ABX Pentra. HbA1c WB. Reactivo para la determinación cuantitativa in-vitro de la hemoglobina A1c (HbA1c). A11A01702
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- Alejandra Roldán Romero
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1 (Hemolizado) Ref. : A11A01702 Volumen R1 : Volumen R2 : Volumen R3 : 1 x 110 ml Volumen R4 : 2 x 21 ml Volumen R5 : 1 x 25 ml ABX Pentra Hemolizado Reactivo para la determinación cuantitativa in-vitro de la hemoglobina A1c (HbA1c). 2006/12/06 A93A01052J ES A11A01702 Interés clínico (1,7) La HbA1c resulta de la fijación no enzimática del fragmento N-terminal de la cadena β de la hemoglobina A0. La tasa de HbA1c, proporcional a la tasa de glucosa en sangre, refleja la concentración media cotidiana de glucosa durante los dos meses previos a la extracción. Estudios recientes han demostrado que la determinación cuantitativa regular de la HbA1c puede conducir a modificaciones en el tratamiento de la diabetes y un mejor control metabólico como indica una disminución de los valores de HbA1c. Este método de diagnóstico in vitro se utiliza para la medida cuantitativa de la hemoglobina A1c (HbA1c), indicador de la diabetes, en la sangre humana. Las medidas obtenidas con este procedimiento se pueden utilizar para el seguimiento a largo plazo de las personas diabéticas. 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml HORIBA ABX BP Montpellier - cedex 4 - France Form-0846 Rev. 2 Método La HbA1c se expresa en porcentaje del contenido de hemoglobina total. Para determinar la concentración de THb mediante espectrofotometría se deben transformar las diferentes formas de hemoglobina en una sola forma con un espectro de absorción uniforme. Los valores de HbA1c y de hemoglobina total (THb) en μmol obtenidos con el test de HbA1c se utilizan para calcular el ratio HbA1c/THb y no deben utilizarse individualmente para el diagnóstico. Principio (8): Se miden las concentraciones de HbA1c y de hemoglobina total, se obtiene el ratio en porcentaje de HbA1c. La determinación de la HbA1c en porcentaje implica la utilización de cinco reactivos: el Antibody Reagent (R1) diluido con el Diluent I (R5), el Agglutinator Reagent (R2), el Hemolysis Reagent (R3) y el Total Hemoglobin Reagent (R4). Se mezcla manualmente la muestra de sangre total con el reactivo Hemolysis Reagent (R3) (1 volúmen de muestra por cada 40 volúmenes de R3). Los glóbulos rojos se lisan y la cadena de hemoglobina se hidroliza mediante la acción de una proteasa presente en el reactivo. El reactivo Total Hemoglobin Reagent (R4) se utiliza para la determinación de la hemoglobina total. El método se basa en la transformación de todas las formas de hemoglobina en hematina alcalina en una solución alcalina de detergente no iónico tal y como se describe en el procedimiento original de Wolf et al. La reacción se desencadena al añadir la muestra de sangre previamente tratada al reactivo Total Hemoglobin Reagent (R4) y se obtiene una coloración verde de la solución. La transformación de todas las formas de hemoglobina en hematina alcalina con un espectro de absorción definido permite el cálculo de la concentración en la hemoglobina total. El contenido de hemoglobina se mide mediante un método en punto final a 600 nm. La concentración de hemoglobina es directamente proporcional al aumento de la DO observado. Para medir la HbA1c específica se utiliza un test de inhibición de aglutinación de látex. Un aglutinante (polímero sintético que contiene múltiples copias de la parte inmunorreactiva de HbA1c) provoca la aglutinación de partículas de látex cubiertas de anticuerpos monoclonales de ratón específicos de la HbA1c. Si no existe HbA1c en la muestra, el aglutinante del reactivo Agglutinator Reagent (R2) y las micropartículas cubiertas de anticuerpos del reactivo Antibody Reagent (R1) se aglutinan. Esta aglutinación provocará un aumento de la absorbancia de la suspensión. La presencia de HbA1c en la muestra disminuirá la tasa de aglutinación puesto que el HbA1c entrará en competición con el reactivo Agglutinator Reagent (R2) en los lugares de unión de los anticuerpos de las micropartículas. Cuanto más Hba1c contenga la muestra, más débil será la tasa de aglutinación. La reacción se mide mediante absorbancia a 600 nm y la tasa de aglutinación se utiliza para calcular la concentración a partir de una curva de calibración. El porcentaje de HbA1c se calcula utilizando los valores de HbA1c y de hemoglobina total en μmol.
