un período de hasta 7 días. Si se requiere un período de conservación más prolongado, las muestras deberán congelarse a una temperatura de 20 ºC o menos. Las muestras deberán

6 mezclarse a conciencia antes de su análisis, especialmente si se han congelado. Las muestras bemolizadas, lipémicas o contaminadas pueden dar resultados erróneos. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Tampón de lavado. Diluir el concentrado de tampón de lavado con agua destilada o desionizada, 1 parte de tampón + 39 partes de agua. Cada tira requiere aproximadamente 150 ml de tampón de lavado de potencia de trabajo. Todos los demás reactivos se suministran a potencia de trabajo. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA 1. Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiental (18 a 25 ºC). 2. Los calibradores y los controles se suministran como equivalentes del suero y deberá seguirse exactamente el mismo procedimiento que con las muestras de análisis. Las muestras del análisis deberán cargarse en la placa antes que los calibradores y los controles. 3. Seleccionar una cantidad suficiente de tiras de micropocillos para las muestras, calibradores y controles del análisis. Las tiras sin usar deberán extraerse del bastidor y almacenarse tal como se indica en el apartado Almacenamiento y estabilidad. Los calibradores del kit (positivo, de corte y negativo) deberán incluirse en cada placa de micropocillos. El calibrador de corte deberá analizarse siempre por duplicado. El calibrador positivo deberá analizarse por duplicado si se requieren resultados semicuantitativos. 4. Dispensar en cada pocillo 200 µl de diluyente de la muestra (líquido morado). 5. Dispensar en los pocillos correctos 10 µl de muestra del paciente, es decir, ANTES de los calibradores y los controles. 6. Dispensar 10 µl de calibrador positivo (tapón rojo) en uno o dos pocillos (ver el paso 3), 10 µl de calibrador de corte (tapón amarillo) en cada uno de dos pocillos y 10 µl de control negativo (tapón azul) en un pocillo. En este momento, se puede añadir el control opcional de determinación semicuantitativa ( UI/ml, tapón morado) al conjunto de calibradores y controles. 7. MEZCLAR BIEN para asegurar la dispersión completa de la muestra en el diluyente. Esto se puede lograr colocando la placa en un agitador de placas durante 30 segundos. Todos los pocillos deberán cambiar de color, del morado al azul, lo que indica que todas las muestras y calibradores se han añadido. Si se usa un sistema automático, la muestra y el diluyente se pueden mezclar en la sonda mediante la aspiración y dispensación de 150 µl de la mezcla. 8. Colocar el bastidor de micropocillos en una bolsa de plástico resellable e incubar a 37 (± 1) ºC durante 30 (± 2) minutos. O bien, su se usa un analizador de EIA automático, colocar el bastidor en el instrumento, tal como se indica en el manual del usuario. 9. Lavar la placa de micropocillos (ver el ciclo de enjuague, nota nº 10. Inmediatamente, dispensar en cada pocillo 100 µl de conjugado (líquido verde). Si se realiza el análisis manualmente, se recomienda el uso de una pipeta multicanal en este paso. Mezclar con la aplicación de golpes suaves o en un agitador de placas de micropocillos durante 10 a 20 segundos. 11. Colocar el bastidor de micropocillos en una bolsa de plástico resellable e incubar a 37 (± 1) ºC durante 30 (± 2) minutos. O bien, su se usa un analizador de EIA automático, colocar el bastidor en el instrumento, tal como se indica en el manual del usuario. 12. Lavar la placa de micropocillos (ver el ciclo de enjuague, nota nº 13. Inmediatamente, dispensar en cada pocillo 100 µl de sustrato (líquido rosado). Si se realiza el análisis manualmente, se recomienda el uso de una pipeta multicanal en este paso. Mezclar con la aplicación de golpes suaves o en un agitador de placas de micropocillos durante 10 a 20 segundos. 14. Incubar a temperatura ambiente (18 a 25 ºC) durante 30 (±2 minutos), protegido de la luz directa del sol. 15. Añadir 100 µl de solución de paro a cada pocillo para detener la reacción. Mezclar con la aplicación de golpes suaves o en un agitador de placas de micropocillos durante 10 a 20 segundos. Las muestras positivas (color azul) cambiarán a un amarillo uniforme al añadir la solución de paro. Asegurarse de que las caras inferiores de los pocillos estén secas y de que no haya burbujas de aire en el contenido de los pocillos. 16. Después de 30 minutos de parada, leer los valores de absorbancia a 450 nm con un filtro de referencia de nm, con un lector de placas de micropocillos blanqueado en aire. INTERPRETACIÓN Cálculos Calcular el valor de corte (absorbancia media de los pocillos duplicados de calibrador de corte). Validación del análisis El análisis deberá considerarse válido si: La absorbancia del control negativo es < 0,125. La absorbancia del calibrador positivo es 0,800. La absorbancia del calibrador de corte es 2 x absorbancia del control negativo Y 0,150. Análisis Los valores de absorbancia de la muestra dentro de un 10% encima o debajo de los valores de corte deberán considerarse unos resultados equívocos. Las muestras equívocas deberán volver a analizarse por duplicado y mediante un método diferente. Si el resultado continúa siendo equívoco, deberá obtenerse una nueva muestra del paciente después de aproximadamente