Proteasas. Bioquímica de Proteínas 2018

Transcripción

1 Proteasas Bioquímica de Proteínas

2 Reacción no catalizada La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico por el átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico formando un intermediario tetraédrico. El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico hace que el carbono carbonílico sea mucho menos reactivo que los carbonos carbonílicos en los ésteres. La tarea catalítica de las proteasas consiste en transformar al carbono carbonílico, normalmente no reactivo, en mucho más susceptible al ataque nucleofílico por el agua. 2

3 1) Función digestiva. a) Extracelular. b) Intracelular. 2) Turnover proteico. FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS. 3) Procesamiento post-traduccional de proteínas. a) Proteasas del péptido señal. b) Proteasas de procesamiento de pro-hormonas y otras proteínas. c) Dominio pro- en muchas proteinasas. 4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales).

4 Proteasas: Endo y exo Las endopeptidasas hidrolizan uniones peptídicas internas en una cadena polipeptídica, tendiendo a actuar lejos del N- terminal o del C-terminal. Las exopeptidasas requieren un amino terminal, un carboxilo terminal, o ambos, libres, e hidrolizan una unión peptídica a no mas de tres residuos desde el N terminal o del C terminal. Según el extremo que cortan, serán aminopeptidasas o carboxipeptidasas.

5 Clasificación de Proteasas Por la reacción catalizada: son pocos los casos en que se conoce exactamente la reacción catalizada, en términos de qué unión es hidrolizada en el substrato. Se aplica sobre todo a exopeptidasas. Por el mecanismo catalítico: es la más usada, desde su propuesta por Brian Hartley hace más de 50 años. Se basa en cuáles son los grupos que intervienen en la catálisis y en cómo actúan. Por su secuencia y estructura: es la clasificación más moderna, propuesta por Alan Barrett, y complementa a la anterior. 5

6 Exopeptidasas: clasificación por el tipo de reacción catalizada Aminopeptidasa: libera un único residuo desde el N-t no bloqueado de su sustrato. Dipeptidil-peptidasa: hidroliza un dipéptido desde el N-t de su sustrato. Tripeptidil-peptidasa: hidroliza un tripéptido desde el N-t de su sustrato. Carboxipeptidasa: libera un único residuo desde el C-t no bloqueado de su sustrato. Peptidil-dipeptidasa: hidroliza un dipéptido desde el C-t de su sustrato. Dipeptidasa: hidroliza un dipéptido, y típicamente requiere que ambos extremos estén libres. Omega-peptidasas: no requieren un N-t o un C-t libre en el sustrato. Frecuentemente actúan cerca de uno u otro extremo del péptido. Algunas hidrolizan uniones peptídicas que no son uniones alfa, como las ubiquitin hidrolasas, las piroglutamil peptidasas y la gama-glutamil hidrolasa. 6

7 Peptidasas específicas para uniones peptídicas con Prolina 7

8 Endopeptidasas: clasificación por el tipo de reacción catalizada Pueden ser denominadas en base a la preferencia por un determinado residuo en P1 o en P1 (por ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidil-lisil endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual especificidad, hay que distinguirlas (glutamil endopeptidasas I y II). En la gran mayoría de los casos, la especificidad es demasiado compleja, y se usan nombres triviales (pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína, termolisina) 8

9 Proteasas: Clases mecanísticas Serín Proteasas Cisteín proteasas Treonin proteasas Asn proteasas Asp/Asn Glu proteasas Aspartil proteasas Metaloproteasas Glu/Gln 9

10 Proteasas: Clasificación por relación evolutiva Propuesta en 1993 por Alan J. Barrett y N.D. Rawlings (Cambridge, UK). Comparación de secuencias proteicas y clasificación en: Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína ancestral por evolución divergente. Tienen homología estadísticamente significativa, al menos en el dominio catalítico (es decir, en el que tiene actividad de proteasa). Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común. La homología de secuencia entre ellas es mucho más baja, pero se conservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y los pequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen una estructura terciaria similar. La información, que se mantiene actualizada, está contenida en la base de datos MEROPS (merops.sanger.ac.uk). Se complementa con la nomenclatura de enzimas de la IUBMB (peptidasas, EC 3.4; la cruzipaína es EC y C en MEROPS). 10