2 Reactivos El reactivo ABX Pentra se presenta en un casete multirreactivo listo para su uso. Contenido del casete: Reactivo 1: Antibody Reagent Reactivo 2: Agglutinator Reagent Reactivo 3: Hemolysis Reagent Reactivo 4: Total Hemoglobin Reagent Reactivo 5: Diluent I El reactivo Antibody Reagent (R1) contiene: partículas asociadas con los anticuerpos de HbA1c (ratón), albúmina de suero bovino, tampón, surfactantes y conservantes. El reactivo Agglutinator Reagent (R2) contiene: hapteno de enlace covalente con el polímero, albúmina de suero bovino, tampón, conservantes y surfactantes. El reactivo Hemolysis Reagent (R3) contiene: pepsina porcina, tampón y conservantes. Este reactivo se vende también por separado (Ref. A11A01730). El reactivo Total Hemoglobin Reagent (R4) contiene: hidróxido de sodio y surfactantes. El diluyente Diluent I (R5) contiene: conservantes y NaC1. 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml En hemolizado, las muestras y los controles deben diluirse a 1:41 con el reactivo Hemolysis Reagent (R3). Mezcle con cuidado (evitando que se forme espuma) y déjelo reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (hasta obtener una coloración verdosa) antes de realizar el test en el instrumento. Se recomienda el uso de una pipeta de desplazamiento positivo para extraer la sangre total. Calibrador Para la calibración utilice: ABX Pentra Cal, Ref. A11A01703 (no incluido) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml La hemoglobina total se calibra con el calibrador ABX Pentra HbA1c WB Cal (CAL 1) con un valor diana de hemoglobina total. Los calibradores y los reactivos no dependen de los lotes y se someten al control de calidad interno de ABX. La calibración del método HbA1c se realiza utilizando el calibrador ABX Pentra Cal, que contiene seis niveles de calibrador HbA1c. Estos procedimientos de calibración son compatibles con la certificación NGSP/DCCT. Posición de los calibradores en la bandeja de muestra para calibrador: El reactivo ABX Pentra debe utilizarse siguiendo esta información. HORIBA ABX no garantiza el resultado si se utiliza de otro modo. Utilización Antibody Reagent (R1): 1. Mezcle 3 volúmenes de Antibody Reagent (R1) con 2 volúmenes de Diluent I (R5). 2. Antes de utilizar la mezcla por primera vez, déjela reposar durante una hora aproximadamente en el compartimento refrigerado del ABX Pentra 400 para que se estabilice. Todos los otros reactivos Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) y Total Hemoglobin Reagent (R4) se suministran como soluciones listas para su uso. 1. Mezcle con cuidado los reactivos invirtiéndolos verticalmente y viértalos en un contenedor para reactivos. 2. Antes de utilizar los reactivos, déjelos reposar en el compartimento refrigerado del ABX Pentra 400 para que se estabilicen. Véase el diagrama siguiente (los sectores B y C se toman como ejemplos): Total Hemoglobin Reagent Reactivo 4 Agglutinator Reagent Reactivo 2 Antibody Reagent Reactivo 1 (diluido) 1. CAL 1 (200 μl) 2. agua fisiológica 3. CAL 2 (150 μl) 4. CAL 3 (150 μl) 5. CAL 4 (150 μl) 6. CAL 5 (150 μl) 7. CAL 6 (150 μl) Nota: la posición del CAL 1 se usa como ejemplo; el CAL 1 también puede colocarse en la posición 8, 9 ó 10. Control Para el control de calidad interno utilice: ABX Pentra HbA1C WB Control, Ref. A11A01704 (no incluido) Control normal: 2 x 0,25 ml (liofilizado) Control patológico: 2 x 0,25 ml (liofilizado) Todos los controles deben comprobarse a diario y/o después de cada calibración. La frecuencia de los controles y los intervalos de confianza deben adaptarse a las exigencias del laboratorio y a las normativas específicas de cada país. Los resultados deberán encontrarse dentro de los límites de confianza definidos. Cada laboratorio establecerá el procedimiento que deberá seguirse si los resultados se encuentran fuera de dichos límites de confianza.
