Universidad Nacional Autónoma de México

Transcripción

1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Curso Genética y Biología Molecular (1630) Licenciatura Químico Farmacéutico Biológico Dra. Herminia Loza Tavera Profesora Titular de Carrera Departamento de Bioquímica Lab 105, Edif E hlozat@unam.mx

2 Objetivos del tema El alumno... IV. GENÉTICA BACTERIANA 1. Tipos de mutaciones en bacterias 2. Bacteriófagos y virus eucariontes Comprenderá los mecanismos de la genética de virus, bacterias y elementos genéticos móviles. Revisará los mecanismos por los que se producen las mutaciones en las bacterias y sus virus, conocerá su utilidad para el mapeo génico en procariontes a partir de los mecanismos de transferencia horizontal de material genético y comprenderá la importancia de los elementos genéticos móviles en la evolución de los genomas Conocerá la nomenclatura para referirse a los fenotipos y genotipos de bacterias mutantes. X Conocimiento Comprensión Aplicación 1.2. Entenderá los métodos para la generación y selección de bacterias X mutantes Describirá la composición química de los virus. X 2.2. Analizará los ciclos lítico y lisogénico de los bacteriófagos. X 2.3. Conocerá las características y ciclos de infección de algunos virus de eucariontes mediante los ejemplos del virus VIH y el de influenza. 3. Plásmidos 3.1. Definirá la estructura, propiedades y funciones del plásmido F bacteriano. 4. Mecanismos de transferencia horizontal del material genético 5. Elementos genéticos móviles 4.1. Conocerá los procesos de transformación, transducción y conjugación Comparará los mecanismos de transferencia de información genética en bacterias Aplicará los procesos de transferencia horizontal de material genético en la elaboración de mapas genéticos de virus y bacterias basados en la recombinación sitio específico Conocerá la estructura y función de las secuencias de inserción y transposones Discutirá la función de los elementos genéticos móviles en la producción de cambios en los genomas. TERCER EXAMEN: Temas III y IV. X X X X X X X

3 GENÉTICA BACTERIANA

4 1. TIPOS DE MUTACIONES EN BACTERIAS Qué es una mutación? Un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos en el DNA Una mutación no necesariamente es deletérea En algunos casos puede ser ventajosa En otros casos puede no producir ningún cambio observable Qué es un mutante? Un organismo que desciende de un miembro normal (silvestre) pero que es diferente

5 Un cambio que sea letal no puede ser considerado una mutación pues ésta debe ser heredable Para la genética y la biología molecular, las mutantes son útiles para estudiar cómo se regulan los genes, qué codifican o cuál es la función de su producto génico.

6 Las mutaciones son preadaptativas, es decir no se generan en respuesta a la presencia del agente selectivo. se generan espontáneamente y el agente selectivo solo las selecciona. Lederberg y Lederberg, 1952

7 Tipos de mutaciones Cambios en una sola base Transición: cambia pur x pur o pyr x pyr Transversión: cambia pur x pyr Frameshift mutations (cambia la fase de lectura del mensaje) Deleción de una sola base Inserción de una sola base Una secuencia de pares de bases Deleción Inserción Una larga región de DNA Duplicación Inversión

8 Frameshift (cambio del marco de lectura) Al insertarse o perderse un nucleótido ocurre un cambio en el marco de lectura del mensaje

9 Cómo se genera una mutante? De manera natural, por errores en la replicación Por exposición a agentes mutagénicos como: Agentes físicos: luz UV, rayos X, rayos gamma Agentes químicos: anaranjado de acridina, otros... Y en el lab...? Existen métodos que permiten generar mutaciones que luego se pueden mapear para saber cuál gen fue el que se alteró. Uno de estos métodos es la mutagénesis por transposición.

10 Tipos de mutantes bacterianas PROTOTROFÍA/AUXOTROFÍA Las cepas silvestres son protótrofas (crecen en medio mínimo). Las cepas auxótrofas son mutantes incapaces de sintetizar algún metabolito esencial, por lo que éste debe ser añadido al medio (bio -, arg -, met -, ad - ) UTILIZACIÓN DE DIVERSAS FUENTES DE ENERGÍA Capacidad de las bacterias para utilizar determinados sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos: galactosa (gal - /gal + ); lactosa (lac - /lac + ) RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Capacidad de crecer en presencia de inhibidores, como antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc. str R /str S ; amp R /amp S Otras características como morfología de las colonias y pruebas bioquímicas también se emplean.