11 Al 4/5/2017: 5 clanes A, 10 C, 2 G, 15 M, 5 N, 5 P y 12 S. 16 familias A, 71 C, 2 G, 72 M, 7 N, 44 P (incluyen 4 familias T), 36 S y desconocidas

12 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA. 1.SUSTRATOS PROTEICOS. 1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina, caseína) a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de A 280 nm en el sobrenadante. b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante. 2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína, azoalbúmina) Precipitación y lectura de la A 440 nm de los azopéptidos. 3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales: Caseína ligada a isotiocianato de fluoresceína (FITC-caseína). Excitación a 490 nm y emisión a 525 nm. 4) Proteínas específicas. a)colágenos para colagenasas. b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de su mrna), para las proteinasas del péptido señal.

13 5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos ( 125 I en Tyr). Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante. 6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada. a) HPLC en fase reversa. b) SDS-PAGE. c) Filtración por gel. 7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos, inmovilizados). a) Electroforesis en gel de poliacrilamida. Actividad determinada in situ después de la electroforesis. - Métodos histoquímicos: b-naftilamidas y Fast Garnet. - Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. Gel lavado para eliminar el SDS, incubado al ph adecuado, teñido con Coomassie Blue. Actividad detectada como zonas incoloras sobre fondo azul. b) Ensayos de ELISA Determinación de colagenasa. Ab anti-colágeno, revelado con Ab contra la IgG usada conteniendo un cromóforo adecuado.

14 2. SUSTRATOS SINTETICOS: Péptidos cromogénicos o fluorogénicos. a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni carboxilo libres). Bz-L-Arg-NHNan, 400 nm. b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo bloqueado). L-Arg-NHNan, 400 nm. c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino bloqueado). {N-(3-[2-furyl]acryloyl)}-Ala-Lys (FA-Ala- Lys), 340 nm. Grupos bloqueantes del amino: Benzoil (Bz); Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil (Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc); Furil-acriloil (FA).

15 Ensayos espectrofotométricos: a) 4-nitroanilidas (NH-Nan): Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A 400 nm difiere en aprox M -1 cm -1 entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina a ph 8.0. Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas. b) 2-naftilamidas (NH-Nap): La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere de las 2-naftilamidas en aprox M -1 cm -1. Esto depende del ph: por debajo de 5.5 no hay diferencia. Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución). c) Amidas y ésteres: La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad.

16 Ensayos fluorimétricos: a) 2-naftilamidas: 3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación. Sensible al ph. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm. b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec): Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente que el conjugado. Excitación a 380 nm, emisión a 460 nm. c) Sustratos fluorogénicos apagados intramolecularmente ( quenching ): Abz-gly-Phe(NO 2 )-Pro (sustrato de ACE). La proteólisis libera Abz-Gly, fluorescente. Excitación a 310 nm, emisión a 410 nm.

17 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO Nomenclatura de Schechter y Berger (1967)

18 Determinación de la especificidad de sustrato

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20 La tríada catalítica Serín Proteasas 20

21 Estructura de la quimotripsina (D. Blow, 1967)

22 Mecanismo de reacción 22

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24 Uniones que intervienen en la estabilización del intermediario tetraédrico.

25 Especificidad de sustrato: el subsitio S1 25

26 Subtilisina: una proteasa bacteriana Sin relación evolutiva aparente con la familia de la quimotripsina/tripsina de mamíferos (sin semejanza en su estructura primaria o terciaria). Igual mecanismo catalítico que las serin proteasas de mamífero: una Ser catalítica asistida por una His y un Asp (tríada catalítica), en la misma orientación, y un agujero del oxianión para estabilizar intermediarios oxianión (estados de transición) Ejemplo de evolución convergente: evolución independiente de la misma estrategia catalítica. 26

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30 Activación del tripsinógeno Varias proteasas digestivas son sintetizadas en el páncreas como proenzimas inactivas (zimógenos), de modo que no comiencen a atacar a las células que las producen. Estas proenzimas digestivas se almacenan en las células pancreáticas como gránulos secretorios, y se vierten en el duodeno por el conducto pancreático. El tripsinógeno es activado por clivaje proteolítico de la unión peptídica entre Lys 6 y la Ile 7. El oligopéptido con los primeros 6 residuos de aminoácidos se pierde y la Ile 7 pasa a ser el N-terminal. La carga positiva asociada con el N-terminal está ahora en una nueva posición y permite la correcta organización del sitio catalítico. La reaccción que activa al tripsinógeno es catalizada por la proteasa enteropeptidasa, que es una proteína de membrana expuesta sobre la superficie externa de las células de la mucosa que tapiza el duodeno. La enteropeptidasa es específica para la secuencia Lys-Ile presente en el tripsinógeno. La cantidad de enteropeptidasa presente es muy pequeña, y puede activar sólo una pequeña fracción del tripsinógeno total. 30

31 La tripsina es el activador común de las proenzimas pancreáticas K I R I 31

32 Inhibidores de emergencia El trauma a órganos internos que daña el páncreas puede causar pancreatitis, una condición dolorosa y muy peligrosa en la cual trazas de tripsina escapan y atacan células, activando sus granos de zimógeno almacenados. El resultado es una tendencia acelerada del páncreas para digerirse a sí mismo y a los órganos próximos. Para prevenir la activación prematura del tripsinógeno, el páncreas produce tambien pequeñas cantidades del inhibidor secretorio pancreático de la tripsina. Este es una proteína pequeña que expone una región similar a un sustrato, que es atacada por la tripsina. Sin embargo, el inhibidor está diseñado para unirse a la tripsina extremadamente fuerte (Ki=10 13 M),de modo que el producto de la reacción no se libera fácilmente y continúa ocupando el sitio catalítico. Hay inhibidor suficiente para controlar trazas de tripsina que pudieran desarrollarse accidentalmente, y es capaz de impedir que se gatille la activación del tripsinógeno remanente dentro del páncreas. Una vez que el tripsinógeno es secretado en el duodeno, la enteropeptidasa puede producir tripsina en cantidad suficiente para neutralizar las trazas de inhibidor, y la autoactivación puede tener lugar. 32

33 SERPINAS SERPINS: Serine proteinase inhibitors. Representan la familia de inhibidores más grande y funcionalmente más diversa (aprox secuencias de serpinas se han identificado en los 5 reinos, 36 genes en humanos, 60 en ratones). Proteínas en general monoméricas, MW kda. Incluyen proteínas como: α1-antitripsina, α1-antiquimotripsina, antitrombina III, cofactor II de la heparina, inhibidor de C1, α2-antiplasmina, inhibidores I y II del activador del plasminógeno, inhibidor de la proteína C, y proteasa nexina-1. Tienen una estructura secundaria conservada con un loop reactivo (RCL) que interacciona con el sitio activo de la proteasa inhibiéndola. 33

34 En muchos casos se forma un complejo tetraédrico con el inhibidor, que es clivado por la proteinasa y se forman complejos covalentes. Las serpinas clivadas tienen estructuras conformacionalmente mas estables que las nativas. El clivaje induce un cambio conformacional mayor, y los dos residuos que formaban la unión reactiva quedan en sitios opuestos de la molécula. 34

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36 Serpinas asociadas con enfermedades en humanos La Alfa 1-antitripsina protege a los tejidos de las proteasas presentes principalmente en las células inflamatorias, en especial la elastasa. La deficiencia de alfa-1 antitripsina (trastorno hereditario) lleva a una degradación tisular durante la inflamación. Esto causa enfisema pulmonar y lleva a la cirrosis hepática en casos severos. La deficiencia de antitrombina es una enfermedad genética rara que generalmente sale a la luz cuando el paciente sufre trombosis venosas recurrentes y embolismo pulmonar 36

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38 Ovomucoide: Inhibidor tipo Kazal

39 Inhibidores de serín peptidasas Diisopropil fluorofosfato (DIPF). Simula el estado de transición tetraédrico. Se combina con el residuo de serina en el sitio activo de la enzima acetilcolinesterasa, que desactiva al neurotransmisor acetilcolina. Si la enzima es inhibida, la acetilcolina se acumula y los impulsos nerviosos no pueden ser detenidos, causando contracción muscular prolongada. Esto produce parálisis que puede llevar a la muerte, dado que los músculos respiratorios están afectados. 39

40 Fenil-metil-sulfonil fluoruro 40