RESPUESTA DE TRIGO DURO A LA INOCULACIÓN DE Azospirillum sp EN LA GERMINACIÓN Y VIGOR

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1 RESUMEN RESPUESTA DE TRIGO DURO A LA INOCULACIÓN DE Azospirillum sp EN LA GERMINACIÓN Y VIGOR Blanca Araceli Rojas Méndez 1 Rosalinda Mendoza Villarreal 1 Karla Mellado 2 Alejandra Torres Tapia 1 Leila Minea Vázquez Siller 1 Ante la creciente demanda mundial de alimentos, surge la necesidad de investigar sobre los efectos benéficos que pueden aportar las rhizobacterias como el Azospirillum sp., al incrementar la germinación por la síntesis de hormonas del crecimiento y la producción a cultivos como el trigo Triticum durum. Este estudio se realizó en condiciones de laboratorio de Tecnología de Granos y Semillas de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Buenavista, Saltillo, México en el Con el objetivo de evaluar la respuesta fisiológica de germinación y vigor al aplicar Azospirillum sp con 10 6 UFC ml -1 en cuatro variedades de semilla de trigo duro (Sofía-2000, Jupare 2001, Río Colorado-2001 y Altar-1984), asignadas en un diseño completamente al azar con arreglo factorial, en cuatro repeticiones, se evaluaron: porcentaje de germinación (GER), longitud media de plúmula cm/plántula(lmp), tasa de crecimiento de plántula (PS), % de vigor en envejecimiento acelerado (EA), longitud media de plúmula después del envejecimiento acelerado cm/plántula (LMP/ EA) y tasa de crecimiento de plántula (peso seco) después del envejecimiento acelerado (mg/plántula) (PS/EA). El análisis de varianza y DMS mostraron diferencias altamente significativa entre las variedades evaluadas, tratamientos con inoculo y sin inoculo de Azospirillum sp y en la interacción variedades x tratamientos; encontrando que en el testigo, Jupare-2001 y Altar-1984 se comportaron positivamente con la adición de Azospirillum, esto aumentó 11% en Jupare-2001 y 3% en Altar Se observó un mayor LMP en la variedad Sofía y Altar sin el inóculo bacteriano. Se concluye que las variedades Jupare-2001 y Altar-84, incrementaron: % de germinación, longitud de plúmula, y vigor. PALABRAS CLAVE: Semilla, Rizobacteria, Azospirillum, germinación y vigor. INTRODUCCIÓN En los últimos años, se han utilizado varias especies de microorganismos en la agricultura para aprovechar los productos y subproductos de sus metabolismos para obtener un beneficio, ya sea por su participación en el control biológico de hongos y bacterias o por su capacidad para la fijación del nitrógeno atmosférico (Zhang et al., 1996). Los microorganismos en asociación con cultivos, se utilizan para el mantenimiento de la biodiversidad y la sostenibilidad de los ecosistemas (Lynch, 2002; Osinski et al., 2003). Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal, también denominadas PGPR (Plant Growth Promoting Rizobacteria), que habitan en la rizosfera de las plantas pueden tener un efecto positivo sobre los cultivos (Puente y Peticari, 2006).Los resultados de 20 años de estudio han demostrado que entre el 60% y 70 % de los experimentos llevados a cabo han tenido éxito con crecimiento significativo en la producción 1 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro UAAAN. ara_uaaan@hotmail.com

2 que varia entre un 5% y un 30%.(Dekhil., et al 1997).Azospirillum sp. es una bacteria móvil la presencia de flagelos en su estructura le proporciona la movilidad necesaria para dirigirse a lugares donde obtenga los nutrientes ya que presenta quimiotaxis positiva hacia los ácidos orgánicos, azúcares, aminoácidos, compuestos aromáticos y hacia exudados radicales, esta capacidad de migración es muy dependiente de la humedad del suelo. Este comportamiento permite que la bacteria se dirija a un nicho ecológico apropiado de la rizosfera donde pueda producir sustancias promotoras de crecimiento (Dobbelaere et al., 2001), entre las sustancia promotoras de crecimiento que se han encontrado en sobrenadantes son las giberelinas, auxinas y citoquininas, la fitohormona mas importante en términos cuantitativos es la auxina acido3-indol-acético (AIA), la producción de esta fitohormona por la bacteria se asume que es la causante de los cambios detectados por el sistema radical tras la inoculación de Azospirillum sp. Lo cual se relaciona con una mejor absorción de nutrientes Okon., 1986 menciona, que pueden proteger a los vegetales ante situaciones de estrés biótico (Ayrault 2002). La inoculación con Azospirillum en semillas permitiría reducir las elevadas cantidades de fertilizantes químicos que generalmente se aplican y con ello disminuir el costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción. Un estudio realizado por Canto-Martín et al., 2004 para determinar el efecto de la inoculación se colocaron