Crecimiento y cultivo vegetal

Transcripción

1 INICIACIÓN Y ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS El primer paso para implantar un cultivo de células vegetales es la iniciación en medios sólidos a partir de los explantos más adecuados. En este sentido debemos diferenciar a un explanto que es un trozo de material vegetal aislado de la planta madre para ser cultivado de un inóculo que es el material vegetal que es subcultivado pero que proviene de un cultivo in-vitro en el mismo estado. En la elección de un explanto debe tenerse en cuenta tanto el tipo de tejido del cual proviene como su edad. Con referencia a este último punto hay que distinguir entre un explanto jóven, término que es antónimo de viejo y se refiere a la edad cronológica y un explanto juvenil que es el opuesto de adulto y hace referencia al período de vida del órgano del cual es extraído. Lo ideal es elegir explantos juveniles por ejemplo que contengan yemas en reposo que se hallan en la base de los tallos de las plántulas, de raicillas nuevas o de cualquier tejido próximo al sistema radicular, aunque en la práctica se intenta generalmente iniciar cultivos a partir de hojas. La iniciación de los cultivos en medio sólido, se basa en la respuesta que se induce para reparar una lesión producida sobre un órgano de una planta. Esta respuesta consiste inicialmente en la división de las células adyacentes a la herida. Si la sección herida se cultiva en condiciones de asepcia, sobre un medio de cultivo definido, la respuesta inicial de división celular puede ser estimulada e inducida a continuar indefinidamente, a través de la influencia de diferentes componentes del medio de cultivo, siendo considerandos como principales efectores a los reguladores de crecimiento. El resultado de este crecimiento es una masa celular que se divide constantemente, generalmente poco diferenciada. Este agregado de células vegetales desorganizado, es lo que ya ha sido definido como callo. En términos morfológicos los callos pueden definirse como compactos y friables. Los compactos, son callos de mucha consistencia, debido a que presentan un fuerte contacto entre las células. Los friables, no son muy consistentes, se disgregan fácilmente, debido a que sus células están poco asociadas. Presentan un crecimiento más uniforme y son los más adecuados para la iniciación de suspensiones celulares. Están formados por una variedad de células desde parenquimatosas hasta altamente organizadas con propiedades de primordio de órganos. Mayoritariamente, están constituidos por masas de grandes células vacuolizadas con tejido meristemático en la superficie que genera, hacia adentro, la nueva masa del callo

2 y hacia afuera embriones o yemas. Las células meristemáticas se dividen, crecen y vuelven a dividirse, lo que permite al cultivo crecer en forma indiferenciada e indefinida. Durante la dediferenciación los productos de almacenamiento desaparecen y se originan nuevos meristemas que producen células parenquimatosas indiferenciadas sin ningún orden estructural. La falta de organización persiste mientras el calo prolifera aunque a medida que crece algunos tipos de células especializadas pueden formarse. Loa calos parecen no tener un patrón de organización, pero con frecuencia se detectan centros de actividad meristemática y rudimentarias regiones cambiales con áreas de diferenciación vascular. En caso de ocurrir procesos de diferenciación celular se produciría la aparición de nuevos órganos, conocida como organogénesis, necesariamente acompañada de la aparición de nuevos tejidos, denominada histogénesis. De lo expuesto s e desprende que existe una gran variabilidad entre un tipo celular diferenciado definido y un cultivo de callos. Un calo homogéneo formado sólo por células parenquimatosas raramente se encuentra y la citodiferenciación más común es la formación de traqueadas, células suberizadas, secretorias y tricomas. Pequeñas áreas de células en división forman lo que se denomina meristemoides o nódulos vasculares que puedentransformarse en centros de formación de ápices de vástagos, primordios radiculares o incipientes embriones. Teniendo en cuenta lo antes señalado y observando el esquema que representa el ciclo de crecimiento celular, puede decirse que mantener un cultivo indiferenciado equivale a preservar en el tiempo una separación entre el crecimiento y la diferenciación. Esto resulta bastante complejo, dado que en realidad ambos fenómenos se encuentran estrechamente unidos. Senescencia Células meristemáticas aumento de protoplasma División Diferenciación Célula madura Muerte celular Expansión Cultivos en medio sólido Ciclo de crecimiento celular. (Barceló Coll, 1987)

