Tigmomorfogénesis. La señalización celular

Transcripción

1 Tigmomorfogénesis En la naturaleza, las plantas están expuestas a los vientos, lluvias, a ataques de animales, por ello las plantas han desarrollado mecanismos para detectar y responder a sus entornos dinámicos. Algunas plantas responden a los estímulos en cuestión de segundos, debido a la presencia de células especializadas que forman parte de la maquinaria de la planta para realizar la respuesta táctil, mientras que otros muestran alteraciones morfogenéticas durante largos períodos de tiempo, que van desde días hasta semanas, debido a que no tienen estas células especializadas. Marque Jaffe en 1973 fue el primero en introducir el término thigmomorfogénesis para describir estas respuestas mecánica inducida (Thigma es la palabra griega para el tacto), por tanto la tigmomorfogénesis es la suma de las respuestas bioquímicas, morfológicas y fisiológicas creadas por la planta en respuestas a estímulos mecánicos. Estas respuestas están mediadas por diversos factores como fitohormonas, incluyendo el calcio intracelular, jasmonatos, etileno, ácido abscísico, etc... Un ejemplo de los cambios mostrados por Arabidopsis se muestra en la figura. 2. Otro ejemplo, tocar Mimosa pudica hace que sus hojas se plieguen en 1 seg. Otras respuestas incluyen alteraciones en contenido de clorofila, los niveles hormonales, resistencia al estrés biótico (animales) y abiótico (y el ambiente como piedras), tiempo de floración, etc. Algunas respuestas pueden ser adaptativas y causar un fortalecimiento de los tejidos mientras que otros causan la relajación del tejido alterado. Los tejidos jóvenes tienen una fuerte respuesta tigmomorfogenética en comparación con los antiguos. Esto puede ser porque los tejidos jóvenes tienden a ser más frágiles y susceptibles a las tensiones y por lo tanto debe responder fuertemente para sobrevivir a los duros estímulos ambientales. La señalización celular La respuesta tigmomorfogenética es saturable, es decir que llega un momento que la planta aunque siga percibiendo estímulos no puede crear más cantidad de respuesta, depende de la cantidad de estímulo que reciba, y es sistémica, es decir, el estímulo puede trasladarse a otra parte de la planta, que no ha sido perturbada. Las respuestas de las plantas a las perturbaciones mecánicas están mediadas por moléculas de señalización, como fitohormonas, etileno, etc.

2 Factores que influyen en la tigmomorfogénesis: Calcio Calcio (Ca2 +) es un ión de transducción de señal universal que está implicado en la respuesta de las plantas a diversos estímulos. Las células vegetales no pueden tolerar los niveles de Ca2 + que se encuentran fuera de las células (10 3 M), por lo que la concentración de Ca2 + en el citosol se mantiene a bajas concentraciones (<1μM), gracias a la eliminación activa del Ca2+ por la formación de canales iónicos a través de la membrana plasmática o las membranas del RE y las vacuolas. Después de que una planta sufra una perturbación aumenta de forma inmediata y transitoria la concentración del Ca2+ en el citosol. Por ejemplo, Allen et al. (1999) informaron que después de estimular las raíces de Arabidopsis se produce un aumento del Ca2+ intracelular transitorio y local. Los aumentos de Ca2 + intracelular provocan la expresión de ciertos genes como los TCH entre unos min después de la estimulación. Tres de ellos codifican para ciertas proteínas que tienen afinidad por la unión al Ca2+ y son: calmodulina (CAM) y calmodulinlike (LMC) proteínas semejantes a calmodulina. Tras los aumentos del Ca2+ intracelular, estas proteínas pueden ser activados por unión de Ca2 + y, por consiguiente, modular la enzima diana de ciertas actividades para mediar las respuestas fisiológicas apropiadas. Cabe la posibilidad de que estas proteínas estén relacionadas con las respuestas a los estímulos, por tanto los inhibidores de estas proteínas CAM y CML bloquea las respuestas tigmomorfogenéticas. Etileno El etileno es una hormona gaseosa que regula una variedad de procesos de la planta, incluyendo los aspectos del metabolismo y el desarrollo así como de defensa. Los cambios tigmomorfogenéticos son similares a los que ocurren después de la exposición a etileno. Por ejemplo, si frotas los entrenudos de la planta del tomate provoca la flexión del pecíolo, mientras que si impedimos el crecimiento de las plantas del frijol aumenta el vástago. Estas respuestas tigmomorfogénicas son muy parecidas a las respuestas por exposición al etileno. La Liberación del etileno aumenta después de la perturbación mecánica. 1- aminociclopropano-1-carboxilato sintasa (ACS), que codifica una enzima clave en la biosíntesis de etileno, es regulada siguiendo la estimulación mecánica. ACS provoca un aumento de la expresión para la producción de etileno, este cambio transcripcional puede ser un paso importante en la regulación de la inducción de la tigmomorfogénesis. El etileno es poco probable que sea un factor primario o que desempeñe un papel temprano en la transducción de la perturbación mecánica, porque la producción de etileno comienza 2 h en el frijol y 9 h en Pinus taeda después de la estimulación aunque in vivo el etileno tiene interacciones con otros reguladores de crecimiento como la auxina.

