ENZIMAS & CINÉTICA ENZIMÁTICA

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1 APUNTES DE BIOQUÍMICA 3 ENZIMAS & CINÉTICA ENZIMÁTICA 1 Julián A. Chamucero Millares 1 L os catalizadores son sustancias que se caracterizan por: 1. Aumentar la velocidad de una reacción química 2. No se alteran en el proceso [no se consumen] 3. No interfieren en el estado de equilibrio de la reacción. Es decir, no cambiar la dirección de la reacción. En los sistemas biológicos, la mayoría de las sustancias catalizadoras son proteínas que reciben el nombre de enzimas. Las enzimas y cualquier catalizador actúa sobre otras sustancias a las que llamamos sustratos. En el siguiente ejemplo observamos la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno: H H Esta reacción está favorecida termodinámicamente, puesto que su ΔG es negativo y por lo tanto la dirección de la reacción se encuentra desplazada hacia la izquierda; sin embargo, la descomposición de 1 mol de peróxido de hidrógeno a condiciones ambientales puede tardar mucho más de un año. No obstante, la adición de una molécula de ión férrico es capaz de acelerar la velocidad de la reacción hasta 1000 veces; más aún, la hemoglobina incrementa la tasa en un millón de veces. El ejemplo anterior nos permite concluir dos cosas: 1. Existen sustancias que aumentan la velocidad de una reacción, y 2. El hecho de que una reacción sea termodinámicamente favorable; es decir, que su ΔG sea negativo, no significa en absoluto que la reacción ocurra a gran velocidad. Cómo se estudian las velocidades de las reacciones? El estudio de las velocidades de las reacciones es el campo de aplicación de la cinética química. Ésta rama de la química utiliza modelos y ecuaciones matemáticas para evaluar la velocidad a la cual una serie de sustancias reaccionan para formar unos productos, veamos: Consideremos una reacción química simple, A B 1 Médico Interno. Internado énfasis en investigación. Laboratorio de Biomiméticos Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia. 2012

2 donde la velocidad es igual a la concentración de B por unidad de tiempo: es decir, a la velocidad de la formación del producto. Donde la velocidad es igual a menos la concentración de A por unidad de tiempo; es decir, la velocidad a la que se consume el reactante. Dado que estamos considerando una reacción irreversible, existe una proporción lineal en la que: O sea que la velocidad a la que se forma el producto es la misma a la que se consume el reactante, por lo que podemos obtener una constante K de velocidad: Por lo que al intentar conocer los determinantes de la velocidad de una reacción, lo que queremos averiguar en sí, son las variables que afectan la constante de velocidad. Entre dichas variables tenemos la temperatura y el ph de la solución; sin embargo, la más importante es la BARRERA ENERGÉTICA DEL ESTADO DE TRANSICIÓN. El estado de transición es una fase de la reacción química en la que los reactantes adoptan una configuración intermedia para transformarse luego en productos. La importancia del estado de transición radica en que presenta un valor de ΔG muy grande el cual deben superar los reactantes para continuar el curso de la reacción; esto quiere decir que cuanto más alto sea el ΔG del estado de transición, más lenta será la reacción. Para que los reactantes alcancen ese nivel de energía se requieren mínimo 3 cosas: 1. Una adecuada disposición de las moléculas 2. Colisiones eficientes entre las moléculas 3. Precisa energética de las colisiones 2 Consideremos ahora la misma reacción, pero ésta vez con la particularidad de ser reversible: A B Por lo que ahora, Estas demostraciones nos permiten tener un conocimiento básico de las velocidades de una reacción y de sus respectivas constantes de velocidad, empero, qué determina la velocidad de una reacción química? Primero que todo es importante conocer el significado del valor de K: Una k alta indica una reacción rápida Una k baja indica una reacción lenta Recordemos ahora que la energía libre del estado de transición se define por: ΔG ǂ = ΔH ǂ - T. ΔS ǂ Entonces si H es alto y S es bajo, el ΔG será mayor a cero, por ende la reacción será lenta. Esto nos indica que una reacción tendrá una constante de velocidad baja entre mayor sea la energética de las colisiones y