3 Materiales necesarios pero no suministrados Analizador automático de bioquímica Equipamiento estándar de laboratorio agua fisiológica Muestra (9) Con este método se pueden utilizar muestras de sangre venosa o de sangre capilar. Los anticoagulantes aceptados son el ácido etilendiamintetracético de potasio (K2-EDTA) y la heparina de amonio (NH 4 -heparina). Las muestras de sangre total tomadas en K 2 -EDTA y NH 4 -heparina se pueden conservar durante 6 meses a -70 ºC, dos semanas a 5 C y una semana a 25 ºC o más. Las muestras congeladas deben descongelarse a temperatura ambiente y mezclarse con cuidado antes de su uso. Mezcle con cuidado las muestras de sangre justo antes de realizar el test para garantizar los resultados exactos de THb. Valores normales (4,11,13,14) Cada laboratorio debe verificar que sus valores usuales sean compatibles con los valores de referencia NGSP. Esta técnica certificada NGSP tiene como valores normales de HbA1c entre 4 y 6 % en los no diabéticos, con el objetivo terapéutico de obtener un valor < 7% como recomienda la asociación de diabetes americana (ADA, American Diabete Association). Todos los resultados de paciente deben interpretarse teniendo en cuenta todos los otros exámenes clínicos. Límites del método (10): La mayoría de los pacientes tienen valores de hemoglobina comprendidos entre 4,4 mmol/l y 14,4 mmol/l. No obstante, algunas publicaciones especializadas muestran que existen pacientes con anemias graves que tienen concentraciones de hemoglobina inferiores a 4,4 mmol/l y pacientes con policistemia con concentraciones de hemoglobina superiores a 14,4 mmol/l. Los pacientes que presenten dichos síntomas deben analizarse utilizando otro método si sus valores de hemoglobina se encuentran fuera del intervalo de medida. Todas las causas que afectan a la duración de vida de los glóbulos rojos (como la anemia hemolítica u otras afecciones hemolíticas, el embarazo o una pérdida importante de sangre, etc.) provocan una disminución de la exposición de estas células en la glucosa y en consecuencia, una disminución en porcentaje de los valores de la hemoglobina glicada (Ghb). Los resultados en % de Ghb no son fiables para los pacientes que sufran pérdidas de sangre crónicas y, en consecuencia, con duraciones de vida variables de los heritrocitos. Las muestras que contienen las formas C y S de la hemoglobina, si se tratan con este método, pueden provocar un aumento (de hasta el 40%) del valor esperado de HbA1c. Las muestras que contienen cantidades importantes de hemoglobina F (más del 10%) pueden generar un resultado de HbA1c inferior al esperado con este método. En conclusión, los resultados de hemoglobina A1c obtenidos con este test para muestras de sangre con formas S, C y F (más del 10%) no deben compararse con los valores normales o anormales publicados. Se ha demostrado que una muestra con hemoglobina E no interfiere en la medida de la HbA1c cuando se utiliza este método. La interferencia de las hemoglobinas carbamiladas y acetiladas no se ha estudiado para este reactivo. La fracción lábil de la hemoglobina glicada (lugares de unión Schiff de la glucosa a la hemoglobina A o A1c) no afecta a los resultados porque el anticuerpo es específico de la cetoamina estable. Conservación y estabilidad Proteger de temperaturas altas extremas, la luz o el hielo. Estabilidad de los reactivos (cerrados y tras su apertura): Los reactivos permanecen estables hasta la fecha de caducidad que figura en la etiqueta siempre que se conserven entre 2 y 8 ºC, en su envoltorio original y protegidos de toda contaminación. Notas de aplicación Tenemos a su disposición las instrucciones del test en otros analizadores automáticos distintos al ABX Pentra 400; no dude en solicitarlas en caso necesario. Tratamiento de los residuos Consulte la legislación local en vigor. Precauciones generales 1. Reactivo de diagnóstico in-vitro, de uso exclusivo por profesionales. 2. Antibody Reagent (R1): Se han utilizado componentes de origen humano para preparar este producto. Todas las unidades de donantes de sangre utilizadas han resultado negativas (sin reactividad repetida) en las pruebas del antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg), los anticuerpos de la hepatitis C (HCV) y el virus de inmunodeficiencia humana adquirida (VIH-1 y VIH-2). Atención Dado que ningún test puede garantizar completamente la ausencia del VIH, el virus de la hepatitis B o C u otros agentes infecciosos, estos productos deben manipularse como se tratan las muestras de sangre humana potencialmente infecciosa. En caso de exposición, siga las directivas de la autoridad competente en materia de sanidad. Irritante. S24: Evítese el contacto con la piel. S37: Úsense guantes adecuados. R43: Puede causar una sensibilización si entra en contacto con la piel.