3 Una vez lograda la indiferenciación del material vegetal empleado para iniciar los cultivos a la biomasa generada se la denomina callo. Los cultivos de callos en medios sólidos se estabilizan mediante repiques o subcultivos quincenales o mensuales, dependiendo del grado de crecimiento de los mismos, la disponibilidad de nutrientes y el equilibrio de presiones parciales de O 2 y CO 2 reinante en el recipiente de cultivo (generalmente cajas de petri). Las células internas vacuolizadas soportan nutricia y fisiológicamente a los meristemas externos. Los callos producen inestabilidad genómica por su tendencia a duplicar el número de cromosomas por endorreduplicación causando poliploidía o a perder cromosomas individuales, por lo que, frecuentemente, los tejidos en cultivo cambian su morfología pero se pueden producir equilibrios histogénicos cuantitativos y funcionales en cultivos prolongados que respeten los periódicos subcultivos, ya que frecuencia de estas anormalidades aumenta con la edad de los cultivos (tiempo entre repiques). La inestabilidad puede ser también epigenética, es decir debida a la expresión selectiva de los genes ocasionando cambios fenotípicos que no son el resultado de variaciones en el ADN. Aunque no hay transmisión de este tipo de variaciones por meiosis a la progenie, los cambios epigenéticos resultan hereditarios y estables porque se manifiestan en las generaciones de células hijas. Un ejemplo de esto es la habituación a ciertos fitorreguladores como las citoquininas. Se denomina línea celular a cualquier cultivo que se mantenga en condiciones aisladas, mientras que un clon debe ser obtenido a partir de una sola célula o de un solo agregado celular suponiendo que se generó a partir de una célula aislada. El mantenimiento de las líneas celulares en medios sólidos facilita en gran medida el manejo operacional. El tipo de organización y respuesta de un callo depende primariamente de la especie vegetal, del tejido utilizado y de la composición hormonal del medio de cultivo. La competencia a la diferenciación es un término que hace referencia a la capacidad de un cultivo celular para diferenciar o hacer morfogénesis ante estímulos apropiados, se refiere básicamente al mantenimiento de la totipotencia.

4 Influencia de los fitorreguladores en el establecimiento y mantenimiento de cultivos in-vitro. Numerosos estudios realizados tanto en plantas entera como en órganos aislados y cultivos celulares han demostrado que los reguladores vegetales presentan sinergismo, antagonismo o interacciones aditivas. Los potenciales puntos de control o interrelación entre dos fitorreguladores se esquematizan en el siguiente diagrama Hormona A I II III... Puntos de acción de una hormona B sobre una hormona A 1. Control de la abundancia de la hormona A. 2. Modificaciones de la percepción de la hormona A. 3. Inhibición o estimulación de los procesos de transducción de la señal inducida por la hormona A. 4. Regulación de la transcripción o traducción. 5. Modificaciones postraduccionales. 6. Interacción a nivel de la respuesta fisiológica. Para el caso de los vegetales, más específicamente el de la interacción de auxinas y citoquininas se han esclarecido, hasta el momento, algunos ejemplos de interacción. Estos están circunscriptos al primer punto, dónde se regula la disponibilidad de una determinada sustancia reguladora en su forma activa: Las citoquininas inhiben las enzimas que catalizan la conjugación de AIA, ocasionando un incremento en la concentración de auxina libre que es la que presenta actividad frente a sus receptores específicos.