3 menor desorganización haya en el sistema; es decir, donde el movimiento de las moléculas tienda a la no aleatorización y disminuya entonces la adecuada disposición y las colisiones de las mismas. Cómo trabajan las enzimas? Las enzimas actúan en dos puntos críticos: 1. Disminuyen la barrera energética de la reacción 2. Aumentan la fracción de las moléculas reactantes Como hemos indicado, la barrera energética se define por: ΔG ǂ = ΔH ǂ - T. ΔS ǂ Modelos del mecanismo de acción de las enzimas Reconocemos ahora que las enzimas disminuyen el valor de ΔG ǂ [energía libre de Gibbs estándar del estado de transición] facilitando la formación de un estado similar al estado de transición. Para que ello sea posible, el sustrato se une a una región aminoacídica específica denominada sitio activo donde ocurre la formación de dicho estado. Para explicar la interacción del sustrato con el sitio activo de la enzima, se han planteado 2 modelos o hipótesis: 3 Y lo que debe hacer una enzima es permitir una reacomodación de los valores de entalpia y entropía para aumentar la velocidad de la reacción: Para disminuir ΔH, el sustrato adopta dentro del sitio activo de la enzima una configuración molecular diferente con menor energía. Para aumentar ΔS, la enzima ajusta la dirección de los sustratos para favorecer la colisión. 1. El primero de ellos fue postulado hacia el año 1894 por un bioquímico alemán llamado Emili Fischer. El pretendía explicar que el sustrato se une a la enzima del mismo modo que una llave encaja perfectamente en una cerradura; sin embargo, este modelo sólo explica la especificidad de las enzimas pero no responde a la pregunta de cómo se consigue formar un estado configuracional similar al del estado de transición. 2. Posteriormente Daniel Koshland proponía en 1958 un modelo diferente al que llamó del ajuste inducido. Esta hipótesis plantea que el sitio activo de la enzima induce al sustrato y a la misma enzima a

4 adoptar una configuración molecular diferente. Teniendo en cuenta esta modificación del modelo previo, la hipótesis del ajuste inducido explica tanto la especificidad como las características propias de la catálisis enzimática [disminución de la barrera energética]. residuos de aminoácidos importantes: a. La histidina que actúa como donadora de protones b. El glutamato que funciona como aceptor de protones Durante la catálisis se forma un compuesto intermediario de menor energía llamado enediol, ya que, el glutamato acepta un protón del carbono 2 [C 2 ] del gliceraldehido-3- fosfato y el residuo de histidina dona un protón al grupo carbonil del mismo G3P. 4 Ahora, si bien es cierto que la estructura completa de la enzima es importante, debido a que la secuencia completa de aminoácidos es la que permite el diseño específico de cada tipo de enzima, es el sitio activo quien juega el papel más substancial en la función catalítica de la enzima. Veamos 2 ejemplos para reconocer por qué. 1. Triosa fosfato isomerasa. Esta enzima como su nombre lo indica isomerisa las triosas fosfato. Un ejemplo es el cambio del gliceraldehido-3-fosfato a dihidroxiacetona-fosfato. El sitio activo de la enzima contiene 2 2. Serina proteasas. Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos. Las serina proteasas son proteasas en las cuales el residuo de serina del sitio activo es el que juega el papel fundamental en la actividad catalítica. Dos ejemplos de esta clase de enzimas son la tripsina y la quimotripsina. El sitio activo de las enzimas está formado por los residuos aspartato, histidina y serina; ésta última se ubica justo

