CAPITULO VI DISCUSIÓN

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1 CAPITULO VI DISCUSIÓN VI.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS.- 1. La respuesta a las diferentes concentraciones de hormonas fue variable. La mayor producción de callos se obtuvo con los medios K,( 0.5/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN), D ( 1/0 ìm 2,4-D/ìM KIN) y Q (10/10 ìm 2,4-D/ìM KIN) los medios C ( 0.5/0 ìm 2,4-D/ìM KIN), L ( 1/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN) y P ( 1/1 ìm 2,4-D/ìM KIN) tuvieron una respuesta menor a los anteriores pero superior a los demás. Del mismo modo los medios M ( 0/1 ìm 2,4-D/ìM KIN) e I ( 0/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN) no produjeron ninguna respuesta callogénica, mientras que el medio E ( 0/0.1 ìm 2,4-D/ìM KIN) produjo una bajísima respuesta. De todo esto y de la observación del comportamiento de los explantes en los demás medios, podemos inferir que la presencia del 2,4-D es de mayor importancia para la inducción de callos que la KIN, siendo inclusive suficiente para la callogénesis. Esta observación es congruente con el análisis estadístico realizado para esta prueba, el cual nos muestra que el 2,4-D tiene un efecto estadísticamente significativo en la inducción de callos. Siendo su significancia mayor que la de la auxina y la interacción de ambas hormonas. Este dominancia ya fue señala da en otras ocasiones, Dodds ( 1982) hace referencia a su uso junto con el agua de coco para inducir la proliferación celular, al parecer esta alta eficiencia del 2,4-D en la inducción de callos se debe a la alta disponibilidad de auxinas en los tejidos de la mayoría de las dicotiledóneas ( Jacobsen, 1983) 2. En crucíferas, los callos son generalmente iniciados y mantenidos en medios que presentasn una relacion auxina, citoquinina mayor que 1. en nuestro caso en presencia de la KIN, la concentración de 2,4-D que dio mejores resultados fue la de 0.5 ìm, ya que en concentraciones mayores el rendimiento del medio

2 disminuye, aun cuando la relación con la citoquinina es 1/1. Por otro lado, podemos ver que la presencia de la KIN potencia la efectividad del 2,4-D siempre y cuando su concentración no exceda la del 2,4-D, pues en estos casos el rendimiento del medio disminuye. Esta disminución de la actividad podría estar relacionada a la toxicidad del 2,4- D, pues como reportan Carew y Krueger (1977, citados por Yerman ) tiene efectos inhibitorios a concentraciones de 1 mgr. por litro. De la misma la disminución en la producción de callos cuando la relación auxina/citoquinina disminuye pueden explicarse por la actividad inhibitoria que tienen las citoquininas cuando se presentan en altas concentraciones (Yeoman y Forsche, 1980). 3. El medio que produjo mayor número de callos fue el medio D, seguido por los medios O, Q, K y L, el rendimiento de masa en los medios D y Q está relacionado al número de callos generado más que al tamaño de los mismos. La significancia de cada una de las hormonas en el número de callos producidos es mayor para el 2,4-D que para la KIN, sin embargo la combinación de ambas hormonas no tiene un efecto significativo en el número de callos obtenidos. (ver apéndice: análisis estadístico) lo cual nos indicaría que cuando el objetivo es lograr un mayor número de líneas celulares quizá sería conveniente experimentar con una sola hormona, especialmente el 2,4 D. 4. La mayor efectividad del 2,4 D corresponde a la esperada, pues es congruentes con los resultados obtenidos por Carhuaz en Lepidium peruvianum (1997, sin publicar) y por los resultados obtenidos en el cultivo de tejidos de diferentes especies de la familia Cruciferae. (Flick y colb. 1983) 5. La respuesta de los ecotipos a cada uno de los medios de cultivo no fue uniforme, como puede observarse en los gráficos 2C, 2D y 2E, siendo el ecotipo negro el que presento mayor diferencia, sin embargo estas diferencias no son

3 demasiado grandes. 6. La masa de callos obtenidas en cada uno de los ecotipos fue mayor en el medio K en todos los casos, mientras que los medios con los que se obtuvo un mayor número de callos fue diferente para cada ecotipo (K, L y Q para amarillo, morado y negro respectivamente) lo que nos muestra que la respuesta de los explantes respecto al número de callos por explante no es uniforme. Al analizar la respuesta de los explantes por ecotipo, se ha observado que las raíces tienen una respuesta significativamente diferente a los otros explantes. Mientras que para la respuesta de los explantes en relación del área ocupada por los callos se observa una respuesta descendente de raíz a hoja. Es así que en ambos casos las raíces son los tejidos de mayor potencial callogenético. 7. El medio A no contiene hormonas, sin embargo en este medio se produjo una pequeña cantidad de callos, estos podrían deberse a la presencia de hormonas endógenas en este explante que permiten la callogénesis como respuesta al corte, esto sería coherente con la observación de que este es el explante que produce mayor número y masa de callos en todos los ecotipos y medios y al hecho de que en las raíces se producen auxinas endógenas (Hopkins 1999). 8. No se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de explantes de hoja, lo cual es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos, de otro lado el medio Q fue el que produjo el mayor número de callos en estos explantes. 9. Los peciolos e hipocótilos tuvieron una respuesta mucho mayor a los tratamientos siendo el hipocótilo el más susceptible de los dos, esto tendría relación con la presencia de tejido meristemático en este explante.

4 10. El medio que produjo mayor cantidad de explantes friables fue el medio K, aunque la cantidad obtenida de este tipo de callos fue bastante pequeña, lo cual se podría deber a una predisposición de la especie o al tipo de actividad de las hormonas usadas, de todos modos a diferencia del número de callos obtenido y el área ocupada por los callos, en este caso puede observarse que la interacción de las hormonas tiene un efecto más significativo que el de las hormonas solas. 11. Los explantes que produjeron la mayor cantidad de callos friables fueron los provenientes de las raíces, mientras que los provenientes de los hipocótilos produjeron menor cantidad de callos friables que los pecíolos, siendo igual que en los explantes de la región terminal de la hoja. En este caso no se observaron diferencias significativas entre los explantes de hoja terminal y proximal, aunque el menos susceptible fue el explante proximal. Si bien la raíz y el hipocótilo produjeron mayor número de callos friables, la diferencia entre ambos explantes no fue significativa. 12. El efecto del color del ecotipo en la obtención de callos friables fue significativamente diferente para el color amarillo, mientras que entre el el ecotipo morado y negro, las diferencias no fueron significativas. 13. La presencia de callos con pigmentación negra puede explicarse por la presencia de metabolitos secundarios en los callos, el número obtenido en los explantes provenientes del ecotipo amarillo fue similar al obtenido del ecotipo negro, y ambos fueron superiores a la cantidad obtenida en el ecotipo morado, por otro lado la cantidad de callos totalmente negros obtenido en el ecotipo morado fue mucho mayor que en los ecotipos negro y amarillo. Esto nos indicaría que esta pigmentación no está relacionada con el color del ecotipo del que proviene el explante.

5 VI.2.- DETECCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS 13. Los callos de Lepidium peruvianum Ch. sí producen glucosinolatos. Pero la producción de estos metabolitos varía de acuerdo al callo, pudiendo ser mayor o menor. Se encontraron callos en los que se formaron solo una de las fracciones. Esto demuestra que el cultivo de callos de maca, puede ser utilizado para hallar líneas que produzcan un solo tipo de glucosinolato, o los produzcan en cantidades mayores a las obtenidas en campo. 14. Los explantes provenientes de peciolo(e3) y de la parte proximal de la hoja (E2) mostraron una sola fracción de glucosinolatos en casi todos los casos, esto sugeriría que el origen de los explantes estaría involucrado en la cantidad y tipo de glucosinolatos producidos. Para poder comprobar esta posibilidad se tendría que realizar pruebas con un tamaño de muestra estadísticamente significativa. 15. El origen de los explantes no parece ser la causa de la variabilidad de la producción de callos. Pues los callos con diferentes patrones cromatográficos provienen de diferentes tipos de explante y de plántulas de diferentes ecotipos. Sin embargo en este caso también se observa una variabilidad alta en el explante E Los Rf de cada una de las fracciones es muy similar pero no igual para cada extracto, esto puede deberse a que, por el tamaño de la cámara, las muestras no se pudieron desarrollar en una sola cromatografía por lo que no estuvieron sujetas a condiciones idénticas. 17. El mayor tamaño de las manchas de glucosinolatos en los extractos de callo, indican una mayor concentración del metabolito en éstos. Esto nos brinda muy buenas expectativas para su producción in vitro.

6 18. En los cromatogramas de glucosinolatos se observan manchas débiles a lo largo del cromatograma, estas manchas fueron asumidas como porciones de glucosionatos la por la mirosinasa, (Kjaer, 1970). Sin embargo, Genyi y col. reportaron en el año 2001, la presencia de otros glucosinolatos en maca, si bien en pequeñas cantidades. Debido a esto estas no podemos asegurar que manchas correspondan a artefactos o a esos glucosinolatos. 19. Los patrones cromatográficos de alcaloides muestran una gran variabilidad, así como los patrones de los metabolitos con fluorescencia a la luz UV, esto nos indicaría que los callos tienen una gran variabilidad respecto a su producción de metabolitos, lo que sería de gran utilidad en el caso de necesitarse la explotación de alguno de estos. Los extractos que mostraron una presencia notablemente mayor de una de las fracciones de alcaloides fueron los de los callos M3E3 y M3E La fracción N 2 del extracto de alcaloides, no es detectable cuando se cromatografiaron cantidades pequeñas de extracto, por lo que su ausencia en la cromatografía de los extractos de callos y controles no indican ausencia necesaria del metabolito. 21. El hecho de que algunos extractos de callos muestren mayor presencia de algunas fracciones de callos y dada la pequeña cantidad en la que parecen encontrarse en los hipocótilos, el cultivo de callos o suspensiones celulares puede ser utilizada para lograr mayores cantidades que permitan el estudio de las propiedades y actividad biológica de estos compuestos. 22. La poca cantidad de alcaloides que presenta la planta, puede ser aumenta en el cultivo de tejidos utilizando callos con mayor tiempo de incubación, pues, la producción de metabolitos secundarios aumenta al iniciarse la fase estacionaria

7 (Yeoman y colb. 1980), y la de los alcaloides es inversamente proporcional a la tasa de crecimiento (Carew y Krueger, 1977). Esta propiedad debe ser tomada en cuenta tanto en el caso de desear producir alcaloides como otros metabolitos. 23. El hecho de que en algunos callos se observe manchas mas intensas que en el hipocótilo y que en otros casos se observen fracciones que no se presentan en las muestras de hipocótilos, nos indicaría el gran potencial de la planta, pues usualmente los cultivos de tejidos vegetales producen metabolitos en pequeñas cantidades ( Yanadi y Fujita, 1983), por otro lado la alta variabilidad de la producción de metabolitos merece que se realicen investigaciones posteriores para determinar si estas variaciones son fisiológics o genéticas, dado del potencial mitogénico del 2,4-D y el aumento de la variabilidad producido por la tecnica de cultivo de tejidos (Reisch, 1983). VI.3.- DETECCION DE MIROSINASAS 24. La detección de mirosinasas fue cualitativa, con la finalidad de determinar únicamente la presencia de mirosinasas en los callos e hipocótilos, pues para una evaluación cuantitativa, se requeriría de mayores estudios de la presencia de esta enzima en esta especie. 25. El que las bandas de mirosinasas no migraran mucho más allá de la parte superior del gel, a pesar de dejarlas correr por encima del tiempo requerido de acuerdo a la migración del frente de corrida, nos indicaría que estas proteínas tienen un gran peso molecular, esto estaría en concordancia con los resultados obtenidos por MacGibbon y Allison (1970) en otras especies y a la vez nos indicaría que la mirosinasas de maca son mas grandes que las de otras especies estudiadas.