4 3. Agglutinator Reagent (R2): Irritante. S24: Evítese el contacto con la piel. S37: Úsense guantes adecuados. R43: Puede causar una sensibilización si entra en contacto con la piel. 4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3), Total Hemoglobin Reagent (R4): Evite el contacto con los ojos, la piel o la ropa. Tras la manipulación del producto, lávese las manos meticulosamente con agua. No ingerir. 5. Diluent I (R5): Irritante. R36/38: Irritante para los ojos y la piel. R43: Puede causar una sensibilización si entra en contacto con la piel. 6. Los viales de reactivo deben desecharse tras su uso. 7. Consulte la ficha de seguridad asociada al reactivo. Rendimiento en el ABX Pentra 400 Los datos de rendimiento que se presentan a continuación han sido obtenidos en el analizador ABX Pentra 400. Número de tests: 345 tests Estabilidad de la solución de látex reconstituida: la solución de látex reconstituida permanece estable durante 2 meses siempre que se conserve entre 2 y 8ºC tras su reconstitución. Utilice sólo la cantidad necesaria y conserve refrigerados inmediatamente los reactivos tras su uso. Volumen de la muestra (tras su tratamiento): Hb: 25 μl/test HbA1c: 2,5 μl/test Límite de detección: El límite de detección se ha determinado siguiendo las recomendaciones del protocolo Valtec (15) y es de 1,22 μmol/l para la hemoglobina total. Exactitud y precisión: Repetibilidad (intraensayo) Se han sometido a prueba 20 veces 3 muestras de concentración baja, media y alta, así como 2 controles, siguiendo las recomendaciones del protocolo Valtec (15). Media % CV % Control normal 5,32 1,17 Control patológico 10,33 0,92 Muestra 1 5,54 1,39 Muestra 2 8,46 1,04 Muestra 3 12,16 1,21 Reproducibilidad Se han determinado cuantitativamente por duplicado durante 20 días (2 series por día) 2 muestras de nivel bajo y alto, así como 2 controles, siguiendo las recomendaciones del protocolo NCCLS, EP5-A (16). Media % CV % Control normal 5,70 2,46 Control patológico 11,18 1,92 Muestra 1 5,77 2,37 Muestra 2 12,75 2,74 Linealidad e intervalo de medida: Se ha determinado la linealidad del reactivo siguiendo las recomendaciones del protocolo NCCLS, EP6-P (17). Linealidad baja: para la hemoglobina total: 5 μmol/l para la HbA1c: 1,34 μmol/l Linealidad alta: para la hemoglobina total: 125 μmol/l para la HbA1c: 7,80 μmol/l Nota: si la concentración de HbA1c es superior a la del calibrador más alto (7,80 μmol/l), no diluya la muestra. Calcule el valor máximo posible de acuerdo con la concentración de HbT e indíquelo como superior a...<valor>. Ejemplo: si la concentración de HbT determinada por el instrumento es 54,00 μmol/l, calcule el valor: 7,80/54,00 x 100 = 14,44% de HbA1c. El resultado es: superior a 14,44% de HbA1c. Correlación: Se han determinado cuantitativamente 99 muestras de paciente por comparación con un reactivo comercializado en el mercado tomado como referencia, siguiendo las recomendaciones del protocolo NCCLS, EP9-A (18). La ecuación de la recta obtenida es: Y = 1,09 x + 0,32 con un coeficiente de correlación r 2 = 0,976. Interferencias: Triglicéridos: Sin interferencia significativa hasta una concentración de 7 mmol/l Bilirrubina totale: Sin interferencia significativa hasta una concentración de 353 μmol/l Bilirrubina directa: Sin interferencia significativa hasta una concentración de 368 μmol/l Glucosa: Sin interferencia