dos semanas, para su análisis. Una muestra puede considerarse reactiva para los anticuerpos IgG contra Toxoplasma si el valor de absorbancia obtenido es superior al valor de corte y fuera de los límites equívocos. Una muestra puede considerarse no reactiva para los anticuerpos IgG contra Toxoplasma si el valor de absorbancia obtenido es inferior al valor de corte y fuera de los límites equívocos. Determinación semicuantitativa La concentración relativa de anticuerpo específico anti-toxoplasma presente en la muestra original del paciente se puede calcular mediante la siguiente fórmula. Con el uso del promedio de los dos pocillos de calibrador de corte a 12 UI/ml y el promedio de los dos pocillos de calibrador positivo como 500 UI/ml, puede trazarse una curva Spline de suavizado a continuación de la ecuación: y = mx n Donde: y = A450/650 nm de la muestra x = Concentración de anticuerpo en la muestra, en UI/ ml m = Constante (1) n = Constante (2) Por cada ejecución del análisis, las constantes 1 y 2 pueden obtenerse a partir de los valores de absorbancia media de los calibradores positivo y de corte. Una vez establecidas estas constantes, se pueden incorporar en la ecuación las absorbancias de las muestras de un paciente determinado para calcular la concentración aproximada de IgG anti-toxoplasma en UI/ml. Esto se puede hacer con un programa informático de hoja de cálculo tal como Microsoft Excel. O bien, Microgen Bioproducts ha elaborado un programa de software informático (M500, disponible en disquetes), que trazará automáticamente la recta de calibración y calculará la concentración relativa de las muestras de análisis en UI/ml. Si se utiliza el control de la determinación semicuantitativa (M508m), calcular la concentración en UI/ml del control a partir del valor de absorbancia. Si esta concentración está fuera de los límites de 40 a 110 UI/ml, la prueba deberá considerarse no válida y deberá repetirse.

7 LIMITACIONES DEL USO 1. Los resultados del análisis Mercia Toxoplasma G no deberán aplicarse aisladamente; el clínico deberá interpretarlos en el contexto de toda la información clínica y de laboratorio disponible. 2. Un resultado no reactivo del análisis Mercia Toxoplasma G no excluye la posibilidad de una infección muy reciente (dentro de las ocho semanas anteriores) por Toxoplasma. 3. Los niños nacidos de madres positivas para Toxoplasma tendrán anticuerpos IgG contra Toxoplasma circulantes, derivados de la madre. Por lo tanto, los anticuerpos IgG contra Toxoplasma presentes en los niños menores de 10 meses no deberá considerarse una indicación de infección congénita. En los niños con sospecha de padecer una infección congénita por Toxoplasma deberán hacerse análisis de anticuerpos de clase IgM. Estudio 3 Se analizaron 86 muestras clínicas en un Laboratorio regional de virus del Reino Unido con Mercia Toxoplasma G y una combinación de EIA comercial y la prueba del colorante de referencia. Positivos Negativos Total Análisis de Positivos referencia Negativos Total Sensibilidad 100% Especificidad 98.5% Eficacia diagnóstica 98.8% ++ Tres muestras fueron resultados equívocos con la prueba del colorante (una fue equívoca con Mercia). REPRODUCIBILIDAD CARACTERÍSTICAS DE LA EJECUCIÓN Mercia Toxoplasma G ha sido evaluado en Microgen Bioproducts y en dos principales laboratorios de microbiología del Reino Unido. Estudio 1 Se analizaron 311 muestras clínicas (de suero y plasma) en Microgen Bioproducts mediante Mercia Toxoplasma G, en comparación con un EIA comercializado y bien establecido, para anticuerpos IgG contra Toxoplasma. Todas las muestras discrepantes o equívocas fueron analizadas nuevamente en ambos análisis. Reproducibilidad intraanálisis (repetibilidad). Se evaluó mediante el examen de varias repeticiones de calibradores positivo y de corte, con los tres lotes de kits. El coeficiente de variación intraanálisis del calibrador positivo fue del 1,6 al 3,6%; el del calibrador de corte, fue del 1,5 al 6,3% en los tres lotes de producto. Reproducibilidad entre análisis. Se estableció mediante el análisis de varias repeticiones de calibradores positivo y de corte, en tres ocasiones distintas y con el cálculo del coeficiente total de variación. Esta evaluación se realizó con tres lotes de kits. Los coeficientes de variación entre análisis fueron del 6,1 al 9,7% con el calibrador positivo, y del 10,9 al 12,7% con el calibrador de corte. Positivos Negativos Total Análisis Positivos 154 1* 155 comercial Negativos 1** Total Estudio 2 Sensibilidad 99.4% Especificidad 99.4% Eficacia diagnóstica 99.4% * Una muestra limítrofe equívoca / débilmente positiva con el análisis comercial, débilmente positiva con la prueba del colorante ( método de referencia ) y altamente negativo con Mercia. **Una muestra equívoca / débilmente positiva con Mercia. Se analizaron 88 muestras clínicas con Mercia Toxoplasma G en un laboratorio de referencia de Toxoplasma del Reino Unido y los resultados se compararon con los obtenidos con la prueba del colorante considerada como método de referencia. Positivos Negativos Total Prueba del Positivos colorante Negativos Total Microgen Bioproducts Ltd 1, Admiralty way Camberley Surrey, GU15 3DT, UK Sensibilidad 100% Especificidad 100% Eficacia diagnóstica 100% + Una muestra dio un resultado equívoco con Mercia. WF6406/2003/06