3 Jasmonatos Jasmonatos (JAS) hormonas que las plantas evaporan para avisar de los peligros, son una familia de derivados de ciclopentanona sintetizado a partir de ácido linolénico. Estos metabolitos son derivados de lípidos, que incluyen ácido jasmónico (JA), su éster de metilo (MeJA), y 12-oxo-10,15- ácido fitodienóico (12-OPDA) están implicados en las respuestas tigmomorfogenéticas de las plantas. Por ejemplo, cuando el nivel de JA y 12 OPDA aumenta en Medicago truncatula, muestra un aumento en el contenido de clorofila y un retraso en el crecimiento desde los brotes, que se interpreta como una respuesta tigmomorfogenética. El aumento de los niveles de JA después de las perturbaciones, provoca un aumento de la transcripción de la lipoxigenasa (LOX). LOX es responsable de la producción de los precursores de JA que son los ácidos grasos poliinsaturados, también aumentan los niveles de Ca2+ en el citosol. Por lo tanto, los elevados niveles de Ca2 + puede ser responsable de la asociación de la fosfolipasa D (PLD) en las membranas lo que libera ácidos grasos poliinsaturados de la membrana fosfolípidica. Estos ácidos grasos son uniesterificados por oxígeno líquido para iniciar la biosíntesis jasmonato. Por tanto, el aumento de JA después de una perturbación juega un papel importante en la transducción de esta estimulación, siendo así una respuesta de la tigmomorfogénesis. Ácido abscísico Ácido abscísico (ABA) es otra hormona vegetal que regula las respuestas al estrés y los procesos de desarrollo. La acumulación en vivo de ABA retarda y / o suprime el crecimiento de las plantas, que son los fenotipos observados en tigmomorfogénesis. Por ejemplo, cuando las plantas de frijol sufren una perturbación mecánica aumentan los niveles de ABA seguido por el retraso del crecimiento. Otro ejemplo serían las plantas del arroz que responden cerrando sus estomas y así son más resistentes a la sequía en comparación con las plantas no tratadas. Auxinas La auxina está implicada en las respuestas tigmomorfogenéticas de las plantas. Un mecanismo importante por movimiento de la auxina es la formación de la peroxidasa mediada por la descarboxilación oxidativa. Un aumento en la actividad de la peroxidasa se produce en plantas que han sido mecánicamente perturbadas. Por lo tanto, la peroxidasa impulsada por el catabolismo de la auxina es estimulada por la aplicación de fuerza.

4 Brasinoesteroides Brasinoesteroides (BRs), que comprende brasinolida, han sido implicados en la regulación del crecimiento vegetativo, la germinación de semillas y otros procesos fisiológicos, también se han vinculado a la tigmomorfogénesis. Cuando hay una gran cantidad de RBs los genes TCH4 codifican XTH que es una enzima modificadora de la pared celular, por tanto pueden participar en la tigmomorfogénesis. Recientemente, se ha descubierto que la aplicación de la brasinolida con la auxina aumenta la producción de etileno, que como hemos dicho es un factor de la tigmomorfogénesis. El óxido nítrico El óxido nítrico (NO) está implicado en la regulación de diversos procesos fisiológicos en las plantas, incluyendo la germinación de las semillas, la diferenciación celular, etc. NO es también importante en la defensa de la planta para formar respuestas contra los patógenos invasores. Se ha demostrado que cuando se somete a las células de Arabidopsis a una perturbación existe un aumento del NO, lo que provoca la fluctuación de Ca2+ al interior celular y a su vez la transcripción de los genes de CAM y CML. Por tanto CAM y CML se encargan de la regulación de la acumulación de NO. Las especies reactivas de oxígeno Hay plantas sometidas a diferentes presiones ambientales, incluyendo como estrés mecánico, acumular peróxido de hidrógeno (H2O2) y superóxido (O2-) que son especies reactivas de oxígeno (ROS). Por ejemplo, la estimulación mecánica de Mesembryanthemum crystallinum provoca un aumento en los niveles in vivo de H2O2. Este aumento puede ser utilizado por las células usando ROS como moléculas de señalización que regulan la expresión de genes ya que ROS puede controlar la formación de un canal de Ca2 +. Por tanto, ROS y Ca2+ están relacionados entre sí y a su vez con las respuestas tigmomorfogenéticas ante un estímulo táctil. Es poco probable que un factor de señalización único controle el conjunto de las respuestas de las plantas al tacto. Lo más probable, es que la acción concertada de los ROS, Ca2 + y hormonas vegetales funcionen de forma interdependiente para generar respuestas morfológicas y fisiológicas en la planta. La identificación de genes inducibles táctil La tigmomorfogénesis, probablemente requiere alteraciones en la expresión génica. Braam y Davis (1990) informaron de la primera existencia inesperada de genes inducibles al tacto en las plantas. Se descubrieron los genes inducibles TCH por la estimulación táctil de la planta y otros tipos de perturbaciones mecánicas.

5 Estos genes codifican ciertas proteínas CML y CMA, también se identificaron otros genes como los que codifican para la ACC sintasa o para las demás proteínas quinasas. Muchos de estos genes se expresan en respuesta al tacto. Además de estos existen otros genes que codifican enzimas que modifican la pared celular y su expresión está regulada por la estimulación táctil. Hay otro gen que es el encargado de expresar los compuestos que intervienen en la regulación de los genes relacionados con la defensa. Muchos genes inducibles táctiles también incrementan la expresión después de otros estímulos, como la oscuridad, temperatura extremos, y las hormonas. Aunque estos no parecen compartir propiedades mecánicas con los de contacto o lesiones en la expresión de genes. Respuestas tigmomorfogenéticas en diferentes especies En el primer experimento, las plántulas de Ulmus americana de seis semanas de edad, fueron sometidas a diferentes dosis diariamente de flexión durante 3 semanas en condiciones controladas de invernadero. Los tratamientos diarios de flexión fueron: ninguna flexión en un vástago estacado, flexión mínima en un vástago no estacado, y 5, 10, 20, 40, 80 flexiones. Se determinó la Altura de las plántulas y el crecimiento del diámetro y el área de la hoja media y la relación del cambio en el crecimiento en altura (DH) con el cambio de diámetro crecimiento (DD; (DH: DD)) antes y después de los tratamientos. Al final de las 3 semanas, observamos que las plántulas estacadas fueron significativamente más altas y más pequeñas de diámetros de vástago que todas las plántulas flexionadas. La relación DH: DD disminuyó con el aumento de la flexión. El Área foliar promedio disminuyó con el aumento de la flexión y esto afectó a la capacidad fotosintética, reduciéndola. El Crecimiento en diámetro tiende a aumentar con el aumento de la carga mecánica de hasta 40 flexiones, pero no se obtuvo al acercarse a los de árboles de control no estacados en el tratamiento de 80 flexiones. La conclusión sería que la tigmomorfogénesis aumentó con el aumento del estrés mecánico. En el segundo experimento, vamos a analizar las respuestas bioquímicas y morfológicas en un tallo de Solanum lycopersicum después de ser sometido a estímulos mecánicos. Realizamos frotamientos en el entrenudo N4 de la planta de tomate. Vimos que el frotamiento aplicado a un entrenudo joven inhibía la elongación del entrenudo y de sus vecinos.