significativa hasta una concentración de 167 mmol/l Estabilidad de la calibración: El reactivo se calibra a Día 0. La estabilidad de la calibración se verifica sometiendo a prueba 2 controles. La estabilidad de la calibración es de 4 semanas. Nota: Se recomienda ejecutar una nueva calibración si se cambia de lote de reactivo, si los resultados de uno o varios controles de calidad exceden el intervalo establecido o cuando se haya cambiado la solución de látex. Ratio NGSP a : Y = (100*967*X-377)/1000 Nota: X = HbA1c/HbT. a. Modificación del índice I a J : modificación de la proporción según la nueva certificación NGSP.
5 Versión del software para el análisis de HbA1c (A1c-H): 3.00 Versión del software para el análisis de la hemoglobina total (THb-H): 5.00 Advertencia Es responsabilidad de los usuarios comprobar que este documento sea aplicable al reactivo utilizado. Bibliografía 1. Mayer TK and Freedman ZR: Protein glycosylation in diabetes mellitus: A review of laboratory measurements and of their clinical utility. Clin. Chim. Acta 127; (1983). 2. Baynes JW.Bunn HF, Goldstein DE, et al : National Diabetes Group; Report of the expert committee on glucosylated hemoglobin. Diabetes Care 7; (1984). 3. Koenig RJ, Peterson CM, Kilo C. et al: Hemoglobin A1c as an indicator of the degree of glucose intolerance in diabetes. Diabetes 25; (1976). 4. Nathan DM, Singer DE, Hurxthal K, and Goodson JD: The clinical information value of the glycosylated hemoglobin assay. NE J. Med. 310; (1984). 5. McCarren M: DCCT; and it works: Intensive therapy reduces the risk of diabetic eye, kidney, and nerve disease. Diabetes forecast (September 1993). 6. Larsen ML, Horder M, and Mogensen EF: Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulindependent diabetes mellitus. NE. J. Med. 323; (1990). 7. Nathan DM: Hemoglobin A 1c. Infatuation or the real thing? NE. J. Med. 323; (1990). 8. Wolf HU, Lang W, and Zander R; Alkaline haematin D-575, a new tool for the determination of haemoglobin as an alternative to the cyanhaemoglobin method. Clin. Chim. Acta. 136; (1984). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Skin Puncturethird edition; approved standard. NCCLS publication H4-A3. Villanova, PA: NCCLS; Knowles BJ, Haigh WB, and Michaud GC: A monoclonal antibodybased immunoassay for hemoglobin A 1c. Diabetes 35; Supplement: 94A (1986). 11. Goldstein DE, Little RR, Wiedmayer HM, et al: Glycated hemoglobin: Methodologies and clinical applications Clin. Chem. 32; (1986). 12. Ellis G. Diamandis EP, Giesbrecht EE, et al. An automated «high pressure» liquid chromatographic assay for hemoglobin A 1c. Clin. Chem. 30: (1984). 13. Burtis CA and Ashwood ER, eds: Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2 nd edition, WB Saunders Company, Philadelphia, PA. p.2021 (1994). 14. Diabetes Care 2002; 25 (suppl. 1); Vassault A., Grafmeyer D. Naudin C. et al., Protocole de validation de techniques (document B), Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices, Approved Guideline, NCCLS document EP5-A, Vol. 19, No. 2, february Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods, Proposed Guideline, NCCLS document EP6-P, Vol. 6, No. 18, september Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples, Approved Guideline, 2 nd ed., NCCLS document EP9-A2, Vol. 22, No. 19, 2002.
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