MANUAL DE LABORATORIO

Transcripción

1 R Por la naturaleza, todo Salaices, Chih., México TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍA A PRODUCTORES PARA DETERMINACIÓN DE MADUREZ FENÓLICA EN UVAS PARA VINO DE MESA MANUAL DE LABORATORIO Dra. Isaela Villalpando de la Torre Ing. Ana Rebeca Duarte Carmona M.C. Manuel Aragonez Villarreal Mayo 2014

2 Introducción El momento óp mo para la cosecha de la uva para vino depende de varios factores, tradicionalmente se analiza el contenido de azúcar, ph y acidez total para determinar el comienzo la vendimia (RibereauGayon et al. 1999). Al conjunto de estos parámetros se le llama madurez tecnológica y con base en ellos se determina el estado de la uva en la mayor parte de las zonas vinícolas de nuestro país incluyendo Chihuahua. Además de los ya mencionados existen otros parámetros que son determinantes si se desea obtener vinos de excelente calidad, entre ellos están el contenido de antocianos y taninos a lo que se le llama madurez fenólica (GonzálezSan José et al. 1991, Calò et al. 1996, Bisson 2001, Hunter 2004). Ésta nos indica de una manera confiable el potencial de color y astringencia que tendrá el vino desde antes de recolectar la uva; por lo tanto es una es mación de la calidad de la producción y proporciona valores de referencia para mejorar la ges ón de su vinificación. En el punto donde la uva alcanza la adecuada madurez los máximos de las curvas de madurez tecnológica y fenólica coinciden. El presente manual compila las técnicas necesarias para llevar a cabo los análisis para la determinación de polifenoles totales y con ello seguir la madurez fenólica de las uvas en campo, además de la cuan ficación de polifenoles durante la fermentación y en vinos terminados. Comprende también el muestreo de las uvas, importan simo para lograr resultados representa vos. El método Glories y Augus n modificado por Nadal y Mateos dará como resultado el porcentaje de extractabilidad y la madurez de la semilla, indicando de una manera sencilla el potencial enológico de la uva. El método de RibéreauGayon y Stonestreet ayudará en la determinación de antocianos en vinos terminados y por úl mo el método de FolinCiocalteau para la determinación de polifenoles totales en uva y vino. Este úl mo análisis se incluye como una alterna va económica para los productores ya que no se requiere el uso del espectrofotómetro UVVisible. NOTAS Este manual es el producto del proyecto de transferencia de tecnología a productores de uva chihuahuense, junto con dos cursos taller en donde se hicieron los análisis de manera prác ca. Este proyecto fue apoyado económicamente por Fundación Produce Chihuahua, A.C. atendiendo una demanda de los productores del Estado. 1

3 REFERENCIAS Bisson, L In search of op mal grape maturity, Dept of Enology and Vi culture, UC Davis, July/Ag Calò, A; Tomasi, D; Crespan, M; Costacurta, A Rela onship between environmental factors and the dynamics of growth and composi on of the grapevine. Proc. workshop strategies to op mize wine grape quality. Acta Hort 427: GonzálezSan José, ML; Barrón, LJ; Junquera, B; Robredo, LM Applica on of principal component analysis to ripening indices for wine grapes. J. Food Composit Anal 4: Hunter, JJ; Piscio a, A; Volschenk, CG; Archer, E; Novello, V; Kraeva, E; Deloire, A; Nadal, M Role of harves ng me/op mal ripeness in zone/terroir expression. Proc. Joint OIV, GESCO, SASEV Intl Conference on Vi cultural Zoning, November 2004, Cape Town, South Africa, , Nadal, Montserrat. Phenolic Maturity in Red Grapes Methodologies and Results in Grapevine Research, Springer Science+Business Media. B.V chapter 28. pp RamírezPérez P., GonzálezCaballero V Control del Proceso de Maduración del Viñedo en Climas Cálidos. Consejería de Agricultura, Pesca y Medio ambiente. Ins tuto de Inves gación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA). Formato digital (ebook). pp.122 RibereauGayon, P; Glories, Y; Maujean, A; Dubourdieu, D Handbookof Enology, Wiley, v. 2, 442 p. Roediger, A.H.A., 2006, Phenolic Ripeness in South Africa. Masters Diploma Thesis, Cape Wine Academy, South Africa 13 Muestreo de uvas en campo El muestreo de las uvas se toma una o dos veces por semana, dependiendo de la velocidad en el cambio de color de las bayas. El muestreo diario se recomienda cuando las uvas están casi maduras. Se recomienda que cada muestreo se haga a la misma hora del día con el fin de mantener la precisión. Materiales: Bolsas de plás co con cierre hermé co Cuchillo o jeras de poda Hielera y hielo Procedimiento: En caso de que el análisis de polifenoles totales se haga en el viñedo se recomienda recoger de 250 a 500 bayas de 1520 racimos diferentes, buscando que los racimos provengan de diferentes parras, de ambos lados de las hileras y lugares soleados y sombreados (Figura 1 y 2). Estas muestras deben ser analizadas después del muestreo o guardarse en el refrigerador por no más de 24 h. Se recomienda analizar las muestras por duplicado o triplicado. Si se requiere enviar las muestras a un laboratorio externo se deben muestrear racimos, usando el criterio anteriormente m e n c i o n a d o. L o s ra c i m o s o b a y a s recolectadas se ponen en bolsas de plás co y se transportan al laboratorio en hielo, teniendo cuidado de evitar la pérdida de jugo durante el transporte. Para determinar la madurez tecnológica y peso de las bayas, se toma una segunda muestra de 100 bayas. 2

