Evaluación i n vitro

Transcripción

1 Evaluación in vitro del efecto amebicida de los extractos etanólicos obtenidos de tres especies de liquenes mexicanos: Usnea florida, Poltigera cannina y Parmelia boleana. La amibiasis es una infección del tracto gastrointestinal causada por el protozoario parásito Entamoeba histolytica, el cuál es capaz de invadir la mucosa intestinal provocando amibiasis luminar asintomática, sin embargo, ocasionalmente puede penetrar la mucosa intestinal y diseminarse a otros órganos. De acuerdo con la organización Mundial de la Salud, esta enfermedad ocupa la segunda posición como causa de muerte debida a infecciones por protozoarios, después de la malaria. México es uno de los países en el mundo en el que la amibiasis se presenta con mayor incidencia y se encuentra entre las diez primeras causas de muerte. Sin embargo los reportes de fallas en los tratamientos y la generación de clonas resistentes, y recientemente el aislamiento de cepas refractarias al tratamiento sugieren que de manera natural el parasito pudiera estar desarrollando mecanismos de resistencia. Desde hace varios años nuestro grupo ha estado investigando uno de ellos que es el fenotipo de resistencia a múltiples drogas (MDR), se ha definido como la capacidad de presentar resistencia cruzada a fármacos no relacionados bioquímicamente ni estructuralmente (Gros, 1996). En México, los líquenes son otro tipo de plantas, son usados como antibióticos, antitumorales, antiparasitarias que se utilizan en la medicina tradicional. Estos compuestos representan una real posibilidad en la investigación de nuevas drogas antiparasitarias que sean más eficientes y tolerables por el ser humano. Los líquenes se definen como la asociación simbiótica entre un hongo y uno o más organismos autótrofos fotosintéticos, que pueden ser una alga verde a una cianobacteria (chaves, et al., 2005, Huneck S. 1999). Actualmente se considera que los líquenes forman parte del reino de los hongos; la diferencia radica en su forma de nutrición, porque los líquenes reciben el alimento orgánico de las algas (Fotobionte). Los líquenes del género de Parmelia sp han desempeñado un papel importante en la medicina antigua pues se solían indicar para afecciones de pulmón y el hígado, así como las alteraciones menstrual, mientras que en la medicina popular española se les ha citado especialmente contra trastornos renales y respiratorios. En la farmacología moderna se ha

2 mostrado que los metabolitos de Parmelia presentan actividad citotóxica, acción inhibitoria contra la síntesis del leucotrieno B4 y propiedades antimycobacterial (Pieroni, 2000). Un ejemplo del efecto antiparásito de un liquen se reporto en el trabajo de Jiménez y colaboradores en donde se detecto el efecto del extracto de liquen de Usnea florida sobre la implantación y fecundación del estadio adulto de Trichinella spiralis en ratones BALBC. Se realizó un estudio para ver el efecto del extracto antibacteriano y tóxico del extracto Parmelia bolliana; este extracto mostró la presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, flavanoides y terpenos. Se realizaron ensayos de la actividad antimicrobiana del extracto en presencia de las cepas de Gram positivos como Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis y en cepas Gram negativas como Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Shigela boydii, Salmonella typhymurium y Klebsiella pneumoniae. Teniendo como resultados al análisis microbiológico que el extracto presenta actividad antibacteriana contra Staphylococcus epidermis, Staphylococcuspyogenes y Bacillus subtilis; así como fue resistente para Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. También se observó el efecto tóxico del extracto el cual se incrementó conforme se aumentó la concentración de la dilución del extracto; presentando un efecto tóxico en el crecimiento de raíces de Alium cepa, debido a la alteraciones provocadas en el índice mitótico (Silvia., et. al. 1999). Un ejemplo de liquen es Parmelia bolliana, en este se mostraron metabolitos secundarios como alcaloides, flavanoides, azucares quinonas glicósidos y terpenos; los cuales microbiológicamente se demostró que el extracto crudo presentó actividad antimicrobiana solo contra bacterias gram positivas, así como efectos tóxicos (Silvia, et. al 1999.). OBJETIVO Evaluar in vitro el efecto amebicida de los extractos etanólicos obtenidos de tres especies de liquenes mexicanos: Usnea florida, Poltigera cannica y Parmelia boleana.

3 OBJETIVOS PARTICULARES Estandarizar las distintas concentraciones de los 3 diferentes líquenes en la clona sensible (CA) mediante cinéticas de viabilidad. Obtención de la concentración inhibitoria de las 3 especies de líquenes. Evaluación in vivo de estos tres líquenes y determinar su efecto anti-amibiano. MATERIAL Y METODOS: Cultivos de Entamoeba histolytica Trofozoitos de la clona A serán cultivados en medio de TYI-S33 axénicamente a 37 ºC. Obtención del extracto liquénico El liquen Parmelia bolliana se colectará en el Estado de México. Se pesará 32.4g del liquen, este se molerá y extraerá con etanol 96º a temperatura ambiente, se eliminará el disolvente hasta obtenerlo en forma semisólida; el cuál será disuelta en dimetil-sulfóxido al 4% (DMSO). Cinética de crecimiento: Se determinará la concentración inhibitoria mínima (CIM) del extracto; es decir, la concentración al 50% a la cual se inhibe el crecimiento amibiano; por medio de una cinética de crecimiento o viabilidad; para lo cual se cultivarán trofozoítos de la clona A de Entamoeba histolytica en medio de TYI-S33 en presencia de diferentes concentraciones de extractos de liquen de Parmelia bolliana. Se empleará un inóculo de 5X10 4 trofozoítos de la clona A, en 13 ml del medio de crecimiento TYI-S33 y distintas concentraciones de extracto de liquen (100, 150 y 200g/ml). Posteriormente, utilizando una cámara de Neubauer se contará el número de amibas cada 24 horas. Para la cinética de crecimiento se utilizará como control negativo trofozoítos con dimetil-sulfóxido al 4% (DMSO) y como control positivo se utilizarán trofozoitos.

4 Resultados: La mayoría de los fármacos utilizados para la amibiasis presentan un margen terapéutico estrecho y con diversos efectos secundarios en el hombre. Se ha reportado que los parásitos han desarrollado mecanismos moleculares que les han permitido su adaptación y su sobrevivencia, de esta manera evitan los efectos letales de los fármacos. Por ejemplo algunos de los mecanismos son: mutaciones en proteínas involucradas en procesos de detoxificación, codificación extracromosomal de enzimas inactivadoras de fármacos, modificadores de las moléculas involucradas en la reparación celular, cambios en la expresión y estructura de las moléculas blanco, alteraciones en la permeabilidad de la membrana, sobreexpresión de proteínas de membrana dependientes de energía involucradas en el transporte de drogas, entre otros (Khaw and Panosian, 1995). En Entamoeba histolytica se ha reportado resistencia a algunos de los fármacos anti-amibianos más usuales en la práctica médica; esto ya que la amiba a creado mecanismos de sobrevivencia; por ejemplo, la sobreexpresión de la enzima superóxido dismutasa-fe (SOD-Fe), la cual está directamente relacionada con la resistencia a metronidazol; esta resistencia fue confirmada al aislar quirúrgicamente trofozoítos resistentes al metroniazol de pacientes con abscesos hepáticos (Hanna, et. al., 2000). Otro mecanismo de resistencia a fármacos es el llamado el fenotipo de resistencia a múltiples drogas (MDR). En la medicina tradicional mexicana el uso de extractos de plantas con actividades anti-parasitarias es muy frecuente. Estos compuestos naturales representan una real posibilidad en la investigación de nuevos fármacos anti-parasitarios estos podrían ser mas eficientes y mejor tolerados por el humano. En el presente trabajo se evaluó in vitro el efecto anti-amibiano de los extractos etanólicos de tres especies de líquenes mexicanos: Usnea florida, Poltigena cannina y Parmelia boleana. Para poder realizar este trabajo se hizo una colaboración con el Dr. Silva Torres de la Escuela de Ciencias Biológicas del IPN, los líquenes fueron recolectados en llano grande, del estado de México. El espécimen de cada uno de los líquenes fue depositado en el herbario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. El extracto crudo fue obtenido de 32.4g de cada liquen usando etanol al 96%. La mezcla se dejo a

5 temperatura ambiento por 30 días a temperatura ambiente (22ºC). Posteriormente el etanol se evaporo a presión reducida hasta sequedad, obteniéndose una muestra que se pesó y se consideró como extracto crudo. Para conocer la naturaleza del extracto se practicaron pruebas bioquímicas preliminares consistentes en la determinación de alcaloides, flavonoides, azúcares quinonas y glicosidos. Una vez que se tuvieron listos los extractos de líquenes se procedió a determinar si alguno de ellos tenían un efecto antiamibiano. Para cumplir los siguientes objetivos se procedió a realizar cinéticas de viabilidad, con la finalidad de determinar cual de ellas tenia el efecto, y además de encontrar la IC50 de cada uno de ellos.

6 FIGURA 1. Efecto del extracto etanólico del liquen Usnea florida en la viabilidad de trofozoitos de la clona A. 5x10 4 trofozoitos fueron incubados a 0, 100, 150 y 300 µg/ml del extracto etanólico. Se contaron cada 24 hasta 72h. La viabilidad de los trofozoitos fue determinada por el colorante de exclusión azul de tripano. Utilizando un microscopio invertido (Nikon TE-300) y una cámara de Neubauer.

7 FIGURA 2. Cinética de Viabilidad de la Clona A en presencia del extracto etanólico P. cannina 5x10 4 trofozoitos fueron incubados 0, 100, 150 y 300 µg/ml del extracto etanólico. Se contaron cada 24 hasta 72h. La viabilidad de los trofozoitos fue determinada por el colorante de exclusión azul de tripano. Utilizando un microscopio invertido (Nikon TE-300) y una cámara de Neubauer.

8 FIGURA 3. Efectos del extracto etanólico de P. boleana en la viabilidad de los trofozoítos de la clona A. 5x10 4 trofozoítos fueron crecidos en presencia de 0, 100, 150 y 200 µg/ml del extracto etanólico. Las células fueron contadas cada 24h hasta 72h. Viabilidad de los trofozoitos fue determinada utilizando el colorante de exclusión azul de tripano, utilizando un microscopio invertido (Nikon TE-300) y una cámara de Neubauer.

9 CONCLUSIONES: Las especies de liquenes se ha demostrado que tienen efectos bactericidas (Gram positivos) (Culberson., 1997) y fungicidas (De Battisi., 1991). Recientemente el Dr Silva (comunicación personal) realizó ensayos in vitro demostró que a la concentración de 700 μg del extracto etanolico de U. florida produjo un significativo decremento en el crecimiento de gusanos adultos de T. spirals en el intestino de ratón. En este trabajo demostramos que la especie de liquen del extracto de P. boleana presentó un importante efecto anti-amebicida en comparación con las otras dos especies utilizadas de líquenes mexicanos. La concentración letal es decir IC50 fue baja que utilizaron en otros patógenos. En este momento nosotros estamos separando los compuestos orgánicos de la especie de liquen de P. boleana para poder identificar los compuestos que contiene este extracto, y así poder valorar cual de ellos tiene presenta el efecto amebicida, y esto se esta realizando, mediante la técnica de HLPC. Bibliografía: 1.- Culberson C.F., Culberson W.L., Johnson A (1997) American Bryological and Lichenological Society, Missouri Botanic Garden, St. Louis, Mo. 2.- De Battisi F., Codolo R., Nicolato A. (1991) Chron Derm 3: Fernández E., Quilhot W. González I, Hidalgo M.E., Molina X., Meneses I. (1996) Cosmetics toiletries 111: Gros P., Neriah B., Croop J. and Housman D.E. (1996). Isolation and expression of a complementary DNA that confers mulltidrug resistance Nature, 323, Huneck S. (1999). The significance of lichens and their metabolites. Naturwissenschaften. 86:

10 6.- Pieroni A. (2000). Medical plants and food medicines in the folk traditions of the upper Lucca Province. Journal of Ethnopharmacology 70: Silva T.R., Montellano R. H., Salazar G.G., Vazquez B.R., Castro M.E. (1999). Estudio del efecto antiamibiano y tóxico del extracto crudo de Parmelia bolliana. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. 30,4; World Health Organization Bull W.H.O. 72,