6 La respuesta tigmomorfogenética a este efecto, fue un retraso de elongación de tejido acompañada por un aumento del grosor. 24 horas después del frotamiento del entrenudo vimos que esta inhibición del crecimiento estaba correlacionada con un aumento de las enzimas con actividad lignificante, ya que aparecieron estas: amonio fenilalanina liasa (PAL), cinamoil alcohol deshidrogenasa (CAD) y peroxidadas (POD). PAL, tiene una influencia directa sobre la acumulación de lignina en los tejidos, esta acumulación de lignina en el entrenudo de tomate frotado podría ser un mecanismo de respuesta al daño mecánico causado por el frotamiento. Por tanto, la lignificación resultante y el endurecimiento del tabique celular determinan la respuesta de crecimiento del entrenudo de tomate al estrés mecánico. También observamos una disminución en el contenido de ácido indolico-3-acetico (IAA) entre el entrenudo frotado y el superior. Se propuso que el estrés mecánicamente-inducido tiene efectos opuestos en los niveles de auxina en dos especies estudiadas: Phaseolus vulgaris y Bryonia dioica. Al frotar los entrenudos, los niveles de auxina incrementaron en Phaseolus. Se vio que había un acumulamiento de auxina (este acumulamiento es debido a un incremento en los niveles de auxina endógena y un incremento en diámetro del tallo por un aumento en la producción de etileno) en el tejido del tallo, esto provocó un retraso en el crecimiento de los entrenudos. En Bryonia dioica después del frotamiento se apreció una disminución en la actividad auxina. Esto puede sugerir que en Bryonia, el catabolismo de las auxinas es acelerado por peroxidasas estimuladas mecánicamente. Tenemos pruebas de que la disminución del nivel de auxina contribuye a un mecanismo que conduce a la inhibición de los entrenudos de tomate sometidos a un estrés mecánico. Por tanto, la auxina y ACC oxidase (formadora de etileno) provocan un aumento de la actividad de PAL y peroxidasas, esto significa que el crecimiento del entrenudo finalizaría bien, porque la PAL acumulará lignina y se dará el proceso de lignificación o bien porque

7 las peroxidasas reduce el contenido de auxina en el tejido a un nivel bastante bajo para no sostener el crecimiento normal. El último experimento está dedicado a analizar los cambios en la fluidez de la membrana plasmática en Bryonia dioica en respuesta a un estímulo mecánico. Encontramos evidencias de un aumento importante en la fluidez media de lípidos de MP de entrenudos de Bryonia dioica en respuesta a una estimulación mecánica. Tal efecto se pudo detectar 20 min después de la señal y se alcanzó su magnitud máxima después de 4 h. Después de 30 h, el control y el entrenudo frotado ya no exhiben un comportamiento distinto, y después de 48 h, incluso se observó un efecto opuesto, caracterizado por una menor fluidez de lípidos de la PM de entrenudos frotados en comparación con entrenudos de control. Con el fin de investigar si estos cambios en la fluidez de la PM podrían ser correlacionados con modificaciones en la organización estructural de la MP en tigmomorfogénesis, se realizó un análisis extenso de algunos componentes de MP. La estimulación mecánica provocó, un aumento significativo en el índice de insaturación de ácidos grasos de lípidos de la MP de entrenudos frotados. Este índice de insaturación puede ser considerado como responsable, al menos en parte, del aumento de la fluidez. El aumento de la fluidez de la MP en Bryonia dioica ocurre rápidamente después de los estímulos mecánicos y sólo se extiende por unas horas. Así podemos postular que las variaciones de la fluidez en respuesta al estrés se pueden correlacionar con la transducción de la señal. Por lo que en una MP más fluida se facilitará la transducción de la señal. Estas plantas requieren que la transducción de la señal tenga lugar para responder fisiológicamente al estrés. Genes implicados en la tigmomorfogénesis: En el caso de Arabidopsis, que es la planta utilizada para los próximos experimentos, codifica un número limitado de proteínas 7 TM acopladas a proteínas G. Estas proteínas 7TM tienen un N-terminal posicionado extracelularmente y el C-terminal hacia la zona citoplasmática de la célula. Al recibir la señal provocada por el estimulo, estos receptores 7TM acoplados a proteínas G activan PLC (fosfolipasa C) que hace que aumenten, en gran cantidad, los niveles de calcio en el citoplasma y esto provoca la respuesta del estimulo. Estas proteínas transmembrana son llamadas Mildew Resistance Locus O, MLO, locus O de resistencia al moho. Dentro de esta familia de proteínas hay distintas funciones Ej.: MLO 2, MLO 6 Y, MLO12 participan en la defensa antifúngica.

8 Hay dos genes MLO que regulan el crecimiento asimétrico de la raíz (relacionado con la tigmomorfogenesis) y son, MLO4 Y MLO11. Estos dos genes actúan en un complejo heteroligomérico. Hay distintos mutantes de estos genes: mlo 4-1, mlo 4-3, mlo 4-4, mlo11-3 y mlo11-4 Se hizo un experimento en el cual se comparaba la forma de la raíz de plantas salvajes (Col-o) y plantas con mutaciones mlo 4 y mlo11. Los resultados fueron: Las plantas salvajes tienen la raíz menos ondulada, sobretodo en la zona apical, y apenas tienen inclinación. Los mutantes de MLO4, en general, se ve una mayor ondulación de las raíces, sobretodo en la zona del ápice. Los mutantes de MLO11, se ven las raíces más onduladas que en Col-0 pero más que en mlo4. También se observa inclinación en las raíces. En otro experimento se vio que las plantas con mutaciones en MLO4 y MLO11 al tocar con su ápice una superficie dura, se rizaban. Esto nos demuestra que tienen un defecto en respuesta a la tigmomorgénesis ya que la raíz de la planta salvaje sigue creciendo en horizontal a la superficie dura. Experimento: A. El ángulo de la raíz con respecto a la longitud de mutantes y salvajes: Solo se ve gran grado de significación en el mutante mlo4-1 donde el ángulo de la raíz es bastante vertical y la longitud de la raíz no es muy grande. B. La envergadura de la raíz de salvaje y mutantes: Se observa que la envergadura en los mutantes mlo4 y mlo11 es pequeña comparada con la de Col-0. C. El ángulo de inclinación frente a la vertical, de las raíces de mutantes y el salvaje:los mutantes mlo4 apenas tienen inclinación de la raíz, mientras que mlo11 es bastante parecido a Col-0.

9 Por lo tanto, en general: El mutante mlo4, no produce inclinación de la raíz pero si ondulación. Su envergadura y longitud son menores comparadas con Col-0. El mutante mlo11, tiene cierto ángulo de inclinación (parecido a Col-0), su ondulación es menor que la de mlo4 pero mayor que la del salvaje. Tiene una envergadura menor que Col-0. Experimento: Para identificar que dominio de la proteína MLO4 es funcional, intercambiamos sus dominios con MLO2, que tiene función antifúngica. Se centraron más en los dominios C- terminal citoplasmático y el 1º bucle extracelular, ya que en las dos proteínas no son iguales. Tras realizar estos intercambios se llego a la conclusión de que el dominio C-terminal citoplasmático de MLO4 es necesario pero no suficiente para la regulación del crecimiento asimétrico de la raíz de las plantas. Requiere la acción coordinada de múltiples dominios citoplásmicos. Experimento: Vemos si el transporte de auxina afecta al crecimiento de la raíz en los mutantes y en el salvaje: Utilizamos NPA, que es un inhibidor de las proteínas PIN, las bloquea. Las proteínas PIN son facilitadoras del transporte de auxina y se encuentran en la parte basal de las células. Se unen a un componente de membrana, permitiendo que la auxina pase a la célula de abajo. Luego las proteínas AUX, que son permeasas, internalizan la auxina en la membrana. Por lo tanto al utilizar NPA, inhibimos el transporte de auxina en la raíz. Los resultados son: Con concentración 0 de NPA (hay transporte de auxina): Mutantes de mlo4, mutantes de mlo11 y raíz salvaje (Col-0) tienen la raíz, en mayor o menor grado, rizada. Con concentración 10^-6 de NPA (disminuye el transporte de auxina): Todos tienen la raíz mucho más estirada. Por lo que podemos concluir que el transporte de auxina afecta al crecimiento de la raíz, tanto de los mutantes como de la planta salvaje.

10 Experimento: A. El transporte basipeto de auxina en la raíz de Col-0 y mlo4 es prácticamente igual. B. El transporte acropeto (hacia la zona apical en el caso de la raíz) de auxina en la raíz de Col-0 es muchísimo menor que en mlo4. Al no tener la proteína MLO4 no se da el transporte basipeto de auxina (el fisiológico). Se pierde la polaridad del transporte. Es muy probable que por esta diferencia en el transporte de auxina acropetal, las raíces mutantes mlo4 se ricen más que las Col-0. Samantha Abigail García Díaz Claudia Castillo Domínguez Nuria Davó Siguero