4 Si no es posible el análisis inmediato de las muestras, se pueden guardar racimos congelados hasta por un período de 3 meses. Figura 1. Muestreo de viñedo Figura 2. Esquema de muestreo de uvas según Carbonneau (IFAPA, 2012). Método Glories y Augus n modiﬁcado por Nadal y Mateos para la determinación de contenido fenólico en uvas Introducción El principio fundamental del método propuesto por Glories y Augus n es llevar a cabo extracciones parciales de polifenoles (antocianos y taninos), macerando las uvas trituradas en soluciones de ph 1 y ph 3.6. La extracción a ph 1 degrada las membranas de las células de los hollejos, favoreciendo la parcial liberación, difusión y solubilización de los antocianos. La extracción a ph 3.6 se compara a la que se realiza en la viniﬁcación. La diferencia entre las concentraciones de antocianos en los extractos obtenidos de una solución a la otra es una indicación del estado de fragilidad de las membranas de las células de los hollejos, y en consecuencia de la extractabilidad de estos compuestos. El método considera también la fragmentación parcial de las semillas permi endo una extracción de sus taninos. Los taninos de los hollejos son extraídos de forma proporcional a los antocianos a ph 3.6. El potencial de extracción de taninos y antocianos es variable según las condiciones de madurez y las variedades. Figura 6. Madurez fenólica para las variedades Cabernet Sauvignon (CS), Merlot (MT), Tempranillo (TP), Malbec (MB) y Shiraz (SH), para los viñedos: La Gloria ubicado en Rosales (1), viñedo Jiménez (2), viñedo Hacienda Bus llos ubicado en Cuauhtémoc (3), viñedo Sacramento ubicado en Chihuahua ₄, viñedo Los Leones ubicado en Aldama (5), viñedo San Agus n ubicado en Satevó (6), viñedo Los Ojos de la Fe ubicado en Ahumada (7). Metodología Equipo Licuadora Potenciómetro (ph) Centrífuga Espectrofotómetro UVVisible Agitador magné co 3 12

5 La figura 5 muestra los resultados de madurez fenólica de las cinco variedades de uva analizadas. El porcentaje de Índice de Polifenoles Totales (%IPT) que en muchos lugares se usa para calificar la cosecha, varía con las condiciones de crecimiento de las viñas. El valor %EA nos indica la facilidad de extracción de antocianos durante la fermentación, por lo que se buscan valores cercanos al 100 %. El %SM se desea que sea pequeño (<30 %), puesto que niveles grandes nos indican taninos no polimerizados que serán fuertes al gusto. Podemos observar en la figura 6 que Cabernet Sauvignon cosechada en Cuauhtémoc (Hacienda Bus llos) presenta valores más deseables que la uva cosechada en Jiménez y Rosales. Cabernet Sauvignon es una variedad semitardía que se expresa mejor en zonas II y III Winkler. La uva Merlot cosechada en Satevó y Tempranillo cosechada en Hacienda Bus llos presentaron una mejor madurez fenólica. Merlot al igual que Tempranillo son variedades tempranas que se expresan mejor en zonas I, II y III Winkler. Malbec es una variedad temprana de zona II Winkler sin embargo se puede observar que en Sacramento (zona V Winkler) ha dado buenos valores de madurez fenólica. Por ul mo Syrah se ha comportado mejor en el viñedo Los Ojos de la Fe ubicado en Ahumada (zona V), incluso siendo una variedad media que se expresa bien en zonas III y IV. Reac vos Cloruro de potasio Ácido clorhídrico Alcohol e lico Ácido cítrico Citrato de sodio Agua des lada Solución A (método para preparar un litro de solución) 1. Pesar 3.72 gr de Cloruro de potasio (KCl). 2. Vaciar el KCl en un matraz de aforación de 1 lt, agregar agua des lada para disolver y añadir cuidadosamente 4.10 ml de ácido clorhídrico y 100 ml de alcohol e lico. 3. Aforar a la marca con agua des lada. 4. Ajustar el ph de la solución con ácido clorhídrico concentrado. Solución B (método para preparar un litro de solución) 1. Pesar 14.4 gr de ácido cítrico y 9.28 gr de citrato de sodio. 2. Vaciar el ác. cítrico y el citrato de sodio a un matraz de aforación de 1 lt, agregar agua des lada para disolver y 100 ml de alcohol e lico. 3. Aforar a la marca con agua des lada. 4. Ajustar el ph a 3.6 con ácido clorhídrico concentrado. Procedimiento En la licuadora, triturar 100 bayas a velocidad moderada durante ₁ minuto. La molienda no ene que ser en exceso y en la muestra resultante se enen que dis nguir las diferentes partes que conforman la uva. Cuando se trabaja con variedades de grano pequeño como Cabernet Sauvignon, el tamaño de la muestra debe aumentar a 120 bayas con el fin de obtener un homogeneizado uniforme. Preparar dos matraces conteniendo cada uno 22 gr de muestra triturada; 11 4