5 Las auxinas actúan manteniendo la dominancia apical bien por inhibición de la síntesis de citoquininas o de su transporte desde la raíz. El catabolismo de las citoquininas esta mediado por la enzima citoquinina oxidasa, las auxinas sintéticas incrementan notablemente la actividad de esta enzima. Los conjugados de AIA-glucosa podrían inhibir la actividad de la β glucosidasa que transforma los conjugados de citoquininas en hormona libre, aunque no sean los sustratos propios de la citada enzima. En cultivo de tejidos la morfogénesis está regulada por la relación auxina /citoquininas. Así, si la relación es mayor que uno se generan raíces, si es menor que uno tallos y si es aproximadamente uno tejidos indiferenciados o callos. Frecuentemente altas concentraciones de auxinas y citoquininas promueven el desarrollo de tejidos indiferenciados o la formación de raíces, mientras que bajas concentraciones inducen el desarrollo de vástagos (Esquema III). Sin embargo las proporciones mencionadas difieren de una especie a otra, de allí que la regeneración dependa tanto de los fitorreguladores utilizados como de las especies en las que se ensaya. Citoquininas (mg.ml -1 ) 10 1 dominancia de vástagos dominancia de raíces 0.1 dominancia de callos Auxinas (mg.ml -1 ) Esquema III La apoyatura teórica de estos datos experimentales se basa, en que el ciclo celular de las plantas esta regulado por la serina-treonina quinasa cuya actividad esta modulada por su asociación con las subunidades regulatorias de la ciclina. En términos generales podemos decir que las auxinas inducen la expresión de la proteína cdc2 y las citoquininas modulan su actividad. Si bien la expresión aumenta con la combinación de auxinas y citoquininas. La

6 expresión de la proteína ciclina δ3 es necesaria para la activación de la cdc2 y esta es citoquinina dependiente. También se requiere de sacarosa que ejerce un efecto sinérgico con las citoquininas. Este es un ejemplo de mecanismo sinérgico de la interacción auxinacitoquinina en el cual se requiere del segundo grupo de fitorregulador para activar una proteína cuya síntesis es dependiente del primer grupo. El fenómeno descripto es dependiente del tejido en el que se produce, puesto que en raíces las citoquininas antagonizan el efecto de las auxinas al reducir los niveles de cdc2. Diferenciación Diferenciación terminal División celular Dormancia Totipotencia Competencia para la división Activación de cdc2 Expresión de cdc2 Auxinas Citoquininas Expresión deδ3-ciclinas Auxinas Citoquininas Sacarosa Señales celulares específicas Otro mecanismo de control que ejercen las células sobre las concentraciones hormonales efectivas son los procesos de almacenamiento, modificación o degradación. Las modificaciones más frecuentes son las conjugaciones con azúcares o aminoácidos. Algunos conjugados, especialmente aquellos con hidratos de carbono, por ejemplo las auxinas unidas a azúcares son inactivas mientras que unidas a aminoácidos son activas. Los conjugados presentan diferencias en cuanto a la capacidad de ser transportados. Las diferencias entre los distintos tejidos una misma especie se deben en muchos casos a la actividad diferencial de las enzimas de conjugación. Se observa que los callos que se adaptan a concentraciones normalmente tóxicas de 2,4-D presentan alta actividad

7 enzimática de los sistemas de conjugación con azúcares. Otro sistema de detoxificación para 2,4-D es la incorporación del mismo a la lignina. Es factible que los fitorreguladores exógenos inhiban la síntesis de los endógenos por feed-back, lo que en casos extremos se traduce en una concentración celular activa de las mismas más baja. Los agregados celulares suelen generar su propio microambiente interno, regulando sus concentraciones hormonales en forma independiente del medio externo. Este hecho presenta importantes implicancias ya que se deben considerar las diferencias entre la composición del medio y el la influencia realmente percibida por parte de las células.

8 Podriamos resumir el uso de fitorreguladores vegetales en el siguiente cuadro: FITORREGULADOR PROPOSITO RANGO OBSERVACION AUXINAS IAA Inducción de callos µm Estimulación de organogénesis 1-10 µm IBA Inducción de callos µm Regeneración de raíces 1-10 µm 2,4-D Inducción y mantenimiento de callos y cultivos 1-50 µm sumergidos en estado indiferenciado pcpa Inducción y mantenimiento de callos y cultivos 1-50 µm ácido p-clorofenoxiacético sumergidos en estado indiferenciado NAA Inducción de callos 2-20 µm Inducción de raíces 0,2-2 µm CITOQUININAS K Inducción y crecimiento de callos y suspensiones 1 20 µm 6-furfurilaminopurina Inducción de la multiplicación de vástagos, yemas 5 50 µm axilares y meristemas BAP Inducción y crecimiento de callos y suspensiones 0,5 5,0 µm Inducción de morfogénesis (vástagos) 1 10 µm Multiplicación de yemas y meristemas 5 50 µm 2iP Inducción de callos 2 10 µm (Nisopentenilaminopurina) Inducción de morfogénesis µm Multiplicación de yemas, vástagos y meristemas µm Zea Inducción de morfogénesis 0,05 10 µm Termolábil GIBERELINAS Gib A3 Promoción de crecimiento de vástagos 0,3 14 µm Termolábil Incremento del desarrollo de embriones y cultivo de 0,3-48 µm óvulos Acido absisico ABA Prevención de germinación precoz y promoción del desarrollo de embriones somáticos 0,04 10 µm

9 Diferentes factores que influyen en el crecimiento y desarrollo de los cultivos Además de los reguladores de crecimiento, otras características como componentes del medio de cultivo, origen del explanto y factores físicos influyen en el crecimiento y desarrollo de los cultivos. Influencia del componentes del medio de cultivo Agua : En algunas especies un exceso de agua en los medios de cultivo (cultivos líquidos o sólidos con bajas concentraciones de agar) provoca la vitrificación del cultivo. Azúcar : La concentración de sacarosa depende fundamentalmente de la edad del material vegetal a cultivar. Los tejidos jóvenes requieren menores concentraciones de azúcar. En términos generales el crecimiento y desarrollo de un cultivo se incrementa con el aumento de azúcar. ph : Para la mayoría de la especies el ph óptimo de un cultivo está comprendido entre 5.0 y 6.5. Los valores ph bajos traen aparejados la baja estabilidad de algunos reguladores de crecimiento (auxinas y giberelinas) y vitaminas, la precipitación de sales del medio y la disminución de la absorción del amonio. El acondicionamiento del mismo se realiza antes de la esterilización del medio, y el mismo sufrirá una disminución del orden de 0,3-0,5 unidades. Influencia del Material Vegetal La influencia del origen del material vegetal (genotipo, edad, órgano de procedencia y condición fitosanitaria) han sido ampliamente descriptas en el tema anterior. No obstante haremos especial mención al tamaño del explanto, que resulta determinante para la iniciación de un cultivo, ya que resulta dificultoso inducir crecimiento en estructuras pequeñas como son las células, agrupamientos celulares o meristemas. Además debe tenerse en cuenta que las partes aisladas de plantas, poseen reservas de alimentos y hormonas, por lo que un explanto de mayor tamaño será inducido mas fácilmente a crecer y regenerarse. El tamaño óptimo de un explanto es del orden de 0,5 a 1cm 2. Otro aspecto a tener en cuenta es la influencia de los factores climáticos y geográficos (historia del explanto) que ha soportado a campo el material vegetal a ser

10 cultivado. Así condiciones climáticas adversas como grandes fríos provocan la dormancia del material o grandes sequías una menor concentración de reservas. Esto también resulta fundamental cuando los cultivos van ha ser destinados a la producción de metabolitos secundarios. Influencia de los factores físicos La elección del régimen de iluminación, temperatura y oxigenación a aplicar en un cultivo, es dependiente de la especie en cuestión, de la región de la que se extrae el material y del propósito del cultivo. En cuanto a la iluminación debe tenerse en cuenta longitud del día, irradiancia y composición espectral. Respecto de la temperatura, la mayoría de las especies presentan tasas de crecimiento óptimas cuando se las cultiva entre 24 y 26ºC, sin embargo algunas presentan un mejor desarrollo a bajas temperaturas (18ºC, bulbos) y otras a temperaturas mayores, como las plantas tropicales que deben incubarse entre 28 y 30ºC. En general es aplicable que la temperatura más adecuada para el desarrollo de un cultivo es de 3 a 4ºC más elevada que la media que soporta la planta in vivo. La aireación es crucial para el desarrollo de células, tejidos u órganos, en especial cuando se trata de cultivos sumergidos, los que deben ser agitados para asegurar una apropiada transferencia de oxígeno.