5 al lado del bolsillo donde se posará la cadena lateral del residuo de aminoácido en el cual la enzima corta el enlace peptídico. Ya que todas las serina proteasas tienen los mismos residuos en el sitio activo, éstas se diferencias por la característica del bolsillo que fija la cadena laretal del residuo específico para el que trabaja la enzima. La constante de velocidad de la reacción entre la enzima y el sustrato está dada por la suma entre la constante de disociación del complejo enzima sustrato en enzima y sustrato (K -1 ) y la constante de disociación del complejo en enzima y producto (K 2 ). K 1 [E][S] = K -1 [ES] + K 2 [ES] Sacamos factor común K 1 [E][S] = {[ES] (K- 1 +K 2 )} Despejamos la concentración del complejo enzima sustrato ( ) 5 Encontramos una constante de equilibrio general para toda la reacción Reemplazamos en la ecuación anterior ( ) (1) Despejamos y obtenemos la concentracion del complejo enzima sustrato en la constante de quilibrio en términos de la concentración de la enzima y el sustrato K M [ES] = [E] [S] (2) C inética enzimática La cinética enzimática estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas. Consideremos lo siguiente: La reacción entre la enzima y el sustrato incluye la formación de un complejo enzima-sustrato E + S ES E+P K-1 K1 K2 Teniendo en cuenta que cuantificar la concentración del complejo enzima-sustrato es en términos prácticos algo imposible, consideremos que la concentración de la enzima después de la reacción es igual a la suma de la concentración de la enzima total menos la del complejo [E] f = [E] T [ES] (3) Reemplazamos esta ecuación en la igualdad número 2 K M [ES] = {[E] T [ES]}. [S]

6 K M [ES] = [E] T [S] [ES][S] Organizamos términos para obtener una formulación que nos permita calcular la concentración del complejo con valores que si podamos medir K M [ES] + [ES][S] = [E] T [S] [ES] (K M + [S]) = [E] T [S] (4) Ahora, partiendo que la reacción inicia desde el complejo enzima-sustrato ya formado, la velocidad de la reacción está dada por: v = K 2 [ES] Reemplazamos este término en la ecuación número 4 v = K 2 (5) Llegado el momento, hay un punto de saturación de la concentración total de la enzima por el sustrato, por lo que la reacción llega a su velocidad máxima: v max = K 2 [E] T Establecemos este término en la ecuación número 5 v = (6) Esta es la ecuación final del análisis de cinética enzimática y se denomina ecuación de Michaelis Menten y K M es la constante de Michaelis. Cuál es la interpretación de KM? Revisemos la siguiente fracción de la constante: Si K M tiene un valor mayor a cero [>0] nos indica que, K -1 >k 1, por lo que hay una disociación rápida del sustrato. De este modo, una primera aproximación a la constante de Michaelis es la de la afinidad por el sustrato, por lo que, entre más grande sea el valor de K M menor será la afinidad. No obstante, la interpretación real es que la K M constituye un valor numéricamente igual a la concentración del sustrato ([S]) a la que la la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima; es decir, v max /2. Ejemplo: los valores de KM para la tripsina y la quimotripsina son: Tripsina: 1.5 x10-2 M Quimotripsina: 3 x10-4 M Esto quiere decir que se nececita una solución de sustrato en una concentración de 0,015 M para conseguir la mitad de la velocidad máxima de la reacción. Supongamos que la v max = 10 moles/s; o sea, que en un segundo la enzima cataliza 10 moles de sustrato. Cuando el sustrato alcanza una concentración de 0,015 M, la enzima cataliza la reacción de 5 moles de sustrato por segundo. Si comparamos los valores de K M para ambas enzimas, la tripsina requiere una concentración menor que la quimotripsina para conseguir la mitad de la velocidad máxima de la reacción. Para los diferentes estudios experimentales con enzimas, la tabulación y diagramación de los datos, se facilita el uso de una transformación algebráica de la ecuación de michaelis-menten. Al obtener los recíprocos a ambos lados de la igualdad y organizando los términos, obtenemos una ecuación que obedece a la formulación de línea recta: 6 y = (m) (x) + b

7 Esta igualdad se conoce como la ecuación de Lineweaver-Burk y permite hacer una gráfica en línea recta denominada representación doble-inversa que presenta: Una pendiente Una intercepción de sobre el eje (o sea el eje y) Una intercepción de sobre el eje de (o sea el eje x] 1. Inhibidor competitivo: se caracteriza por ser una molécula estructuralmente similar al sustrato original, por lo que, dependiendo de la concentración de uno y el otro, compiten por ocupar el sitio activo de la enzima. A mayor concentración del inhibidor, menor será la concentración de sustrato que sea catalizado por la enzima. La enzima dihidrofolato reductasa en una enzima encargada de participar en la síntesis de purinas y pirimidinas a partir de las reacciones con el dihidrofolato. Debido a que la síntesis del DNA y el RNA dependen de la formación de nucleótidos en los que participan las bases de purina y pirimidina, se desarrolló una molécula análoga al dihidrofolato conocida como metotrexate y que actualmente se usa entre otras cosas para el tratamiento quimioterapéutico del cáncer, con lo cual se inhibe la división celular por disminución de la síntesis de las bases constituyentes de los nucleótidos. 7 Inhibición enzimática Las enzimas son macromoléculas cuya función catalítica es susceptible de ser inhibida, existen dos grandes grupos de inhibidores: 1. Inhibidores reversibles 2. Inhibidores irreversibles La diferencia entre ellos radica en el tipo de enlace que forman con la enzima, el primero de ellos utiliza enlaces o fuerzas de interacción débiles, mientras que el segundo lo hace a travpes de enlaces covalentes. De acuerdo al sitio de unión del inhibidor, los inhibidores reversibles se dividen en 3 tipos: 2. Inhibición acompetitiva: en ella, el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima sustrato y por obvias razones en una región diferente al sitio activo de la enzima.

8 C aracterísticas cinéticas de los inhibidores Los experimentos que determinan las velocidades de reacciones catalizadas a diferentes concentraciones de sustrato y del inhibidor, permiten distinguir las características cinéticas de los diferentes tipos de inhibidores: 8 3. Inhibición no competitiva: en ella tanto el sustrato como el inhibidor pueden fijarse a la enzima y actúa disminuyendo el número de recambio de sustrato. 1. Inhibidor competitivo: ya que la molécula análoga desplaza al sustrato del sitio activo, la K M aparente aumenta, ya que hablando en términos del sustrato - se requiere mayor concentración del sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima de la reacción. Ahora, hablando en términos de la reacción en si, independientemente de qué molécula ocupe el sitio activo sea sustrato o inhibidor la velocidad máxima de la reacción se conseguirá cuando la concentración de alguna de las dos moléculas sature la concentración de enzima disponible, por lo que finalmente, la v max no cambia. 4. Inhibición mixta: se caracteriza porque el inhibidor puede unirse tanto a la enzima como al complejo enzima sustrato, prevenir la unión del sustrato o disminuir el recambio. 2. Inhibición acompetitiva: el inhibidor acompetitivo sólo se une al complejo enzima sustrato ya formado y bloquea la formación del producto. Ya que la enzima libre tiene ahora mayor concentración de sustrato disponible, la velocidad

9 máxima de la reacción es más fácil de alcanzar, por lo que el valor de v max disminuye. Si el valor de v max disminuye, significa que se requiere una concentración menor de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por ende la K M aparente también disminuye. 4. Inhibición mixta:dado que actúa tanto en la enzima como en el complejo enzima sustrato, aumenta la K M y disminuye el valor de v max 9 3. Inhibición no competitiva: como mencionamos, el inhibidor no competitivo se une a una región diferente al sitio activo de la enzima por lo que no interfiere con la unión del sustrato y por ende la concentración para alcanzar la mitad de la velocidad máxima sigue siendo la misma y la K M no se ve alterada; sin embargo, como el inhibidor si retrasa el efecto catalítico, y la enzima demora en disociarse, hay menos enzimas libres para una concentración mayor de sustrato por lo que la velocidad máxima se alcanza más rápido y el valor de v max disminuye. En relación a los inhibidores irreversibles, en general son sustancias tóxicas que se unen de manera covalente al sitio activo de la enzima y bloquear su actividad catalítica. Los podemos dividir en: 1. Reactivos de grupo específico: son moléculas que reaccionan con cadenas laterales específicas de algunos residuos de aminoácidos en el sitio activo. 2. Sustratos análogos reactivos: son moléculas estructuralmente similares a los sustratos nativos pero que se unen de manera covalente al sitio activo de la enzima. 3. Inhibidores suicida: son moleculas similares al sustrato que se caracterizan por permitir una reacción catalítica; sin embargo, los productos resultan ser intermediarios tóxicos que se unen de manera covalente a la enzima y la inactivan.