6 Preparar dos matraces conteniendo cada uno 22 gr de muestra triturada; agregar a uno de ellos 20 ml de la solución A y al otro 20 ml de la solución B. Cada una de las soluciones se analizará siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para obtener soluciones coloridas. Resultados del análisis de cuatro variedades de uva para vino de siete viñedos del estado de Chihuahua. Macerar durante 1 h con agitación a temperatura ambiente (2022 C). Terminada la maceración centrifugar a 3,000 rpm durante 20 min (Figura 3). Las muestras decantadas se diluyen según sea necesario dependiendo de la intensidad del color en 1:50 ó 1:100 y se analizan a 280 nm usando un espectrofotómetro UVVisible. Se hace evidente la necesidad de una dilución mayor cuando el espectrofotómetro arroja resultados fuera del rango de lectura o marca error. Madurez tecnológica Los resultados obtenidos de los análisis de madurez tecnológica de las muestras de uva se muestran en la ﬁgura 1. Como podemos observar todas las muestras se encuentran por arriba de 18 Brix, siendo ideal para la cosecha el rango de 2123 Brix. El ph de las muestras resulto en un rango de el ph ideal ~ y una acidez tulable entre 5.3 y 7.6 g/l ác. tartárico. Figura 3. Esquema de la extracción de compuestos fenólicos en uvas (Nadal y Mateos, 2010). Cálculos El potencial fenólico se calcula con las siguientes formulas: %EA = AntExtraibles x 100 AntTotales (1) %SM = Abs ph3.6 (AntExtraibles x 0.4) x 100 Abs ph3.6 (2) Figura 5 Donde: %EA=% de Extractabilidad, se desea que este valor sea lo mas alto posible. %SM= Madurez de la semilla, preferentemente este valor ene que ser menor a 60. AntExtraibles = Antocianos extraídos a ph 3.6. AntTotales = El total de antocianos potenciales extraídos a ph 1. 5 Figura 1: Cabernet Sauvignon CS), Merlot (MT), Tempranillo (TP), Malbec (MB) y Shiraz (SH). Viñedo La Gloria ubicado en Rosales (1), Viñedo ubicado en Jiménez (2), Viñedo Hacienda Bustillos ubicado en Cuauhtémoc (3), Viñedo Sacramento ubicado en Chihuahua (4), Viñedo Los Leones ubicado en Aldama (5), Viñedo San Agustín ubicado en Satevó (6), Viñedo Los Ojos de la Fe ubicado en Ahumada (7). 10

7 Procedimiento Para la determinación de compuestos fenólicos en uvas, triturar en la licuadora 100 bayas y filtrarlas usando un colador de cocina. Colocar el filtrado en tubos para centrífuga y centrifugar por ₁₅ min a 3,000 rpm. Tomar 200 µl de muestra y diluirla con 2,000µL de agua des lada usando micropipetas y mezclar bien. En el portamuestras del fotómetro Hanna y siguiendo estrictamente este orden agregar 200 µl de la muestra diluida, 5 ml de solución de HCl al 2% y 6 gotas del reac vo de FolinCiocalteau. Esperar 1 minuto y agregar 800 µl de la solución de Na₂CO₃ al 20 %. Aforar a la marca del portamuestras de 10 ml con agua des lada. Esperar 2 hrs a que la reacción se estabilice. Se puede programar el reloj del fotómetro, el cual sonará una alarma transcurrido el empo. Analizar la muestra en el fotómetro siguiendo las instrucciones del equipo. Método de RibéreauGayon y Stonestreet para la determinación de antocianos en el vino (decoloración por el sulfuroso) Introducción Los iones bisulfito (SO₃H) se combinan con los antocianos produciendo un compuesto incoloro. La reacción se produce en medio ácido para evitar la interferencia del sulfuroso agregado al vino y también la modificación de la materia colorante por formación de complejos con los metales. En estas condiciones la disminución del color es proporcional a la concentración de antocianos. Metodología Reac vos Alcohol ácido al 0.1% con ácido clorhídrico (HCI) Se prepara añadiendo 0.1 ml de HCl concentrado a un matraz de 100 ml y se afora a la marca con alcohol e lico de Ácido clorhídrico HCl al 2% Se prepara añadiendo 2 ml de HCl concentrado a un matraz de 100 ml y se afora a la marca con agua des lada. Cálculos El fotómetro Hanna indica la concentración de polifenoles totales en g/l de ácido gálico, no son necesarios cálculos adicionales. Sin embargo se recomienda hacer una curva de calibración estándar para determinar si los valores proporcionados por el equipo son correctos. Elaboración de la curva de calibración de ácido gálico Preparar una solución de 5 g/l de ácido gálico, agregando a un matraz de 100 ml, 0.5 g de ácido gálico, 10 ml de etanol y aforar a la marca con agua des lada. Para preparar soluciones de 2.5 g/l, 1.5g/L, 1g/L y 0.5g/L, se toman 12.5 ml, 7.5ml, 5ml y 2.5ml de la solución de 5 g/l, se colocan en un matraz de 25ml y se afora con agua des lada. 9 Bisulfito sódico al 30% Pesar 15 gr de Bisulfito sódico (NaHSO₃) y aforar a 100 ml con agua des lada. Mientras que las otras soluciones se pueden preparar con días de an cipación la solución de bisulfito se ene que preparar el día que se usa. Procedimiento En un tubo de ensayo agregar: 1 ml de vino o macerados previamente preparados (ph1 y ph3.6). En vinos con mucho color es necesario una dilución previa que puede ser 1:5 ó 1:10. 1 ml de Alcohol ácido 20 ml de HCI al 2% 6

8 La solución resultante se distribuye en dos tubos de ensayo que contendrán: Tubo 1 10 ml de la solución preparada 4 ml de solución de bisulfito sódico al 30% Tubo 2 10 ml de la solución preparada 4 ml de agua des lada Los tubos después de cerrados se agitan manualmente y se dejan reposar por 20 minutos para que se estabilice la reacción (Figura 4). Transcurridos los 20 min, se analizan las muestras u lizando la longitud de onda de 520 nm del espectrofotometro UVVisible y agua des lada como blanco. Cálculos El contenido de antocianos (mg/l) será: D.O. = D.O. Tubo2(agua) D.O. Tubo1(bisulfito) (3) Donde: D.O. es la densidad óp ca medida a 520 nm. Si esta diferencia está entre 0,043 y 0,43 lo consideramos un valor válido, si la diferencia es superior tendremos que diluir y el resultado final habrá que mul plicarlo por la dilución. Antocianos(mg/l) = D.O. x 875 x 2 (4) Nota: Cuando se decoloran las soluciones resultantes de los macerados a ph1 y ph3.6 obtenemos el valor de AntTotales y AntExtraíbles, que se u liza en las fórmulas (1) y (2). Figura 4. Resultado de las muestras después de agregar la solución de bisulfito sódico al 30 % en el tubo 1 y agua en el tubo 2, siguiendo la técnica de decoloración por el sulfuroso. 7 Método de FolinCiocalteau para la determinación de polifenoles totales en uva y vino Introducción Todos los compuestos fenólicos contenidos en la uva/vino son oxidados por el reac vo de FolinCiocalteu. Este reac vo está formado por una mezcla de ácido fosfotungsténico (H₃PW O ), y ácido fosfomolíbdico (H PMo O ), los cuales, después de la oxidación causada por los fenoles son reducidos a una mezcla de óxidos azules de tungsteno, (W₈O ) y molibdeno (Mo₈O ). La coloración azul produce una absorción en la región de nm y es proporcional a la can dad total de compuestos fenólicos presentes en la muestra. Metodología Equipo Fotómetro Hanna Hi83742 Licuadora Centrífuga Reac vos Reac vo de FolinCiocalteau (se adquiere comercialmente) Carbonato de Sodio (Na₂CO₃ Acido clorhídrico Hcl Solución de HCl 2% En un matraz de 100 ml colocar un poco de agua des lada y 2 ml de HCl concentrado. Aforar a la marca con agua des lada. Solución de Na₂CO₃ al 20% Pesar 20g Na₂CO₃ y agregar a un matraz de 100 ml conteniendo un poco de agua des lada. Disolver bien y aforar a la marca con agua des lada. 8