UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA

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2 UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural ESTUDIO ANATOMO-HISTOLÓGICO DE LOS EFECTOS DE Phytophthora ramorum Y P. nícotíanae SOBRE LA HOJA DE Víburnum tínus TRABAJO FINAL DE CARRERA Alumna: Dª. Fátima Alicia Pérez-Fuster Jiménez Director académico: D. Francisco José García Breijo Director experimental: D. José Reig Armiñana Valencia, Junio de 2012

3 TITULO: Estudio anatomo-histológico de los efectos de Phytophthora ramorum y P. nicotiana sobre la hoja de Viburnum tinus. RESUMEN: El presente trabajo aborda el estudio de los efectos que produce los oomicetos de Phytophthora ramorum y P. nicotiana sobre una especie del género Viburnum (V tinus L.). Para ello se ha llevado a cabo un estudio microscópico de las hojas de esta especie, en distinto estadio de desarrollo tras su infección con los dos géneros de Phytophthora. En dicho estudio se pretende determinar si existe diferencia de sensibilidad a lo largo del tiempo, si la acción de ambos patógenos es uniforme en dicho tejido y si el comportamiento se mantiene constante a lo largo del tiempo. Ello permitirá conocer las defensas anatómicas de este vegetal frente a los dos tipos de patógeno. Las técnicas utilizadas para este trabajo han sido: -Inoculación. -Toma de muestras a intervalos regulares. -Fijación de las mismas, inclusión y seccionado de las muestras para microscopia. -Observación al microscopio de campo claro, microscopio de fluorescencia y microscopio electrónico de transmisión de cortes sometidos a diversas tinciones. Las muestras fueron inoculadas mediante la aplicación de zoosporas directamente sobre la superficie foliar. Es por ello que los resultados de los estudios histológicos nos dan información real sobre la forma en la que el patógeno puede penetrar en la planta en condiciones naturales. Con Phytophthora ramorum observamos la formación de hifas aseptadas, cenocíticas y algo ramificadas. Generalmente son intercelulares, pero en muchos casos se pudo observar haustorios o hifas intracelulares. Las hifas maduras aparecen con numerosas vesículas. En algunos casos hemos podido observar alteraciones en los haces vasculares. Es habitual ver en los haces menores como las células del floema y del cambium aparecen muy colapsadas y en algunos haces se puede observar alguna hifa en el interior de las tráqueas. En Phytophthora nicotiana observamos un comportamiento totalmente diferente; muy escasos daños y un proceso infeccioso casi inexistente con muy pocas hifas en la zona del mesófilo.

4 Todo ello ha supuesto un estudio de más de 14 meses y durante el mismo se han realizado más de dos mil cortes. Tras la observación microscópica de los mismos se han efectuado unas cuatrocientas microfotografías aproximadamente, las cuales han servido para el estudio final de los efectos producidos por estos dos tipos de Phytophthora. De este modo, hemos podido tipificar una serie de daños estructurales a nivel de epidermis, parénquimas, estomas, cutícula y haces vasculares que nos han permitido un diagnóstico claro de la patología de la Phytophthora (especialmente P. ramorum) sobre Viburnum tinus. Se acompaña el trabajo con diferentes fotografías de los ejemplares sanos y ejemplares con daños histológicos, observaciones, resultados y conclusiones. Alumna: Dª. Fátima Alicia Pérez-Fuster Jiménez Director académico: D. Francisco José García Breijo Director experimental: D. José Reig Armiñana Valencia, Junio de 2012

5 ÍNDICE l. INTRODUCCIÓN l 1.1. Características generales del género Phytophthora Ubicación taxonómica Crecimiento micelar Reproducción Reproducción asexual Reproducción sexual Dispersión del patógeno Métodos de dispersión Condiciones ambientales 1 O Variabilidad de especies y rango de hospedantes l Estacionalidad de las especies Problemática actual Española ) Comunidad Valenciana Enfermedades causadas por Phytophthora l Propiedades de Phytophthora ramorum Propiedades de Phytophthora nicotianae MATERIAL Y MÉTODOS Material vegetal Familia Caprifoliaceae _l Viburnum tinus L. (Durillo) 18

6 2.2. Recogida de las muestras Trabajo de laboratorio Fijación Inclusión en parafina Deshidratación Infiltración Confección de bloques Corte de bloques Desparafinado e hidratación Tinción y deshidratación Inclusión en resina Deshidratación Confección de bloques Obtención de los cortes semifinos y ultrafinos Cortes semifinos Cortes ultrafinos Tinción de los cortes y montaje Cortes semifinos Cortes ultrafinos Inclusión en hielo Hidratación Confección de los bloques Obtención de los cortes Tinc ión y montaje Epifluorescencia Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Microscopio electrónico de barrido a baja temperatura (L TSEM o Cryo-SEM) ) Histología de la hoja 39

7 Epidermis Cutícula Estomas Tricomas Mesófilo Parénquima en empalizada Parénquima esponjoso lagunar Tejidos vasculares Xilema F loema.... _ Estructura de sostén RESULTADOS Descripción anatomo-histológica de la hoja de Viburnum tinus Epidermis del haz Parénquima en empalizada 5 l Zona de transición Parénquima lagunar Haces vasculares Epidermis del envés Daños producidos por Phytophthora ramorum en la hoja de Viburnum tinus Epidermis Mesófilo

8 Haces vasculares Daños producidos por Phytophthora nicotianae en la hoja de Viburnum tinus Epidermis Mesófilo Haces vasculares DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 79 7.ANEXOI Reactivos utilizados 83