10 M ecanismos de regulación enzimática Como cualquier otro mecanismo dentro de los seres vivos, la catálisis de las reacciones bioquímicas deben ocurrir en el lugar y el tiempo adecuados, por lo que se hace necesaria una regulación de la actividad enzimática. Se han descrito 5 mecanismos reguladores: 1. Control alostérico: ocurre en aquellas enzimas de naturaleza proteíca que contienen múltiples subunidades que actúan como sitio funcional y sitio de control. Presentan además una propiedad llamada cooperatividad de unión y que quiere decir que la unión de una molécula a un sitio control o funcional afecta la actividad de los demás sitios o subunidades. Si ese control cooperativo se da por la unión al sustrato, el mecanismo se denomina homoalosterismo; mientras que, si la cooperatividad es por otras moléculas diferentes al sustrato, la regulación es del tipo heteroalosterismo. Este tipo de enzimas no obedecen la cinética de Michaelis-Menten puesto que su comportamiento no se refiere a la unión de una sola molécula de sustrato al sitio activo sino de varias moléculas a los sitios funcionales. Un ejemplo clásico de enzima alostérica es la aspartato carbamoiltransferasa [ATCasa], una proteínas con estructura cuaternaria que incluye 6 unidades catalíticas unidad por 6 unidades reguladoras. La ATCasa cataliza la primera reacción de la biosíntesis de las pirimidinas que incluye la condensación del carbamoil fosfato y el aspartato para formar carbamoilaspartato. De la secuencia de la reacción de síntesis se obtiene un nucleótido de pirimida llamado citidin trifosfato [CTP] el cual cuando comienza a acumularse se une a uno de los sitios regulares de la enzima e inhibe su actividad indicando que ya se sintetizó la suficiente canditad de nucleotidos necesarios. 2. Diferentes formas de la enzima: hace referencia a las isozimas o isoenzimas, enzimas estructuralmente diferentes pero que catalizan la misma reacción; sin embargo, varían sus parámetros cinéticos y sus mecanismos de regulación. Dos ejemplos de esta clase de enzimas son la lactado deshidrogenasa, una enzima que participa en la glucólisis anaerobia y que presenta 2 isoenzimas, una en el músculo cardiaco y otra en el músculo esquelético y mostrándo diferente afinidad por la glucosa entre ambos tejidos. El segundo ejemplo lo constituye la glucoquinasa, una isoenzima de la hexoquinasa presente en el tejido hepático pero con menor afinidad por la glucosa para un adecuado control de los niveles de liberación de insulina y glucagón. 3. Modificaciones covalentes reversibles: es un elemento regulador abundante en los mecanismos de señalización intracelular e involucra la unión covalente reversible de grupos fosfato para la activación o inactivación de las enzimas. Una de las enzimas encargadas de la fosforilación [activación] de otras enzimas es la protein cinasa K que cataliza la reacción de transferencia de un grupo fosfato desde el ATP hacia un residuo de aminoácido de otra enzima. 4. Activación proteolítica: son enzimas que son sintetizadas en un estado inactivo o zimógenos y que requieren de un clivaje proteolítico para su activación. El tripsinógeno [el zimógeno de la tripsina] es sintetizado en el páncreas y secretado al duodeno donde es 10

11 activado por la enteroquinasa intestinal. 5. Síntesis de la enzima: es el control absoluto y está mediado por la expresión génica y la síntesis de mrna. Bibliografía 11 Mathews, C.K.; Van Holde, K.E.; Ahern K.G.(2002). Enzimas: catalizadores biológicos. Bioquímica. (pp )Pearson Education, S.A., Madrid. Nelson, D.L & Cox, M.M. (2008) Enzymes. Lehninger. Principles of Biochemistry. (pp ). W.H. Freeman and Compañy, New York. Berg, J.M.; Timoczko, J.L.; Stryer Lubert (2007) Enzymes: basic concepts and kinetics. Regulatory Strategies Lehninger. Principles of Biochemistry. (pp , ). W.H. Freeman and Compañy, New York.