Rompimiento celular Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

Transcripción

1 Rompimiento celular Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa

2 Productos Extracelulares -Antibióticos -Enzimas extracelulares -Muchos polisacáridos -Mayoría de aminoácidos Productos Intracelulares -Mayoría de proteínas modificadas genéticamente -Lípidos -Algunos antibióticos Esteroides (Se extraen sin romper) Biomasa

3 Productos que requieren de ruptura celular Tipo de producto Proteínas recombinantes Enzimas Plásmidos Vacunas Otros Ejemplos Insulina, HC, Proteína A, Proteína G L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa Terapia génica Tétanos, Meningitis Mitocondrias, Esporas, Toxinas Tejeda y col Bioseparaciones

4 Esquema de la pared celular de células procariotas Procariotes Gram (E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes) 8 nm 8 nm Procariotes Gram + Membrana externa (Proteínas y lipopolisacáridos) Polipéptidoglucanos Espacio Periplasmático (Proteínas) Membrana de plasma Fuerza mecánica Permeabilidad Polipéptidoglucanos Espacio Periplasmático (Proteínas) Membrana de plasma (Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)

5 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

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7 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

8 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

9 Fermentación Etapas primarias de recuperación Cosecha de células Rompimiento Celular Remoción de restos celulares Concentración y/o fraccionamiento Operaciones de alta resolución Operaciones finales Centrifugación, filtración con vacío, filtración con membranas Homogenización, molienda, lisis (enzimática o química) Centrifugación, filtración con vacío, filtración con membranas Precipitación, extracción, filtración con membranas, evaporación Cromatografía, cristalización Producto Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989 Studies on cell disruption and cell debris removal in downstream processing

10 Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae Antes de la ruptura celular Después de 2 pasos a 1000 bar dando un rompimiento celular de 95%

11 Equipo de ruptura Industria Alimentaria (Homogenización de la leche) Industria de la Pintura (Reducción de Pigmentos) Aplicación en Industria Biotecnológica

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13 Método Técnica Principio Estrés sobre el producto Costo Ejemplo Químico Choque osmótico Digestión enzimática Solubilización Disolución de lípidos Tratamiento alcalino Mecánico Homogenización (tipo navaja) Molido Ultrasonicación Ruptura osmótica de la membrana Rompimiento por digestión de la pared celular Detergentessolubilizan la membrana celular Solventes orgánicos se disuelven en la pared celular y la desestabilizan La saponificación de lípidos solubiliza la membrana Células cortadas en una licuadora Ruptura celular por molidocon abrasivos Células rotas con cavitación ultrasónica Suave Barato Ruptura de células de sangre Suave Caro Micrococcuslysodeikticustratado con lisozima de huevo Suave Moderado -caro Sales biliares actuando sobre E.coli Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno Fuerte Moderado Moderado Barato Moderado Tejido animal y células Barato Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala Homogenización (tipo orificio) Sehace pasar células por un pequeño orificio y se rompen por estrés Fuerte Moderado Tratamiento a gran escalade suspensión de células excepto bacterias Rompimientoen molino de perlas Se aplastan las célulasentre el vidrio y perlas de acero Fuerte Barato Tratamiento a gran escalade suspensión de células y células de plantas

14 Dificultad de la ruptura Esporas Cocos gram- Levaduras Células vegetales Bacilos gram + Bacilos gram- y cocos Micelios Células animales

15 Elección del método de ruptura Naturaleza de la fuente de la enzima Escala de la operación Velocidad del método de extracción Estabilidad del enzima Pureza requerida Costo del proceso

16 Factor inactivante Planta Piloto de Fermentaciones Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento Fuente de enzima Frecuencia Calor Cualquiera Universal Enfriamiento Modo de contrarrestarlo Frío Cualquiera Raro Calentamiento Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o frío Productos oxidación de fenoles Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor Inhibidores específicos Plantas y bacterias Raro Separación del inhibidor Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación

17 Choque osmótico 1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%) 2. Equilibrio osmótico 3. Centrifugación: concentración de las células 4. Re suspensión en agua (4 ºC) 5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior celular Mayor sensibilidad en GRAM negativas (GRAM positivas alta presión osmótica interna) Ventajas: Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación NO a gran escala: Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular) Elevado número de pasos de centrifugación Necesidad de refrigeración

18 Tratamiento con lisozima + EDTA Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido Mayor susceptibilidad GRAM + Combinación con EDTA: quelante del Ca 2+ Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationes Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas Necesidad de choque osmótico No empleo a gran escala: Alto precio de la lisozima Eliminación de lisozima tras extracción

19 Tipos: 1. Iónicos: provoca desnaturalización proteica Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico, SDS Catiónicos: Bromuro de cetiltrimetil-amonio 2. No iónicos: preservan estructura nativa e interacciones de la enzimatween, Spam, Triton Tratamiento con detergentes Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros Inconvenientes: Precipitación de proteínas y necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)

20 Tratamiento con álcalis Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, ph ; min) Hidrólisis de la pared celular Ventajas: Simpleza, barato Fácil aplicación a gran escala Desventajas: Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes) No selectivo Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a ph alcalino

21 Disolventes orgánicos Método tradicional de ataque ( tolueno). No se usan a gran escala. Inconvenientes: Precio Toxicidad Desnaturalización de proteínas Inflamabilidad

22 Homogeneización con abrasivos Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh) Dispositivos de funcionamiento continuo: Agitador Mickle (agitador vibratorio) Dyno-mill (agitador de discos giratorios) Efectividad depende de: Tipo y concentración de abrasivo Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias Velocidad de agitación Cantidad y flujo a través de la cámara Temperatura Dispositivo de discos

23 Sonicación Aplicación de frecuencia superiores a 20 khz Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades colapso de cavidades ondas de choque daño celular Aplicación continua o discontinua Eficacia dependiente de: Tipo de microorganismo: Gram ->Gram + Bacilos > Cocos ph Temperatura Fuerza iónica del medio Tiempo de exposición Densidad de la célula Uso a pequeña escala, NO a gran escala: Elevados requerimientos de energía Dificultad de transmisión de la energía Problemas de disipación del calor producido

24 Congelación/Descongelación Formación y fusión de cristales de hielo liberación de proteínas Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos Ventajas: Simplicidad Bajas temperaturas de trabajo NO a gran escala: Elevado tiempo de tratamiento Resistencia de algunos microorganismos Sensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación

25 Cizalla líquida Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho Homogeneizador de Manton-Gaulin Mecanismo: Ruptura celular por caída brusca de presión y choque Modos de uso: Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia Efectividad depende de: Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM + Historia de la materia de partida: Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial) Congelación/descongelación

26 Cizalla sólida Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de orificio Mecanismo: Agitación en presencia de abrasivo (cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquida Fuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo No produce la desnaturalización de las enzimas NO a gran escala: Manejo complicado y costoso

27 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

28 Tomado de Advances in product release strategies and impact on bioprocess design (2009) Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell

29 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular (Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones) Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico (Ley de van t Hoff) P e P i = R T c Ejemplo: Las cianobacterias son capaces de acumular sales de bajo peso molecular en respuesta a un medio con alta presión osmótica. Pueden ser cultivadas en medios con 0.11 M NaCl o en medios con 0.49 M NaCl y 0.01 M CaCl 2. Cuando las células son crecidas en el medio más salino y transferidas a agua pura se permeabilizan liberando los carbohidratos y aminoácidos intracelulares en 2 min. Estime la diferencia de presión osmótica para permeabilizar las células a 25 ⁰C (donde: R = 82 cm 3 atm mol -1 K -1 ). i P 3 cm atm mol 1L = 82 o NaCl 3 mol K L 1000cm o ( ) K [ ( ) ] = 5.38atm P mol 1L [ ] = 24.68atm 3 cm atm o = 82 ( ) K ( ) + ( ) o NaCl CaCl 2 3 mol K L 1000cm