11 Medio mínimo: medio sintético básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales

12 Cultivos de bacterias Suspensión celular bacteriana Suspensión plaqueada en caja con agar Incubación 1 2 días Caja Petri con agar Células individuales invisibles a simple vista Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo) Aislamiento de mutantes a partir de colonias individuales

13 Una de las bacterias más estudiadas Escherichia coli Descubridor: Theodore Escherich Qué ventajas presenta para uso de laboratorio?

14 2. BACTERIÓFAGOS Y VIRUS EUCARIONTES

15 Generalidades de los virus Tamaño nm DNA o RNA, de cadena simple o doble Cubierta de proteínas con o sin lípidos Forma icosaédrica, de varilla, o cabeza y cola Virus de la influenza (200 nm)

16 Algunas estructuras de los bacteriófagos (fagos): virus bacterianos Icosahédricos sin cola ( X174) Icosahédricos con cola ( ) Filamentosos (M13) Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside de proteína

17 El genoma de los fagos RNA simple cadena (MS2, Qß) RNA doble cadena (phi 6) DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) DNA doble cadena (T3, T7, lambda, T5, Mu, T2, T4) Estos ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En los fagos T-pares, el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos de fago algunas de las bases están parcialmente sustituidas.

18 Bacteriófago Fago libre Componentes del Fago Cabeza Cuello y collar Fago infectando Centro Vaina Placa Basal Fibras

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20 Ciclo lítico

21 Ciclo Lítico Ciclo de replicación del bacteriófago 1. Adsorción del fago a receptores en la superficie de la bacteria (proteínas transportadoras de maltosa o de Fe 2+ ) 2. Inyección del material genético viral 3. Transcripción del DNA del bacteriófago y producción de proteínas virales 4. Replicación del material genético viral 5. Empaquetamiento del DNA dentro de la envoltura proteica y ensamblaje de la envoltura 6. Lisis y liberación de las partículas virales

22 Halos o placas de lisis de los fagos Son generados sobre un manto de bacterias, área opaca en el gel

23 Además del ciclo lítico el fago puede presentar un ciclo lisogénico

24 Ciclo Lisogénico (Fagos temperados) 1. Una molécula de DNA del fago es inyectada a la bacteria. 2. Transcripción de genes necesarios para la integración. 3. El DNA del fago se inserta en el cromosoma bacteriano. (Integración) 4. La bacteria replica su DNA (y el del fago) y se divide normalmente. 5. El fago insertado se denomina profago y a la bacteria lisógeno. 6. La bacteria es ahora inmune a la infección de otros fagos.

25 Características de los ciclos de vida del fago

26 Integración del DNA del fago al cromosoma bacteriano El cromosoma del bacteriófago lambda ( ) en estado libre es circular. El sitio de integración es una región del cromosoma que se alinea en un sitio del cromosoma bacteriano (entre los genes gal y bio). Sitios de attachment: attp en el fago y attb en la bacteria. Ocurre un entrecruzamiento recíproco entre el fago circular y el cromosoma bacteriano resultando en la integración. Esta integración es mediada por los genes del bacteriófago y no por el sistema de recombinación de la bacteria. Al DNA del fago integrado al cromosoma se le llama profago.

27 Una bacteria lisogénica es la que porta un profago (genoma del fago integrado al genoma de la bacteria)

28 El DNA del bacteriofago es lineal con extremos cohesivos, lo cual permite que pueda circularizarse

29 Integración de al cromosoma bacteriano

30 Virus de la influenza A Virus de RNA

31 Los retrovirus se integran al DNA Esto es posible por la actividad e una transcriptasa reversa, la cual sintetiza DNA a partir de RNA HIV El genoma del retrovirus es RNA y dentro de la cápside viene la transcriptasa reversa

32 Moléculas de DNA circulares extracromosomales que tienen su propio origen de replicación y se encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de eucariontes. 3. PLÁSMIDOS

33 Características de los plásmidos Usan la misma maquinaria de replicación del DNA cromosomal y contienen un origen de replicación. Se clasifican en: de bajo número de copias (1-10 copias por célula) de alto número de copias ( copias por célula) Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas copias del plásmido. Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos relacionados, excluyéndolos así de la célula.

34 Los plásmidos codifican diversas funciones que le permiten, a la bacteria que los contiene, sobrevivir en distintos habitats Funciones de resistencia Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, -lactamas) Metales pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi) Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos) Funciones metabólicas Producción de bacteriocinas Metabolismo de carbohidratos Metabolismo de compuestos carbonados Factores que intervienen en la interacción con el hospedero Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli) - endotoxina (Bacillus thuringiensis) Neurotoxina (Clostridium tetani) Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)

35 4. MECANISMOS DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL DEL MATERIAL GENÉTICO EN BACTERIAS Transformación Transferencia parcial del genoma por consumo de DNA Conjugación Plásmidos Conjugación Genoma Transferencia de plásmidos durante la conjugación Transferencia parcial del genoma durante la conjugación Transducción Transferencia parcial como parte del genoma viral

36 TRANSFORMACIÓN La transformación es la transferencia de genes resultante del consumo de DNA exógeno de un donador. Si el DNA exógeno es un fragmento sin origen de replicación, debe ser incorporado al DNA cromosomal por recombinación para que se mantenga dentro de la bacteria. Una de las dos cadenas es hidrolizada y el DNA de cadena sencilla que queda es protegido por proteínas de unión a DNA de cadena sencilla (SSBP) y está disponible para recombinarse con el DNA cromosomal. Si el DNA exógeno contiene un origen de replicación, por ejemplo un plásmido, puede mantenerse independiente del genoma de la bacteria

37 Factores que afectan la transformación Tamaño y estado del DNA Sensible a nucleasas Competencia de la célula receptora (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus) Factor de competencia Competencia inducida No todas las bacterias se transforman de manera natural

38 Transformación de fragmentos de DNA que deben integrarse al genoma de la bacteria receptora para permanecer

39 En el laboratorio, se puede inducir que algunas bacterias que no se transforman de manera natural puedan ser competentes E. coli no se transforma de manera natural. En el laboratorio debe hacerse competente para aceptar material genético exógeno Se emplean plásmidos como vectores para introducir los genes deseados. En este caso el DNA introducido no requiere insertarse en el genoma de la bacteria receptora pues el plásmido contiene un origen de replicación.

40 CONJUGACIÓN Observación: cuando dos cultivos con marcadores auxotróficos distintos (cepa A y cepa B) se mezclan pueden surgir colonias prototróficas Estudiada por Lederberg y Tatum, 1947

41 Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra este intercambio Medio mínimo Experimento de Lederberg y Tatum

42 Conjugación en Escherichia coli F + (Factor de fertilidad) Pili F - F + Plásmido F *Plásmido F codifica alrededor de 100 genes William Hayes, 1953

43 Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto físico entre bacterias (F + y F - ).

44 La Conjugation es el análogo más cercano en bacterias al sexo en eucariontes. La habilidad para conjugar es conferida por el plásmido F. Las células bacterianas que contienen el plásmido F son llamadas F +. Las bacterias que no tienen el plásmido F son llamadas F -. Las células F + tienen fibras especiales llamadas pili sexuales. Cuando células F + encuentran a células F -, los pilli sexuales las acercan y una copia del plásmido F es transferida de F + a F -. Ahora ambas células son F +. Por qué no todas las células de E. coli son F +, ya que es posible que F se distribuya tan fácilmente? Porque el plásmido F puede ser espontáneamente perdido. CONJUGACIÓN

45 Participan dos tipos de células: donadoras/machos que tienen el plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) (F + ) receptoras/hembras que no lo tienen el plásmido F (F - ) Plásmido F contiene unos 100 genes algunos codifican proteínas involucradas en la replicación del DNA otros codifican proteínas tubulares que forman el pilus CONJUGACIÓN

46 Mecanismo de conjugación La célula F + inicia la conjugación al sintetizar y extender el pilus que se adhiere a la superficie de la célula F - El pilus se retrae y acerca a las dos células.

47 La cadena de DNA recién transferida también se replica. Las dos células contienen un plásmido F íntegro, por lo que ambas son F + Una de las cadenas del DNA F es cortada por una endonucleasa y se separa de la otra cadena. Se transfiere esa cadena a la otra célula, a través del poro de conjugación, mientras que se comienza a replicar el DNA de la cadena que se quedó en la célula F +

48 Características del mecanismo de conjugación La replicación del plásmido requiere de un puente de cruzamiento entre la célula donadora y la célula receptora. Antes de que el puente de cruzamiento pueda formarse se requiere que: la célula donadora reconozca a la célula receptora la célula donadora tome contacto con la célula receptora Las funciones conjugativas del plásmido F están especificadas por un cluster de la menos 25 genes de transferencia (genes tra). Ellos determinan: expresión del pili F síntesis y transferencia del DNA durante el cruzamiento determina la incapacidad de F+ de funcionar como célula receptora.

49 Si bien la conjugación explica el paso de material genético de una bacteria donadora a otra receptora, no explica el haber encontrado bacterias prototrófas en el experimento de Lederberg y Tatum (1947).

50 Bacterias con alta frecuencia de recombinación (Hfr) El plásmido F es capaz de integrarse al cromosoma bacteriano. Cuando el plásmido F se integra al cromosoma de la bacteria, la célula ya no es F + sino es Hfr (high frequency of recombination). Episoma. Fragmento de DNA que puede existir como plásmido y que se puede integrar al cromosoma. La célula Hfr mantiene su capacidad de conjugación, por lo que se puede aparear con una célula F -

51 Como se transfirió un fragmento del DNA cromosomal, y si hay homología con el cromosoma de la célula receptora, ocurre recombinación con alta frecuencia (Hfr) Al conjugarse una Hfr se lleva a cabo la transferencia de material genético, empezando por el DNA cromosomal. Generalemente, no se transfiere el cromosoma completo pues las células se separan, por lo que, la secuencia del plásmido F no se transfiere.

52 Una característica importante del apareamiento Hfr / F - es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F.

53 Generación de una cepa Hfr F integrado

54 Integración del plásmido F al cromosoma Regiones homólogas donde el apareamiento entre bases puede ocurrir O O Dirección de la transferencia Tanto el cromosoma bacteriano como el episoma F son circulares

55 En la conjugación de Hfr se transfiere parte del genoma de la bacteria Después de 2 h algunos exconjugantes se convierten en Hfr F d c b a O

56 La bacteria donadora contribuye con una fracción de material genético a la bacteria receptora El fragmento de DNA donado es llamado exogenota y el genoma receptor el endogenota Una bacteria que contiene ambos DNAs, el exogenota y el endogenota es un merocigoto a + b + Exogenota a b Endogenota

57 Para que ocurra la integración estable del exogenote debe haber un doble entrecruzamiento con el endogenote Recombinación sencilla No viable Recombinación doble a + a No viable a + a + Viable Recombinantes recíprocos Merocigoto

58 Corolario 1. El cromosoma de E. coli es circular. 2. El plásmido F es circular. 3. La orientación en la que se integra F al cromosoma determina la dirección de la transferencia. 4. Un extremo de F integrado es el Origen donde comienza la transferencia y el otro extremo es el término que generalmente NO se transfiere a menos que antes se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.

59 Resumen de la conjugación bacteriana

60 Una característica importante del apareamiento Hfr / F - es que la transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está insertado el episoma F. Esta propiedad permite controlar la cantidad de información genética transferida y mapear la posición de los genes transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo de conjugación.

61 Mapeo de genes en E. coli por conjugación El tiempo que se requiere para que los genes entren en la célula receptora está asociado con el ordenamiento en el cromosoma bacteriano. El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F - receptora. Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán transferencias parciales de los genes. El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede deducir al determinar los genes transferidos durante apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.

62 Experimento de conjugación a tiempos controlados Cepa Donadora Hfr: thr + ; leu + ; azi s ; ton s ; lac + ; gal + ; str s Cepa receptora (F-): thr - ; leu - ; azi r ; ton r ; lac - ; gal - ; str r 1. Poner en contacto a las dos cepas. 2. Interrumpir la conjugación a distintos tiempos, por agitación fuerte. 3. Sembrar en medio con streptomicina (elimina a la cepa donadora). 4. Evaluar el fenotipo de las bacterias conjugantes sembrando en cajas con distintos medios.

63 Resultados del experimento Tiempo de conjugación (min) % de colonias que sobreviven con los genotipos indicados thr + leu + azi s ton s lac + gal +

64 Observando el orden en que los genes son transferidos en una conjugación podemos saber el orden que tienen en el cromosoma

65 Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli realizado por conjugación Punto de inicio Las unidades son minutos. Se refiere al tiempo que tardan los genes en entrar a una bacteria F- receptora durante el experimento de conjugación.

66 CONJUGACIÓN F En células Hfr, ocurre con baja frecuencia que, F se escinde del cromosoma y forma un plásmido circular nuevamente. En algunos casos, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma bacteriano que ahora se encuentran formando parte del plásmido F. Entonces, a éste se le llama plásmido F.

67 A los factores F que tienen genes bacterianos se les llama episomas F Éstos se originan por una excición errónea del plásmido F.

68 Cuando un episoma F se transfiere a una bacteria receptora, ésta se convierte en un diploide parcial

69 CONJUGACIÓN F Los plásmidos F también pueden ser transferidos por conjugación Con esta transferencia se pueden crear células diploides parciales

70 TRANSDUCCIÓN Transferencia de material genético entre bacterias a través de un bacteriófago

71 Transducción Transferencia de material genético bacteriano por los virus de bacteria (fagos) phe trp tyr met his WT Requiere de contacto entre el fago y la bacteria para que el fago pueda infectar

72 Profago Cromosoma bacteriano Inducción del ciclo lítico La escición del DNA del fago acarrea DNA cromosomal Replicación del fago Lisis celular y liberación del fago La célula receptora adquiere nuevos genes Integración del DNA del fago al cromosoma El fago infecta a la célula receptora

73 Transducción Transducción generalizada: es el mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser transferido a la célula receptora. Transducción especializada: La transducción especializada es la transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor.

74 Transducción generalizada Los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el DNA de la célula huésped en pequeñas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la partícula fágica mediante un mecanismo llamado head full o llenado de las cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas del DNA de la bacteria huésped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto cualquier gene de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferirá tanto DNA como pueda caber en una sola cápside. Cuando la célula receptora se infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el DNA de la donadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora puede ocurrir el evento de la recombinación generalizada, en el cual se substituye el DNA de la célula donadora por el de la receptora. Fagos llevando genes de la célula donadora

75 Transducción especializada Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transducción especializada está mediada por fagos lisogénicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir dependerán del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma.

76 Mapeo de genes empleando transducción Células donadoras: arg + ; met +, str s Infección con el fago P1. Ciclo lisogénico. Integración. Ocasionalmente un fago contendrá un segmento del cromosoma bacteriano. Mezclar los fagos con la bacteria receptora: arg - ; met - ; str r

77 Estas colonias deben ser met + Plaquear en medio mínimo con arginina y estreptomicia pero sin metionina Para determinar si también son arg + estriar en placas sin ambos aminoácidos

78 Transferencia horizontal de genes entre distintas especies e incluso géneros de bacterias

79 Mecanismos de resistencia a antibióticos y su transmisión 1. Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de Lipopolisacáridos). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en plásmido o en cromosoma. 2. Modificación e inactivación del antibiótico. -lactamasa, enzimas modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa. 3. Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad por las -lactamas. 4. Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a sulfonamidas. La transferencia horizonzontal de material genético en bacterias ha dispersado los distintos genes que confieren resisitencia a antibióticos, generando un grave problema de multi-resistencia a antibióticos

80 1. Cuatro cepas Hfr de E. coli procedentes de la misma cepa F + transfieren los siguientes marcadores en el orden: Cepa 1: M Z X W C Cepa 2: L A N C W Cepa 3: A L B R U Cepa 4: Z M U R B Cuál es el orden de estos marcadores en la cepa F + original?

81 5. ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES (TRANSPOSONES) La transposición es otro tipo de recombinación de DNA en el cual un elemento transponible o transposón se mueve de una molécula de DNA a otra (recombinación ilegítima). Su existencia fue propuesta por Barbara Mc Clintock en maíz, sin embargo, no se demostró su existencia sino hasta mucho tiempo más tarde en bacterias. Su presencia se ha documentado también en otras especies, desde bacterias hasta humanos.

82 Descubrimiento de los transposones eucariontes Elementos de control Barbara Mc Clintock, 1951 Premio Nobel, 1983

83 Tipos de transposones Secuencia de Inserción o Elemento de Inserción (IS): contiene una secuencia central con el gen de la transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso no nesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del DNA aparece una repetición directa de la secuencia diana (5-12 pb). Transposón Compuesto (Tn): contiene un elemento de inserción (IS) en cada extremo, en orden directo o inverso y una región central que además suele contener información de otro tipo. Por ejemplo, los Factores de transferencia de resistencia (RTF) poseen información para resistencia a antibióticos (cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, etc.).

84 Elemento Características de algunos elementos IS Longitud Repetición terminal invertida Repetición directa de la diana Selección de la diana IS1 786 pb 23 pb 9 pb Regional IS pb 41 pb 5 pb Zona caliente IS pb 18 pb pb AAAX 20...XTTT IS pb 16 pb 4 pb Zona caliente Características de algunos Transposones compuestos (Tn) Elemento Longitud Marcador genético (resistencia) MÓDULOS TERMINALES IS Orientación Relación entre ambos Tn pb Tetraciclina IS 10 Invertida Divergencia 2.5% Tn pb Kanamicina IS 5 Invertida Difieren en 1 pb Tn pb Kanamicina IS 903 Invertida Idénticos Tn pb Cloranfenicol IS 9 Directa Idénticos (?)

85 Tanto los elementos IS como los transposones (Tn) tienen que estar integrados en una molécula de DNA, que contenga un origen de replicación, ya sea en el cromosoma principal bacteriano o en un plásmido, nunca se encuentran libres. Cromosoma de E. coli Algunos elementos pueden encontrarse en varias copias

86 Transposones en procariontes Secuencias de inserción (IS) Frecuencia global de transposición: Frecuencia individual de transposición: Reversión de la transposición:

87 Transposones El tamaño de los transposones varía entre 10 3 a 10 4 pb dependiendo del tipo de transposón. La secuencia íntegra del transposón se puede insertar en un sitio particular del cromosoma. La transposición involucra recombinación entre secuencias no relacionadas (recombinación ilegítima) que son los extremos flanqueantes del transposón y el sitio del cromosoma donde se insertó.

88 Formas de transposición Replicativa Conservativa

89 Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y une los extremos del transposón. Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son invertidas, son idénticas. Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún antibiótico. Kan S Kan R Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb. Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp. Tn7: 14,000 pb y regiones flanqueantes (secuencias repetidas invertidas de 30 pb). Resistencia a Strp, Spec. Tn10: 9,300 pb y regiones flanqueantes de 1,300 pb. Genes de resistencia a Tet.

90 Mecanismo de transposición (recombinación ilegítima) Repetidos directos (5-9 pb)

91 Transposición conservativa Unión de la transposasa a la región flanqueante Formación del asa (complejo sináptico). Los extremos del transposón se acercan. Corte del DNA y escición del transposón Unión del transposón al DNA blanco La transposasa cataliza la inserción del transposón al DNA blanco.

92 Transposición replicativa Transposasa Resolvasa

93 Transposones de eucariontes Retrotransposones Transposones de DNA

94 Los transposones pueden causar reordenamientos y cambios en los genomas

95 Transposones Duplicación de DNA Virus Transferencia de DNA Evolución de genomas

96 Uso de transposones para generar mutantes en bacterias (mutagénesis por transposición) 1. Para introducir inserciones de Tn5 al azar en el cromosoma de E. coli, se usa un vector de fago lambda: Pam int - ::Tn5 2. Cuando este fago infecta células Kan S, el DNA del fago no se puede replicar ni integrar, así que la única manera de que E. coli se vuelva Kan R es que el transposón Tn5 se inserte en algún sitio del cromosoma. Esto va a ocurrir en aprox. 1 de cada 100,000 células infectadas. 3. Si se infectan 2 x 10 9 células, se obtendrán aprox. 2 x 10 4 colonias Kan R. Cada una tendrá una inserción de Tn5 en un sitio distinto del cromosoma. Si en el genoma de E. coli hay unos 5,000 genes, es probable que se tenga una colección con inserción de Tn5 en casi todos los genes.