grupos de 25 semillas de C. chinense en placas de Petri (con un total cuatro cajas para cada tratamiento) sobre dos capas de papel filtro húmedo y se conservaron a C en la oscuridad. Los resultados sobre la capacidad de germinación de las semillas mostraron que en los tres tratamientos No aumentó ni disminuyó la capacidad de germinación de las semillas; sin embargo, la inoculación con Azospirillum sp. Aceleró en un día, el proceso de germinación. En el caso del tratamiento con el medio de cultivo la capacidad de germinación de la semilla inoculada fue similar a la del control. Por lo anterior, se planteó el siguiente objetivo para estudiar el efecto de la inoculación de Azospirillum sp a 10 6 UFC ml -1, en semilla de cuatro variedades de trigo duro (Triticum durum) tratadas con fungicida, con y sin inóculo para evaluar la respuesta fisiológica de germinación y vigor. MATERIALES Y METODOS El estudio se realizó en el Laboratorio de Ensayos de Calidad en Semilla del Centro de Capacitación y Tecnología de Granos y Semillas de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Se utilizaron cuatro variedades de trigo duro, Sofía-2000, Jupare.2001, Río Colorado y Altar-1984, estas fueron de categoría certificada (tratada con fungicidas) y comercializada en el norte de México. T1, semillas inoculas con bacterias y T2 sin inocular, antes de la inoculación, las variedades con químico se lavaron con tween 20 para quitar el exceso de fungicida. Se inocularon las semillas con biofertilizante nitrogenado liquido, formulado con la cepa de Azospirillum sp. (10 6 UFC ml -1 ) aislada de raíces de trigo colectadas de Buenavista, Coahuila y reproducidas en medio NFb y agar rojo congo a 28º C (Rodríguez Cáceres, 1982). Se evaluó el Porcentaje de germinación (GER) de acuerdo a las reglas de la International Seed Testing Association (ISTA, 2004), utilizando cuatro repeticiones de 25 semillas por variedad y tratamiento, sembrando entre papel de germinación Anchor previamente humedecido, enrollando el papel con las semillas en forma de taco, una vez hechos, se colocaron en bolsas de polietileno y estas, en una canastilla en una cámara germinadora a 25º C con 8 horas luz y 16 horas de oscuridad. Para su evaluación se cuantificaron las plántulas normales, anormales y semillas sin germinar o muertas a los seis días, identificadas como tales conforme al manual de evaluación de plántulas de la ISTA (1992). El vigor mediante la prueba de envejecimiento acelerado (EA) con el método de la Association of Official Seed Analysts (AOSA), colocando 200 semillas por variedad por tratamiento en una cámara con una humedad relativa de %, por un tiempo de 48 horas a 42º C. Al finalizar el periodo de envejecimiento se realizó una prueba de germinación tal como se describió

3 anteriormente, con cuatro repeticiones de 25 semillas, para la evaluación se hizo conforme a la ISTA (1992). Vigor mediante longitud media de plúmula (LMP). Se utilizaron cuatro repeticiones de 25 semillas por variedad y tratamiento, utilizando la metodología descrita por Perry (1977); donde al papel de germinación se le trazaron paralelas a cada 2 cm de distancia a partir de la media del papel, se sembraron las 25 semillas en la línea inicial-central del papel, se colocó una papel encima y se procedió a enrollar, una vez hecho los tacos, se colocaron en bolsas y se llevaron a la cámara de germinación a 25º C con 8 horas luz y 16 horas de oscuridad. Para su evaluación, se cuantificó las plántulas normales de seis días después de la siembra, las cuales se evaluaron en la paralela correspondiente, determinando al final la sumatoria del número de plúmulas por la paralela entre 25 (que son el número de semillas sembradas); las plántulas normales se identificaron según la ISTA (1992). Adicionalmente se determino esta variable después de someter a la semilla a envejecimiento acelerado con el fin de evaluar el vigor con más severidad. Vigor mediante la tasa de crecimiento de plántula llamado peso seco (PS). Se utilizaron cuatro repeticiones de 25 semillas por genotipo; realizando la metodología de esta prueba según las reglas de la AOSA (1983). Haciendo el mismo proceso que para una prueba de germinación con la diferencia que a los tacos no se les agregó más humedad que la inicial. Alos seis días después de la siembra se evaluaron las plántulas normales conforme a la ISTA(1992). Una vez evaluadas las plántulas se colocaron en bolsas de papel de estraza perforadas y se colocaron en una estufa u horno de secado a 65 ºC por 24 horas, una vez transcurrido el tiempo se colocaron en un desecador hasta enfriar y se procedió a pesar en una balanza analítica de gr presión. Al igual que en la variable anterior, se realizó otra determinación después de un envejecimiento acelerado aplicado a la semilla. Se utilizó un diseño completamente al azar f con arreglo factorial con cuatro repeticiones. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Porcentaje de germinación Los resultados del análisis de varianza mostraron una diferencia altamente significativa entre las variedades evaluadas, tratamientos con inoculo y sin inoculo de Azospirillum sp y en la interacción variedades x tratamientos.; encontrando que en el Testigo, Jupare-2001 y Altar-1984 se comportaron de manera positiva con la adición de Azospirillum ya que aumento de un 11% en Jupare-2001 y un 3% en Altar-1984, (Cuadro 1). Aunque no todas las variedades de trigo duro tuvieron incremento en la germinación (se logró observar que el inóculo de la bacteria tiene un efecto positivo) con la adición de Azospirillum lo que ayuda a estimular el desarrollo vegetal como lo mencionaron Schnak et al. (1981); Smith et al. (1984). Envejecimiento Acelerado (EA) En lo correspondiente al vigor determinado mediante la prueba de envejecimiento acelerado, los resultados del ANVA mostraron que existió una diferencia (P< 0.01), entre las variedades y los tratamientos así como la interacción (Cuadro 1); que en forma general la tendencia en todos las variedades se comportaron en forma similar al testigo, con una reducción en el vigor con la adición de Azospirillum (de 27 a 16 %), una explicación posible fue que, la semilla cuando se sometió al envejecimiento tuvo un deterioro parcial en sus reservas, que como resultado bajo su porcentaje de germinación, aunado a esto, el efecto de microorganismo-ambiente al que se sometió la bacteria, ya que el ambiente tenía una humedad relativa y temperatura alta, provocó la muerte de bacterias, por lo que se acentuó aún más la baja de vigor en la semilla, provocando aumento en las anormalidades de las plántulas (Cuadro 1)

4 Cuadro 1. Prueba de comparación de medias (DMS) para las variables estudiadas en cinco variedades de trigo duro (Triticum durum) sin y con inóculo (*) de Azospirillum sp. FV GER (%) LMP (cm/pl) PS (mg/pl) VIGOR EA (%) LMP EA (cm/pl) PS EA (mg/pl) Jupare 82.0 b 6.10 de c 77.0 ab 7.55 bc c Río Colorado 92.0 a 8.48bc 15.20ab 78.0 ab 9.54 a b Sofía 93.0 a 9.78 b a 86.0 a 9.86 a a Altar 71.0 c 6.51 de 8.82 cd 56.0 ab 5.82 c 8.82 cd Jupare* 93.0 a a a 66.0 ab 6.74 bc a Río Colorado* 39.0 d 3.17 f 4.96 d 60.0 ab 4.30 c 4.96 d Sofía* 73.0 c 6.89 de 9.10 cd 59.0 ab 5.55 c 9.10 cd Altar* 74.0 c 7.52cd c 40.0 b 4.06 c c GER = Porcentaje de germinación; LMP= Longitud media de plúmula cm/plántula; PS = Tasa de crecimiento de plántula (peso seco, mg/plántula); EA = Porcentaje de vigor en envejecimiento acelerado; LMP/ EA = Longitud media de plúmula después del envejecimiento acelerado cm/plántula; PS/EA = Tasa de crecimiento de plántula (peso seco) después del envejecimiento acelerado (mg/plántula). Longitud Media de Plúmula (LMP) En esta variable, el resultado de ANVA, mostró una diferencia altamente significativa, y en la comparación de medias se observó un mayor LMP en la variedad jupare y altar sin el inoculo bacteriano, provocando un estimulo en su desarrollo en la parte área de la planta o en el incremento de la biomasa aérea (Díaz, 2002), esta misma tendencia la presentaron tanto el coincidiendo también en esta respuesta de LMP con lo descrito por Schnak et al., 1981; Smith et al., 1984, pero solo para ciertas variedades, ya que para Río Colorado-2001, Sofía-2000 y Altar. Presentaron una respuesta negativa. Peso Seco (PS). Como era de esperarse esta variable, mostró una diferencia altamente significativa, ya que al obtener respuesta en LMP se reflejo en PS, ya que en la comparación de medias se observó un mayor PS nuevamente en Jupare-2001 en el T2 con mg/plántula, mientras que en T1 obtuvo mg/plántula, corroborando una vez más lo escrito por Díaz (2002), presentando esta misma tendencia tanto el testigo como Altar-1984 coincidiendo también con Schnak et al. (1981); Smith et al. (1984), sin embargo, como en la variable anterior solo para ciertas variedades, ya que para Río Colorado-2001 y Sofía-2000 presentaron una respuesta negativa en el T2 disminuyeron su vigor drásticamente También, como se mostró en la variable de LMP después del envejecimiento acelerado mostró una diferencia altamente significativa entre las variedades y entre los tratamientos, así como en su interacción, se obtuvieron al igual efectos negativos en el vigor mediante el envejecimiento acelerado, por las mismas causas que LMP después de envejecida la semilla, sin embargo, la respuesta en el testigo no marcó nuevamente lo esperado ya que volvió a comportarse con un incremento en su PS en las variedades de inoculo bacteriano.