30 Molino de perlas de alta velocidad Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones Parámetros operacionales - Velocidad del agitador - Velocidad de alimentación de la suspensión celular - Diseño del agitador - Tamaño de las perlas de vidrio - Carga de las perlas de vidrio - Concentración celular - Temperatura

31 Velocidad del Agitador La Velocidad Periférica Normalizada de los Anillos agrupa varios parámetros relacionados con la velocidad del agitador U = D m πω 60x1000 ω : velocidad angular del agitador (rpm) D m : diámetro En impulsores concéntricos, D m = diámetro del impulsor (mm) Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones En impulsores excéntricos, D m = diámetro promedio (mm) d : diámetro de los anillos 2 2 d del agitador (mm) D m = 2 e + 4 e : diámetro de la flecha del agitador (mm)

32 Flujo de alimentación, F El flujo permisible en un molino de perlas depende: Del volumen del molino De la carga de perlas Velocidad del agitador Al aumentar el flujo de alimentación Disminuye el grado de desintegración El proceso resulta más económico NOTA: Conviene operar con altos flujos de alimentación y usar varios pasos para obtener el rendimiento requerido

33 Diseño del Agitador y Efectos del Mezclado El comportamiento de un molino de perlas depende del patrón de flujo y mezclado que produce la agitación. La cual es un agitado intermedio a los dos modelos ideales: Flujo tapón (sin mezclado axial) y tanque continuo agitado (100 % agitado) El tipo de mezclado puede ser determinado por técnicas con trazadores Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones

34 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular (Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones) Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación: V M dr dt = k ( R m R) V M Integrando y re-arreglando R ln R R m m = kt ln Rm R R m k Ejemplo 5.2 t

35 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operación continua): El grado de desviación del flujo tapón ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido simulado utilizando el modelo de Tanques en serie perfectamente agitados. Esto permite realizar experimentos con pulsos de tinta para determinar el número de tanques equivalentes al grado de mezclado que tiene el molino de perlas utilizado y calcular la eficiencia esperada del rompimiento. F C 0 C 1 C 2 C 3 C N N F Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente agitados de igual volumen, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa N es: V N M dc dt N ( C C ) = F N 1 N

36 Utilizando un tiempo adimensional definido por: El balance de masa de tinta puede expresarse como: dcn dθ = N θ = N( C ) 1 CN tf = V t M t R Integrando para cada etapa, se obtiene que para la etapa N la expresión: E ( θ ) = C C N 0 = N N N 1 θ 1! ( N ) exp ( Nθ ) E(θ) es una medida de la distribución de tiempos de residencia del fluido dentro del recipiente. Derivando con respecto θ e igualando el resultado a cero se tiene: N 1 = 1 θ Donde θ máx es el tiempo adimensional en el cual E es máxima: máx

37 Eficiencia de un Molino de Perlas (operación continua): Para relacionar el número de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario realizar un balance de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden. El balance de proteína liberada en la primera etapa está dada por Vm N dr 1 = FR1 + k m dt V ( R R ) N 1 m Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos R R 1 = m 1 kvm NF kvm + NF Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos: R m Rm R N Eficiencia de la etapa!!! N kvm 1 Ejemplo 5.3 = + NF

38 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que: dr dn = k' ( R R) m Integrando obtenemos la ecuación: Rm ln = k' N R R m Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma: k '= k" P Combinando las ecuaciones anteriores se tiene: R R R m ln = m a k" NP a

39 Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación: R R R m ln = m k" N b P a Ejemplo 5.4 Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1

40 Chang and Su, 2006 Kinetic model for simultaneous cell disruption and aqueous two-phase extraction A = A m [1 exp( kt)]

41 La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a nivel laboratorio Factores claves son: Eficiencia y reproducibilidad A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto. GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures