Colorantes y Coloración n I

Transcripción

1 Colorantes y Coloración n I T.M Daniela Bravo Vidal Color y coloración

2 Introducción En el estudio de los preparados biológicos una limitante fundamental es la pequeña a variación n en la absorción n de luz de los diferentes componentes de células c y tejidos. Es por esto que el contraste que se obtiene en el microscopio óptico es generalmente muy bajo. Para solucionar este problema se recurre al proceso de coloración, esto debido a la propiedad que tienen los distintos componentes celulares y tisulares de incorporar con variable intensidad sustancias colorantes.

3 Introducción La historia de las coloraciones histológicas comienza hace varios siglos en los primeros laboratorios y talleres de los médicos, m químicos y botánicos, los cuales empezaron a explorar el mundo de las células c y los microorganismos. Estos pioneros de la histología a utilizaron enseres domésticos, como jabón, diversos pigmentos utilizados para colorear telas e incluso vino como colorantes para estudiar diversos especímenes al microscopio. Estos esfuerzos permitieron el uso generalizado de los mecanismos básicos para la tinción n y evaluación n morfológica. Introducción Los protocolos iniciales se limitaban a colorear el núcleo n de la célula c y citoplasma. Sin embargo, como la evaluación n morfológica se convirtió en la más m s importante herramienta utilizada para guiar el tratamiento de los pacientes, médicos m y científicos desarrollaron numerosos procedimientos que ahora incluyen una gran variedad de tinciones. Hoy en día, d estas tinciones nos permiten aumentar la morfología a de los tejidos y demostrar importantes componentes celulares, ayudando en al diagnóstico y evaluación n de enfermedades e incluso identificando organismos patógenos.

4 Teoría a del color Teoría a del color: Es un grupo de reglas básicas b de la mezcla de colores para conseguir el efecto deseado combinando colores en relación n a la luz y/o pigmento. La luz blanca se puede producir combinando el rojo, el verde y el e azul, mientras que combinando pigmentos cian, magenta y amarillo se produce el color neutro.

5 El color: es un atributo que percibimos de los objetos cuando hay luz, no es una característica de una imagen u objeto, sino que es más s bien una apreciación n subjetiva nuestra. Se puede definir como, una sensación n que se produce en respuesta a la estimulación n del ojo y de sus mecanismos nerviosos, por la energía a luminosa de ciertas longitudes de onda. La luz está formada por ondas electromagnéticas. ticas. Las ondas forman, según n su longitud de onda, distintos tipos de luz, como infrarroja, visible, ultravioleta o blanca. Las ondas visibles son aquellas cuya longitud de onda está comprendida entre los 380 y 770 nanómetros. Los objetos devuelven la luz que no absorben hacia su entorno. Nuestro campo visual interpreta estas radiaciones electromagnéticas ticas que el entorno emite o refleja, como la palabra "COLOR". Entonces, nuestros ojos reaccionan a la energía a y no a la materia en sí. Desde el punto de vista físico, f el color es luz blanca que se descompone al atravesar un prisma de cristal. La luz es color

6 Teoría Tricromática La luz blanca está formada por tres colores: rojo intenso, verde y azul violeta, que corresponden a ondas de distintas frecuencias. En el caso de un automóvil de color rojo, significa que la pintura que lo cubre está fabricada con pigmentos que absorben las frecuencias correspondientes al verde y al azul (luz que recibe) y reflejan el resto de la luz (la parte roja) lo cual es interpretado por nuestra retina como color rojo.

7 Teoría Tricromática En la retina del ojo humano hay dos tipos de células, c bastones y conos; hay a su vez 3 tipos de conos y cada uno de ellos responde e a una de las siguientes frecuencias fotolumínicas nicas: : Rojo (rojo, naranja, amarillo y verde-amarillo), azul (azul y violeta) y verde. La combinación n de estas tres frecuencias da origen a todos los colores, de modo que según n esta teoría a todo color es en realidad una mezcla de frecuencias de rojo, azul y verde reflejada en algún objeto. Teoría Tricromática Debido a que el proceso de identificación n de colores depende del cerebro y del sistema ocular de cada persona, podemos medir con toda exactitud el espectro de un color determinado, pero el concepto del color producido es totalmente subjetivo, dependiendo de la persona en sí. s Dos personas diferentes pueden interpretar un color de forma diferente, y puede haber tantas interpretaciones de un color como personas hay.

8 Colores primarios y secundarios Para entender mejor la teoría tricromática tica diremos que en la naturaleza existen tres pigmentos (materia en forma de gránulos presente en muchas células c vegetales o animales), denominados básicos o primarios, que pueden reflejar por separado cada uno de los colores básicos: b AMARILLO ROJO AZUL. Si mezclamos los colores primarios entre sís obtendremos colores secundarios : NARANJO VERDE VIOLETA.

9 Colores complementarios Al trabajar con colores, éstos pueden contrastarse o situarse al lado o encima unos de otros. Cuando esto ocurre, se producen efectos visuales que destacan o disminuyen la intensidad (tono) de algunos. Así,, por ejemplo, cuando situamos un color de tono claro (amarillo limón) sobre un fondo blanco parecerá más s "suave" de lo que realmente es, mientras que si lo ubicamos sobre el negro aparentar ará ser más m s "intenso". Pero también n existen parejas de colores denominados "complementarios", entre los que no se producen estos efectos visuales, lo que ayuda a obtener el efecto visual de "tono" deseado. Colores complementarios Los colores complementarios cumplen las siguientes normas: El complementario de un color primario es siempre uno secundario. El complementario de un color terciario es siempre otro terciario. Para "descubrir" cuales son las parejas de complementarios basta con observar un gráfico estándar y ver cuales están "enfrentados" (amarillo y violeta / naranja y azul / rojo y verde / rojo-naranja y azulverde /...)

10 Coloración n y Clasificación n de colorantes Coloración: Proceso mediante el cual un cuerpo es teñido o toma color por la acción n de una sustancia colorante y no desaparece con lavados de la misma sustancia en que se disolvió el colorante.

11 Colorantes: Sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos, ya sean del mismo color que ellas tienen (colorantes ortocromáticos), ticos), o bien teñir de un color distinto (colorantes metacromáticos ticos). (1ª clasificación). Sustancias cromótropas: Son aquellas que provocan el viraje de color en el colorante. Ejemplo: Tionina,, tiñe e de azul casi todos los elementos de una preparación n y de rojo las granulaciones de las células c cebadas y el mucus. Thionin blue (CI 52025) Este cambio de color tiene que ver con las características químicas del colorante y del tejido que se esta tiñendo.

12 Clasificación n o nomenclatura de colorantes Es muy compleja debido a la gran variedad, tamaño o molecular y número de grupos funcionales que poseen estas sustancias. Se utilizan nombres de fantasía a y por tanto hay colorantes que se comercializan con diversos nombres aunque se trate de un mismo compuesto por ejemplo el Luxol fast blue también n se expende con los nombres de Luxol fast blue MBS y Solvent blue 38. Clasificación n o nomenclatura de colorantes La Comisión n de estandarización n de colorantes biológicos publica y actualiza regularmente un listado de los colorantes con sus sinónimos nimos conocidos y su número n de color index (C.I), al cual se debe recurrir para identificar con seguridad un colorante (esto es aceptado internacionalmente). Ver libro Biological Stains de H.J Conn y página p web stainsfile.info/stainsfile StainsFile/jindex.html

13 Clasificación n de colorantes (2ª) COLORANTES NATURALES: En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza pueden ser de origen animal (carmín) o vegetal (hematoxilina, orceína, azafrán, pimentón, etc.). COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA): Son derivados de la destilación de la hulla (tipo de carbón mineral), químicamente todos son sales. -Ácidos: Tienen carga negativa y afinidad por el citoplasma (ej. eosina). - Básicos: Tienen carga positiva y afinidad por la cromatina nuclear (ej. azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno).

14 - Neutros: Se obtienen mezclando en distintas proporciones colorantes ácidos con básicos b (Ej. Eosinato de azul de metileno). Al colorear los tejidos actúan an disociándose, el ácido colorea las estructuras celulares acidófilas (Ej. citoplasma) y la base las estructuras basófilas (Ej. cromatina nuclear). - Indiferentes: no forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del líquido l que ha servido para preparar la solución n colorante (Sudán lll,, rojo escarlata). Componentes Basófilos: Componentes de estructuras que se tiñen con colorantes básicos. b Acidófilos filos: Componentes de estructuras que se tiñen con colorantes ácidos. Neutrófilos: Componentes de estructuras que se tiñen con colorantes neutros. Azurófilos filos: Componentes de estructuras que se tiñen con azul de metileno. Osmiófilos filos: Componentes de estructuras que se tiñen con tetróxido de osmio. Argirófilos filos: Componentes de estructuras que se tiñen con sales de plata.

15 Características de los colorantes Penetración: n: Entrada del colorante a la célula c y a través s del tejido. Inocuo: No debe producir alteraciones en las células c ni en los demás s componentes del tejido a a colorear. Especificidad: Debe colorear ciertas estructuras celulares a través de uniones fuertes. Para poder impartir color son muy importantes sus características químicas, por esto, deben poseer 2 regiones: cromóforo y auxocromo. Características de los colorantes Los auxocromos son grupos ionizables,, los que permiten la unión n del colorante a la sustancia a teñir, a través s de uniones con grupos de carga opuesta. Determinan si son colorantes básicos b (negativos), ácidos (positivos) o neutros, son por tanto, determinantes para su unión n a los tejidos. Ej: Ácidos: -COOH, -OH, -SO3H Básicos: -NHR, -NR2, -NH2

16 Características de los colorantes Los cromóforos son grupos que poseen el color, por lo tanto, cuando se elija que colorante utilizar se debe tener en cuenta las características de los grupos funcionales a determinar, presentan dobles enlaces alternados con enlaces simples. Ej: -C=C- -NO 2 -C=O -N=N - -N=O. Características de los colorantes Algunos colorantes presentan también n grupos modificadores los cuales intensifican el color. También n se debe considerar el tamaño o (PM) de la molécula del colorante y su planalidad (capacidad de rotación) ya que de esto dependerá cuan fácil f y rápido r penetrara dentro de un tejido y por lo tanto a cuales componente celulares se unirá.

17 Clasificación n de colorantes de acuerdo al grupo cromóforo (3ª): Colorantes nitrados Colorantes azoicos Colorantes quinoides Colorantes derivados del dibenzopirano Ptalocianinas Colorantes nitrados Nitrosos: Producto de la interacción n de un compuesto fenólico con el ácido nitroso. N=O (NO) Nitro: Son producto de la interacción n de un compuesto fenólico con el ácido nítrico. n O -N N (NO 2 ) O

18 Colorantes azoicos Monoazoicos Diazoicos Sales de diazonium o diazonio Sales de tetrazolium o tetrazolio R-N=N-R -N=N- grupo azo R = derivado del benceno o del naftaleno Entre los colorantes azoicos hay una variedad que pierde los cromóforos por reordenamiento molecular formando quinoides. Este tipo de colorantes no pueden interactuar con los tejidos por medio de una unión n química, sino que por medio físico. f Ej. Disolución n en un componente orgánico y el lípidos l (como el Sudán III CI 26000). Colorantes quinoides Derivados del arilmetano (radical arilo= cualquier radical de un anillo aromático): Difenilmetano,, trifenilmetano (diamino( diamino, triamino, hidroxitrifenilmetano), difenilnaftilmetano.. No se usan como colorantes propiamente tales sino que como fluorocromos. Derivados del xanteno: Aminados, hidroxilados. Derivados de la acridina Derivados de la quinona-imina imina: azinas (aminoazinas, safraninas), oxazinas, tiazinas. Derivados de la antraquinona: hidroxiantraquinona, aminoquinona. Xanteno Oxazina

19 Ejemplo: Eosina Y CI: Colorante ácido debido a la presencia de un grupo auxocromo carboxilo por lo que tiene afinidad por las estructuras básicas de la proteína, es decir, el citoplasma por ejemplo. Soluble en agua y alcohol. Posee 4 grupos bromo que son los modificadores y un anillo quinoide. Colorantes derivados del dibenzopireno En general son colorantes naturales: Hematoxilina (CI 75290): Origen vegetal extraído del árbol del Campeche, no tiene poder colorante por si misma, pero se oxida fácilmente a hemateína un colorante debelmente ácido. Carmín n o ácido carmínico: Origen animal, fue de los 1º 1 en utilizarse, pigmento rojo extraído de la cochinilla (parasito de un cactus mexicano), proviene de las hembras y se encuentra en el vitelo de los huevos, hoy en día d a se prepara (artificialmente) a partir del ácido carmínico. Orceína na: Origen vegetal (liquenes( liquenes), incolora pero al tratamiento con amonio y exposición n al aire se torna azul o violeta debido a algunos compuestos fenólicos entre ellos el Orcinol,, la fórmula f exacta es desconocida y se utiliza para teñir fibras elásticas y cromosomas.

20 Cochinilla Campeche Hulla Métodos de coloración

21 Métodos de coloración Coloración n en bloque: Colorea a la pieza en su conjunto antes de cortarla. Es poco utilizada. Coloración n en cortes: Colorea cada corte por separado. Es el método más m s largo pero de resultados superiores. Coloración n directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto. Coloración n indirecta: requiere la intervención n de intermediarios o mordientes para que la coloración n tenga lugar. Métodos de coloración Coloración n progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo. Coloración n regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación. n. Coloración n simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo, fibras elásticas, etc.). Coloración n combinada: se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos ticos recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores básicos b y ácidos que contrastan por sus colores.

22 Métodos de coloración Coloración n panóptica: ptica: es una coloración n combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros (May-Gr Grünwald-Giemsa Giemsa). Coloración pancrómica mica: en un solo baño o colorante actúan an todos los colorantes neutros que se necesiten. Coloración n citoplasmática: tica: Se obtiene con el uso de colorantes ácidos. Ej. Orange G, eosina, verde luz, etc. Coloración n nuclear: Se obtiene con el uso de colorantes básicos. b Ej. Tionina,, azul de toluidina, fucsina básica, b etc. Coloración n vital: Coloración n de organismos vivos. Ej. Mitocondrias con verde jano,, macrófagos con rojo neutro, etc.