5 CONCLUSIONES Estos resultados muestran que la inoculación de Azospirillum sp en las semillas de trigo duro puede ser una alternativa factible para mejorar la germinación y el vigor mediante la longitud media de plúmula. Las variedades Jupare-2001 y Altar-84, incrementaron la germinación, la longitud de plúmula, y el vigor. Las bacterias de Azospirillum no estimulan el crecimiento en altura de la plántula (LMP) en trigo duro, quizás porque la concentración 10 6 UFC ml -1 no fue suficiente para incrementar la síntesis de hormonas del crecimiento y detectar diferencia en las variedades Sofía y Río colorado. LITERATURA CITADA Association of Oficial Seed Analysts (AOSA) Seed vigor testing handbook. Contribution No. 32 The Handbook of oficial Seed. United Status of America. 88p. Association of Official Seed Analysts (AOSA) Seedling evaluation handbook. Contribution No. 35 The Handbook of oficial Seed. United Status of America p. Ayrault, G Estudio sobre la factibilidad del uso de Azospirillum para mejorar la calidad germinativa y el establecimiento de Lactuca sativa y Daucus carota bajo estrés salino. Balcarce. 6p. Baldani, V. D. Lucia, and J. Dobereiner Host-plant specificity infection of cereals with Azospirillum spp. Soil Biol. Biochem. 12: Canto, M.J.; S. Medina y Morales A. Efecto de la inoculación con Azospirillum sp. en plantas de Chile Habanero(Capsicum chinense Jacquin) Tropical and Subtropical Agroecosystems. Mexico. Vol 4. 7 p. Dekhill, B., Cahill, M., Stackebrandt, E., Sly,.LI Transfer of conglomeromonas Largomobilis subsp Largomobilis to the genusazospirillum Microbiol 20: Díaz-Z.; Baliña R.; Fernández C. y Perticari A Rendimiento de cultivos de trigo en la región Pampeana inoculados con Azospirillum brasiliense. Argentina. 6p. Dobbeleare, S., Croonenborghs,. A This, A.,Ptacek, D.,Okon And Vanderleyden, j., 2002.Effect of inoculation whit whild type Azospirillum brasilence and Azospirillum irakense starin of development and Nitrogen uptake of spring wheat and grain maize. Biology and Fertility of Soils. 36(4) : Moreno, M. E Análisis físico y biológico de semillas agrícolas. 3ª. Edición. Instituto de Biología. UNAM. México. D.F. pp , 237. Okon, y. and Kapulnik Y., Development and function of Azospirillum inoculated Root plant soil.90: 3-16.

6 Perry, D. A A vigor test for seeds of barley (Hordeum vulgare) based on measurement of plumule growth. Seed Science and Techonology 5, Puente, M. y Peticari Alejandro Promotores del crecimiento vegetal. Características y uso potencial en el agro argentino. Revista de los CREA. Año XXXVI- N 304: Rodríguez- Cáceres Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Appl. Environ. Microbiol.44: Schank, S. C., and Smith, R. L Status and evaluation of associative grass-bacteria N2- fixing systems in Florida. Proc. Soil Crop Sci. Soc. Fla. 43: Zhang F., Narges D., Hynes R.K. y D.L. Smith Plant growth promoting rhizobacteria and soybean (Glycine max L. Merr) nodulation and nitrogen fixation at suboptimal root zone temperatures. Annals of Botany. 77: