Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología. Rompimiento celular. Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

Transcripción

1 Rompimiento celular Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

2 Productos Extracelulares -Antibióticos -Enzimas extracelulares -Muchos polisacáridos -Mayoría de aminoácidos Productos Intracelulares -Mayoría de proteínas modificadas genéticamente -Lípidos -Algunos antibióticos Esteroides (Se extraen sin romper) Biomasa

3 Esquema de la pared celular de células procariotas Procariotes Gram (E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes) Membrana externa (Proteínas y lipopolisacáridos) Fuerza mecánica 8 nm 8 nm Polipéptidoglucanos Espacio Periplasmático (Proteínas) Membrana de plasma Permeabilidad Procariotes Gram + Polipéptidoglucanos Espacio Periplasmático (Proteínas) Membrana de plasma (Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)

4 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

5 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

6 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

7 Fermentación Cosecha de células Centrifugación, filtración con vacío, filtración con membranas Etapas primarias de recuperación Rompimiento Celular Remoción de restos celulares Concentración y/o fraccionamiento Operaciones de alta resolución Operaciones finales Homogenización, molienda, lisis (enzimática o química) Centrifugación, filtración con vacío, filtración con membranas Precipitación, extracción, filtración con membranas, evaporación Cromatografía, cristalización Producto Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989 Studies on cell disruption and cell debris removal in downstream processing

8 Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae Antes de la ruptura celular Después de 2 pasos a 1000 bar dando un rompimiento celular de 95%

9 Equipo de ruptura Industria Alimentaria (Homogenización de la leche) Industria de la Pintura (Reducción de Pigmentos) Aplicación en Industria Biotecnológica

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11 Método Técnica Principio Estrés sobre el producto Costo Ejemplo Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la membrana Suave Barato Ruptura de células de sangre Digestión enzimática Solubilización Disolución de lípidos Rompimiento por digestión de la pared celular Detergentes solubilizan la membrana celular Solventes orgánicos se disuelven en la pared celular y la desestabilizan Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con lisozima de huevo Suave Moderadocaro Sales biliares actuando sobre E.coli Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno Mecánico Tratamiento alcalino Homogenización (tipo navaja) Molido La saponificación de lípidos solubiliza la membrana Fuerte Barato Células cortadas en una licuadora Moderado Moderado Tejido animal y células Ruptura celular por molido con abrasivos Moderado Barato Ultrasonicación Células rotas con cavitación ultrasónica Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala Homogenización (tipo orificio) Se hace pasar células por un pequeño orificio y se rompen por estrés Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de células excepto bacterias Rompimiento en molino de perlas Se aplastan las células entre el vidrio y perlas de acero Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de células y células de plantas

12 Dificultad de la ruptura Esporas Cocos gram - Levaduras Células vegetales Bacilos gram + Bacilos gram - y cocos Micelios Células animales

13 Elección del método de ruptura Naturaleza de la fuente de la enzima Escala de la operación Velocidad del método de extracción Estabilidad del enzima Pureza requerida Costo del proceso

14 Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento Factor inactivante Fuente de enzima Frecuencia Calor Cualquiera Universal Enfriamiento Frío Cualquiera Raro Calentamiento Modo de contrarrestarlo Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o frío Productos oxidación de fenoles Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor Inhibidores específicos Plantas y bacterias Raro Separación del inhibidor Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación

15 Choque osmótico 1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%) 2. Equilibrio osmótico 3. Centrifugación: concentración de las células 4. Resuspensión en agua (4ºC) 5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular Mayor sensibilidad en GRAM (GRAM + alta presión osmótica interna) Ventajas: Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación NO a gran escala: Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular) Elevado número de pasos de centrifugación Necesidad de refrigeración

16 Tratamiento con lisozima + EDTA Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido Mayor susceptibilidad GRAM + Combinación con EDTA: quelante del Ca 2+ Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas Necesidad de choque osmótico No empleo a gran escala: Alto precio de la lisozima Eliminación de lisozima tras extracción

17 Tratamiento con detergentes Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros Tipos: 1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDS Catiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amonio 2. No iónicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzima Tween, Spam, Triton Inconvenientes: Precipitación de proteínas Necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)

18 Tratamiento con álcalis Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, ph ; min) Hidrólisis de la pared celular Ventajas: Simpleza, barato Fácil aplicación a gran escala Desventajas: Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes) No selectivo Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a ph alcalino

19 Disolventes orgánicos Método tradicional de ataque ( tolueno). No se usan a gran escala. Inconvenientes: Precio Toxicidad Desnaturalización de proteínas Inflamabilidad

20 Homogeneización con abrasivos Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh) Dispositivos de funcionamiento continuo: Agitador Mickle (agitador vibratorio) Dyno-mill (agitador de discos giratorios) Efectividad depende de: Tipo y concentración de abrasivo Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias Velocidad de agitación Cantidad y flujo a través de la cámara Temperatura Dispositivo de discos

21 Sonicación Aplicación de frecuencia superiores a 20 khz Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades colapso de cavidades ondas de choque daño celular Aplicación continua o discontinua Eficacia dependiente de: Tipo de microorganismo: diversidad Gram ->Gram + Bacilos > Cocos ph Temperatura Fuerza iónica del medio Tiempo de exposición Densidad de la célula Uso a pequeña escal, NO a gran escala: Elevados requerimientos de energía Dificultad de transmisión de la energía Problemas de disipación del calor producido

22 Congelación/Descongelación Formación y fusión de cristales de hielo liberación de proteínas Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos Ventajas: Simplicidad Bajas temperaturas de trabajo NO a gran escala: Elevado tiempo de tratamiento Resistencia de algunos microorganismos Sensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación

23 Cizalla líquida Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho Homogeneizador de Manto-Gaulin Mecanismo: Ruptura celular por caída brusca de presión y choque Modos de uso: Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia Efectividad depende de: Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM + Historia de la materia de partida: Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial) Congelación/descongelación

24 Cizalla sólida Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de orificio Mecanismo: Agitación en presencia de abrasivo (cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquida Fuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo No produce la desnaturalización de las enzimas NO a gran escala: Manejo complicado y costoso

25 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

26 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

27 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular (Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones) Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico P e P i = R T c i Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación: V M dr dt = k Integrando y re-arreglando R ln R R m m = ( R m R) V M kt Rm ln R R m k Ejemplo 5.2 t

28 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Eficiencia de los Molinos de Perlas (operación continua): El número de etapas de un molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para calcular la eficiencia esperada del rompimiento. El balance de masa de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden puede ser expresado mediante la ecuación: Vm N dr dt = FR + k V ( R R ) N 1 1 m Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos R R 1 = m 1 kvm NF kvm + NF Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos: R m Rm R N 1 m Eficiencia de la etapa!!! N kvm 1 Ejemplo 5.3 = + NF

29 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que: dr dn = k' ( R R) m Integrando obtenemos la ecuación: Rm ln = k' N R R m Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma: k '= k" P Combinando las ecuaciones anteriores se tiene: R R R m ln = m a k" NP a

30 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación: R R R m ln = m k" N b P a Ejemplo 5.4 Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1

31 Chang and Su, 2006 Kinetic model for simultaneous cell disruption and aqueous two-phase extraction A = A m [1 exp( kt)]

32 La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a nivel laboratorio Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto. GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures