UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Fundada en 1551

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Fundada en 1551 FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS E.A.P. DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidium peruvianum Chacón. MACA TESIS : Para optar el Título Profesional de : BIÓLOGO Con mención en : GENÉTICA AUTOR Ángela Renee Arias Ramírez LIMA PERÚ 2002

2 Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Recursos Genéticos y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y en el Laboratorio del Dr. César Fuertes Ruitón en el Instituto de Química Orgánica Aplicada a la Farmacia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

3 AGRADECIMIENTOS Al profesor Rolando Estrada, por todo el apoyo y cariño que me brindó mientras estuve en el LRGB. Al Dr. César Fuertes, investigador del Instituto de Química Orgánica Aplicada a la Farmacia, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica sin cuya asesoría, apoyo y enseñanzas este trabajo no hubiera podido llevarse a cabo. A mis padres, Juan y Hortensia por su amor, apoyo y paciencia. A mis hermanos Marina, Nina, Juana. Lena, Paul y Eva por su amor y apoyo incondicional. A Juan Diego y Alessia que vinieron a iluminar nuestras vidas y llenarlas de esperanza y alegría. A mi mamá Eloy, a mi mamá Jessi y a mi papá Cesar, y a mis primos aunque sería más adecuado decir hermanos. A Verónica, Delcy y Enrique, por enseñarme a querer y a sentirme querida como nunca antes y a Luchito Alanya con todo mi cariño.

4 A Mary Gálvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que siempre llevo en el corazón y a Miles por su amistad sincera y su entusiasmo contagiante. A mis amigos de la Facultad de Ciencias Biológicas, en especial a Nancy, Maggi, Miriam, María Esther, Ingrid, al profesor Mariano, a la profesora Caleen Távara, y a todos los amigos que conocí en esta casa de estudios y que no puedo enumerar por razones de espacio. A mis amigos del LRGB, los dinosaurios César, Fredy, Rafo, Pepe, Flor, Margarita, y Augusto que me hicieron sentir bienvenida y en mi segundo hogar, a los que siguieron llegando: Héctor, Indira, Mariellix, Alberto, Elisa, Gilmar, Roberto, Gerardo, Nancy, las profesoras Vidalina y Yolanda para compartir preocupaciones y alegrías, los chicos que hoy están empezando su camino en especial a Arturo, Alex, Ivett y Joel.

5 INDICE I.- RESÚMEN I.1.- ABSTRACT II.- INTRODUCCIÓN II.1.- OBJETIVOS II GENERALES II ESPECÍFICOS III.- ANTECEDENTES III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA III CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA III DESCRIPCIÓN BOTÁNICA III NÚMERO DE CROMOSOMAS III DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA III IMPORTANCIA NUTRICIONAL III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS III GLUCOSINOLATOS III EL SISTEMA MIROSINASA GLUCOSINOLATO III ALCALOIDES III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS III CULTIVO DE CALLOS III HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO III AUXINAS III CITOCININAS III EL EXPLANTE III CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS III.4.- CROMATOGRAFÍA III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL IV.- MATERIAL Y MÉTODOS IV.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS IV MATERIAL VEGETAL

6 IV DESINFECCIÓN IV CONDICIONES DE CULTIVO IV EXPLANTES IV MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS IV INDUCCIÓN DE CALLOS IV.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES IV.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS IV ELECTROFORESIS IV EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS IV DETECCIÓN DE ACTIVIDAD V.- RESULTADOS V.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS V.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS V GLUCOSINOLATOS V ALCALOIDES V.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS VI.- DISCUSIÓN VI.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS VI.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS VI.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS VII.- CONCLUSIONES VIII.- RECOMENDACIONES IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS X.- APÉNDICE

7 ABREVIATURAS IAA Ácido indol acético IBA Ácido indolbutírico NAA Ácido Naftalenacético 2,4D Ácido 2,4-diclorofenoacético BAP Bencil amino purina KIN Kinetina ZEA Zeatina 2ip 2-isopentenidenina

8 CAPITULO I RESÚMEN Lepidium peruvianum Chacón (maca), es una crucífera altoandina, que crece a entre los 3,500 y 4500 m.s.n.m. Originaria de la meseta del Bombón, en los departamentos de Junín y Pasco; por sus cualidades medicinales y su alto valor nutritivo, es una planta de alto interés económico, cuyo cultivo se ha extendido a otras regiones de nuestro país. En el presente trabajo se estudió la susceptibilidad de la especie a las técnicas del cultivo de tejidos como herramienta de producción de metabolitos secundarios. Se realizó la inducción de callos en diferentes explantes de L. peruvianum utilizando la auxina 2,4-D y la citoquinina Kinetina, en un factorial de medios con diferentes concentraciones auxina/citoquinina. Se obtuvieron callos en la mayoría de los medios usados, la relación de hormonas más eficiente fue 1 µm auxina/citoquinina. Se evaluó la presencia de glucosinolatos y alcaloides en los callos obtenidos y se compararon con muestras control de hipocótilos de maca. Se observó la presencia variable de dos fracciones de glucosinolatos en los callos, en la mayoría de los casos las manchas tuvieron una coloración más intensa en los callos que en los controles. De otro lado se observó una alta variabilidad en la presencia de alcaloides y otros metabolitos no identificados en los callos obtenidos en este trabajo. También se evaluó cualitativamente la presencia de mirosinasas en los callos obtenidos, observándose bandas positivas en los callos y las muestras de plantas de maca.

9 ABSTRACT Lepidium peruvianum Chacón, is a Cruciferae native from the Andes. It grows between 3,500 and 4500 m. Original from the Bombón plateau, located at the Peruvian localities Junín and Pasco. It became in a crop with a high economical value, due its medicinal and nutritional properties. Actually, it is extended to other regions of the country. The main objective of this research is to study the tissue culture ability of the crop to use in vitro tissues as a tool for secondary metabolite production. Leaves, petioles, roots and hypocotils of L. peruvianum were tested as explants to induce calli. Different concentrations of 2,4-D and Kinetin, in MS basic medium were tested. Calli were induced in most of the media tested, the most efficient hormone ratio auxin/citokinin was 1. It was evaluated the presence of glucosionlatos and alkaloids in the callus induced and compared to maca hypocotils as control sample. Two glucosinolatos fractions were obtained from calli analyzed. It was found one or two fractions according to the callus and in most of the cases the concentration was higher in callus than in control. In the other hand, it was observed a high variability in the alkaloid fractions and other unidentified metabolites extracted from the calli evaluated in this work. It was also evaluated the presence of myrosinases in the calli studied, and it was found positive bands either in callus as in maca hypocotils.

10 CAPITULO II INTRODUCCIÓN Lepidium peruvianum Chacón, "maca", es una crucífera calificada como una de las raíces y tubérculos andinos (RTA) de más alto contenido proteico. Crece entre los 3,500 y 4500 m.s.n.m (King, 1988). Originaria de la meseta del Bombón, entre los departamentos de Junín y Pasco, es la única Brassicacea domesticada de los andes y el único cultivo que reemplaza el cultivo de las papas amargas en esas altitudes (regiones suni y puna de los departamentos de Junín y Pasco), soportando condiciones ambientales extremas, como cambios de temperatura de 18 C a - 10 C en un solo día, fuertes vientos, y poca disponibilidad de agua. La maca es una pequeña planta arrosetada de hojas postradas, cuya raíz tuberosa es rica en azúcares, otros carbohidratos, proteínas y minerales esenciales, lo que la convierte en una excelente fuente alimenticia, siendo utilizada principalmente por las poblaciones rurales de la sierra central, mientras que fuera de su área de cultivo tradicional aún no es conocida completamente (Aliaga 1999, National Research Council. 1989) En la última década del siglo XX, la maca que se consideraba como un cultivo en proceso de extinción (Castro de León 1990) ha empezado a cobrar importancia gracias al redescubrimiento de su alto valor nutritivo, energético y medicinal. Una de las principales propiedades medicinales atribuidas a la maca es la de potenciador de la fertilidad, y su acción sobre la conducta sexual, propiedad por la que ya era usada en el incanato (Johns, 1980). Se han realizado muchos estudios sobre la actividad fertilizante de la maca, hallándosele propiedades como potenciador de la fertilidad en ratas (Chacón, 1961 y Ninanya 1995), propiedades estrogénicas marcadas, (Lamas y Upumayta, 1993),

11 como potenciador de la actividad espermática (Yauri y Valerio, 1991). Estos efectos están relacionados a la presencia de glucosionlatos aromáticos (Johns, 1980), y de alcaloides en la planta (Chacón, 1992). Sin embargo los metabolitos de maca no han sido estudiados a profundidad, desconociéndose las propiedades de muchos de ellos. Los glucosionlatos han sido descritos desde hace mucho tiempo, junto con las mirosinasas (las enzimas que los degradan) como un sistema característico del orden de las Capparales. Este sistema está involucrado en la defensa de la planta contra insectos y patógenos. Además, los productos de la degradación de los glucosionlatos están relacionados con efectos negativos en el ser humano, como la probable inhibición del yodo en la tiroides producida por los tiocianatos, derivados de la hidrólisis de los glucosionlatos por acción de la mirosinasa (Daxenbichler y colb., 1964). Pero otro lado, recientemente estos metabolitos han adquirido interés debido a sus propiedades anticarcinogénicas (Quiros, 1999). Anteriores estudios realizados en los alcaloides de Lepidium peruvianum Ch. muestran que estos compuestos tienen efectos estimulantes sobre la fertilidad femenina (Chacón, 1990). Por lo descrito anteriormente se eligieron pues los alcaloides y glucosionlatos para evaluar la posibilidad de utilizar el cultivo de tejidos vegetales para la producción y estudio de los metabolitos secundarios de maca, debido a que los cultivos de tejidos y suspensiones celulares pueden ser manipulados para obtener una gran variedad de productos naturales usados en las industrias de alimentos y farmacéutica. De hecho esta técnica ya ha sido utilizada a escala industrial en la producción de metabolitos secundarios (Nuñez y Ochoa, 2000).

12 II.1.- OBJETIVOS II GENERALES Evaluar la producción de metabolitos secundarios de Lepidium peruvianum Ch. bajo condiciones de cultivo in vitro. II ESPECÍFICOS Determinar la composición de un medio de cultivo óptimo para la inducción de callos en diferentes explantes de L. peruvianum Ch. Determinar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum Ch. Comparar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum Ch. con la que se presenta in vivo. Determinar la presencia de mirosinasas en callos de L. peruvianum Ch. y compararla con la que se presenta in vivo.

13 CAPITULO III ANTECEDENTES III.1.- DESCRIPCIÓN DE LA PLANTA.- El género Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en prácticamente todos los continentes, excepto la Antártida, siendo uno de los más grandes dentro de las crucíferas. Las especies de América del Norte, Australia y Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las especies endémicas Andinas (Quiros 1999). Gloria Chacón (1990) menciona que en el Perú, de acuerdo a Ferreira (1986), existían 11 especies clasificadas del género Lepidium a la que agrega Lepidium peruvianum Chacón como una nueva especie. De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue domesticada hace cerca de 2000 años en San Blas, Junín. Siendo, según Bonnier (1986, citado por Chacón 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el Perú. La maca parece haber jugado un papel importante en la economía prehispánica, y durante los primeros cien años de la colonia formó parte de los tributos exigidos por el Encomendador (Chacón, 1990). III CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA. DIVISION : ANGIOSPERMAE CLASE : DICOTYLEDONEAE SUBCLASE : ARCHICHLAMYDEAE

14 ORDEN : PAPAVERALES FAMILIA : BRASSICACEAE GENERO : Lepidium ESPECIE : Lepidium peruvianum Chacón. Sp. Nov. Antes L. meyenii Walp. NOMBRE COMUN : MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA, AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO. III DESCRIPCIÓN BOTÁNICA La maca, según Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en menores altitudes) siendo autógama, cleistógama, con una fase reproductiva de 5 meses con una floración que dura dos meses. Las flores se abren en series sucesivas, presentando cuatro etapas: flor cerrada con anteras sin dehiscencia, flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales entrando en senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8 meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el ensanchamiento de los hipocótilos. El cultivo de estas dos fases se da generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos años consecutivos (Aliaga, 1999). La raíz es napiforme (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998), descrita como tubérculo hipocotíleo por Piñas (1994) recibiendo también el nombre de hipocótilo (Aliaga 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), según León (1964), éste es un eje carnoso derivado del hipocótilo cuya parte superior

15 termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la inferior es cónica y se alarga en una raíz ancha y fuerte con dos áreas irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas. Los colores de maca más frecuentes son: amarillo, morado, medio morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (León, 1964) pero se pueden encontrar también maca de color rosado, crema-morado, amarillonegro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por los campesinos y el mercado es el color amarillo (León, 1964 y Aliaga, 1999). El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas, compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimórficas: En la fase vegetativa son grandes (10 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm) en la fase reproductiva (Tello y colb y Aliaga, 1999). La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Piñas 1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeñas y blancas, son perfectas, con cuatro sépalos, cuatro pétalos, 2 estambres fértiles y cuatro estaminodios y un ovario súpero bicarpelar y bilocular, con un óvulo en cada lóculo de placentación axilar. Su fórmula floral es: K 4 C 4 A 2-4 G 2 (León, 1964 y Aliaga, 1995). El fruto es una silícula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides de 2-3 mm de ancho y 4 5 mm de largo (Beltrán y colb. Citado por Obregón, 1998) el color de las semillas varía del amarillo-naranja al marrón oscuro (Aliaga, 1999).

16 III NÚMERO DE CROMOSOMAS Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8 con cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en células madres de plantas en floración, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la maca es un poliploide disómico del número cromosómico básico del género: n = 8, siendo así un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas. III DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes (National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia), estuvo restringido a los departamentos de Junín y Pasco, en las regiones suni y puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junín; a altitudes de m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m. Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la distribución del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el área de cultivo de la planta disminuyó progresivamente hasta que entre 1777 y 1778, Hipólito Ruiz lo circunscribe la región de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta tendencia se mantuvo hasta la década de los ochenta, en la que el área de cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la década de los 90 esta tendencia se revirtió al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se extendió a otros departamentos del Perú, de tal manera que actualmente la maca se está cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Huánuco y Apurímac (Aliaga, 1999).

17 III IMPORTANCIA NUTRICIONAL La maca es la única especie del género Lepidium cuya raíz es utilizada como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras (National Research Council. 1989), además, dentro de los tubérculos y raíces andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto contenido de aminoácidos esenciales, comparables con los recomendados por la FAO OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La fracción grasa es rica en ácido linoleico utilizado por el organismo para la biosíntesis de ácidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver apéndice) III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS. Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no tienen una función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991). Entre las funciones que cumplen estos metabolitos están: proteger la planta de los depredadores, competir ventajosamente con otras plantas, atraer polinizadores y simbiontes y brindarles protección contra diferentes tipos de estrés a los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991). Las evidencias de una estricta regulación metabólica de estos productos nos indicaría que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas

18 III GLUCOSINOLATOS. Los glucosinolatos son una clase tioglucósidos restringidos a las dicotiledóneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos géneros y especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa, conforman un sistema que define fitoquímicamente al orden de las Capparales (Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en muchas brassicaceas económicamente importantes, como la mostaza, calabazas, brócoli, nabo, etc. El daño mecánico, infecciones o ataque de pestes produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular que exponen los glucosinolatos almacenados a la acción de las enzimas que los degradan, las mirosinasas, produciendo isotiocianatos, nitrilos, cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del ph y/u otros factores (Fig 1) (Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las hojas para herbívoros no específicos como aves y babosas, pero aumenta la susceptibilidad del tejido a insectos específicos como los escarabajos alados, (Mithen y col. 1995) La primera revisión de la presencia de glucosinolatos en varias especies fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones periódicas (Xenophon y colb., 1981), en 1973, Kjaer puntualizó: entre el vasto número de productos secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribución discontinua junto con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han adquirido, por razones obvias, una posición prominente en discusiones acerca de los méritos de tales productos para propósitos de clasificación y, más fundamentalmente, consideraciones filogenéticas. Los glucosinolatos...

19 constituyen un grupo con algunas de las características anteriores.... La complejidad sistemática de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la posición biológica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales químicamente bien definido y en constante crecimiento. Hace ya varias décadas, se ha deseado reducir el contenido de tioglucósidos en Brassicáceas mediante métodos de cultivo, pues la presencia de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos tóxicos de los productos de su degradación (Josefsson, 1967), tales como nitrilos, isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y Rossiter, 1996), así como por su sabor; mientras que otros vienen siendo estudiados por sus propiedades terapéuticas. Actualmente, la concentración de glucosinolatos puede ser manipulada genéticamente, disminuyéndola para mejorar la palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o, aumentándola como se trata de hacer en brócoli con el glucosinolato glucorafanina, que al hidrolizarse forma sulfurofano con actividad anticancerígena (Quiros, 1999). Las especies del género Lepidium son usualmente ricas en bencil isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs (1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los productos de los glucosinolatos de maca, los isotiocianatos aromáticos, bencilisotiocianato y el p-metoxibencil isotiocianato, el último de los cuales también se encuentra en mashua. Químicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen el mismo núcleo el cual consiste en un tioglucósido unido al carbón de una oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminoácidos siendo éste

20 el carácter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la actividad biológica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos resultantes del daño de los tejidos de la planta, (Mithen y colb., 1995). La naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos aromáticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los alifáticos (bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades ácidas, por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por un catión, la glucosa y sus formas aniónicas, los hacen compuestos no volátiles e hidrofílicos, se han identificado más de 100 glucosinolatos; todos ellos se diferencian sólo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran número de glucosinolatos, se usan nombres semisistemáticos, en los que el nombre de la cadena R es seguido por el sufijo glucosinolato, Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los α- aminoácidos, Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer, 1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el carbón α se transforma en el carbón central del glucosinolato (Larsen, 1981), aunque solo siete corresponden a aminoácidos proteicos (antes mencionados), los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente a nivel de glucosinolato o derivan de aminoácidos no proteicos (Chapple, y colb., 1994 y Larsen, 1981). Para el aislamiento y análisis de los glucosinolatos se han desarrollado muchas técnicas, como la cromatografía en papel Kjaer 1970, cromatografía de capa fina, cromatografía de gases, además de procesos que involucra el estudio de los productos de la degradación enzimática, aunque la gran variabilidad de los productos de la degradación enzimática pueden causar resultados erróneos, (Larsen, 1981).

21 El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la producción de α-d-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981) Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas aún no se ha definido su localización celular (Rodman, 1981). Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificación de crucíferas de Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el género Isatis y reubicando el género Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el valor taxonómico de estos compuestos. III EL SISTEMA MIROSINASA GLUCOSINOLATO Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas están invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer, 1973), así, sin excepción conocida, los glucosinolatos están acompañados en la planta por esta enzima. Las mirosinasas se encuentran en idioblastos especializados ricos en proteínas llamados células de mirosina (Rodman, 1981) que se encuentran en el tejido parenquimático (Bonnes y Rossiter, 1996), éstos se tiñen de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran separados hasta que se produce daño tisular o autolisis, generando durante la masticación los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000). Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza, (Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicáceas, y en la

22 familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger, en la bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de mamíferos y en los áfidos que atacan crucíferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter, 1996). R C S Glu NOSO 3 H 2 O mirosinasa S R C + D - Glu NOSO 3 Isotiocianatos nitrilos cianoepitioalcanos tiocianato FIG. 1.- Hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y Rossiter The Myrosinase Glucosinolate System, its Organization and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97: ) La degradación de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede producir: a) isocianatos, cuando la hidrólisis se produce en un ph normal; b) nitrilos, cuando la hidrólisis ocurre a ph ácido; c) cianoepitioalcanos, cuando la mirosinasa se presenta con una pequeña proteína conocida como proteína epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl, bencil, y 4- (metiltio)butilglucosinolatos.

23 MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de Rhoeadales, cada especie tenia un patrón diferente con 1 a 4 bandas. También encontraron que este patrón variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual se hicieran los extractos. Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrón de estas enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino también de acuerdo al órgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razón fisiológica de esta diferencia.(bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas particulares corresponden a condiciones endógenas encontradas en las plantas, o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el tejido.(bonnes y Rossiter, 1996). III ALCALOIDES Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos secundarios de moléculas no relacionadas entre sí, siendo de gran importancia económica debido a sus propiedades farmacológicas, las mismas que han sido usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas frecuentes en el reino vegetal, habiéndose encontrado cerca de 10,000 alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con flores, principalmente dicotiledóneas herbáceas (Hopkins, 1999). Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias básicas con uno o más átomos de nitrógeno en su sistema cíclico, que manifiestan actividad farmacológica (Lock, 1994) La mayoría de los alcaloides provienen del metabolismo de los aminoácidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque

24 algunos alcaloides se encuentran en varios géneros o aún en una familia, la mayoría de las especies presentan un patrón único, genéticamente determinado. Por otro lado su distribución está restringida a determinados órganos de la planta, como raíces, hojas o frutos jóvenes (Hopkins, 1999). No se ha determinado aún cual es la función de los alcaloides en la planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayoría son amargos, lo cual es considerado universalmente como un carácter repelente. Todos son biológicamente activos, muchos significativamente tóxicos y otros con propiedades antibióticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides son los más vulnerables, o son tejidos periféricos que pueden ser atacados por herbívoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los organismos vivientes (Lock, 1994). Para la extracción de alcaloides se aprovecha su carácter básico, utilizando soluciones acuosas o alcohólicas ligeramente ácidas, para obtener el extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes orgánicos.(lock, 1994) Las técnicas de separación de alcaloides más comunes son la cromatografía de capa fina o delgada aunque en los noventa se generalizó el uso de Sephadex LH-20 por elución y la cromatografía líquida de alta perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variados y el agente revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicación produce manchas generalmente de color naranja (Lock 1994). La Dra. Gloria Chacón, (1961, 1990) demostró la presencia de alcaloides

25 en Lepidium peruvianum, para demostrar la acción fecundadora del extracto alcaloideo de maca, lo inoculó en ratas obteniendo una marcada estimulación de la maduración los folículos de Graaf y engrosamiento del endometrio. Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoquímico de la planta encontró 3 alcaloides en los extractos metanólico y butanólico de maca de los ecotipos amarillo, rojo y negro. En 1993, Garró y col. obtuvieron cuatro fracciones de alcaloides por cromatografía de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994), detectaron por cromatografía de capa fina de un extracto alcalino de polvo de maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff. Sin embargo la presencia de alcaloides en maca aún es discutida y no se ha determinado su estructura. III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS El cultivo de tejidos como técnica consiste en aislar una porción de planta y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas técnicas mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se cultiva asépticamente en un medio de composición definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991). Los principios de esta técnica están contenidos en la teoría celular de Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la célula es capaz de tener autonomía y totipotencia, lo que fue demostrado en células somáticas con la observación de la formación y cicatrización de callos en áreas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982). Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados por el botánico alemán G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret

26 1982), quien trabajó con células de palizada, pelos glandulares y pelos de estambres de Tradescantia; pero aunque logró que las células sobrevivieran entre 20 a 27 días, no tuvo crecimiento celular, probablemente debido a que eligió nutrientes relativamente simples y a que eligió células altamente diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recién en 1934, mucho después que en 1912 Carrel diseñara el método para cultivar células animales; que Gautheret logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de raíces de tomate (Dodds y Roberts 1982). Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formación de callos indiferenciados, que podían crecer ilimitadamente a través de subcultivos, por lo que se puso mucho énfasis en la determinación de los requerimientos nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para entonces ya se había descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por Gautheret, 1982) y en las décadas siguientes se estudiaron diversas sustancias que favorecían el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret 1982) se descubrió la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de citoquininas (Dodds y Roberts 1982), hasta que en 1962, Murashigue y Skoog propusieron una solución de minerales asociada a auxinas y citoquininas que permite el crecimiento de la mayoría de tejidos (Gautheret 1982). También se inició una serie de estudios en organogénesis e histogénesis, que sentaron las bases de la micropropagación cuando Ball en 1946 descubrió el principio de la propagación vegetativa determinando cuales eran los tipos de meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel aplicó estos principios en la propagación clonal de orquídeas. (Gautheret 1982).

27 Muir ( , citado por Dodds y Roberts 1982) encontró que los callos que eran trasladados a un medio líquido se convertían en suspensiones celulares, desarrollándose luego muchas técnicas de cultivo de células aisladas y de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982). Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros: a) Estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines. b) Bioconversión y producción de compuestos útiles. c) Incremento de la variabilidad genética. d) Obtención de plantas libres de patógenos. e) Propagación de plantas. f) Conservación e intercambio de germoplasma. III CULTIVO DE CALLOS El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante usado, y la elección de éste dependerá del objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Para la obtención de callos se puede utilizar cualquier tipo de explante que contenga células nucleadas, y éste se seleccionará en función a razones prácticas como disponibilidad, facilidad de manipulación, homogeneidad, baja contaminación, respuesta in vitro; esta respuesta puede variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontogénica y tamaño del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de incubación empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa amorfa desdiferenciada de células parenquimáticas de pared delgada (Dodds y Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en otros desintegrándose a medida que el callo crece (Nuñez y Ochoa, 2000). Este crecimiento depende de la relación entre la planta de origen, el medio de cultivo,

28 las condiciones ambientales y el tiempo de incubación; algunos callos crecen fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fácilmente en pequeños fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts, 1995), estos callos son los mejores para la iniciación de cultivos celulares. El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en tres fases de desarrollo: Inducción, en la que el metabolismo es estimulado antes de la mitosis; división celular en el que las células del explante revierten a un estado meristemático; y por ultimo diferenciación celular y expresión de algunas vías metabólicas que llevan a la formación de metabolitos secundarios (Dodds y Roberts, 1995). La formación de callos en plantas intactas, normalmente está controlada por hormonas endógenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su inducción in vitro en explantes vegetales sin causar estrés, depende de la introducción de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuñez y Ochoa, 2000). Los otros factores más importantes para el éxito de esta tecnología son: el explante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales inorgánicas, fuentes de carbono y energía, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, ácidos orgánicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales. Después de que el callo ha crecido por un tiempo en asociación con el tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los

29 nutrientes, la gradual desecación del agente gelificante y a la acumulación de metabolito que pueden resultar tóxicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995). Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25 C o más, pero en realidad este tiempo varía con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts, 1995). Carhuaz en 1997 (comunicación personal), indujo callos en maca, utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 ìm, concluyendo que el 2,4-D en el rango de ìm el regulador más efectivo para promover la formación de callos, coincidiendo con Gamborg y colb. (1981), quienes indican un rango óptimo de 1-5 ìm para la acción del 2,4-D y con Flick y colb. (1983), que también señalan al 2,4-D y a la kinetina como los reguladores más efectivos para la inducción de callos en Brassicáceas. III HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO Se llama hormona o fitohormona a aquellas sustancias orgánicas naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los procesos fisiológicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias sintéticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento, y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995). Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas, ácido absícico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual

30 modo el ácido absícico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y Roberts, 1995). En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies económicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos, incluyendo a Brassica oleracea, B. napus y Arabidopsis thaliana, los requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones, estas concentraciones y la hormona a ser elegida, así como la respuesta de crecimiento varía con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las citoquininas la más usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con más frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relación auxina:citoquinina más eficiente para la inducción de callos es de 1 (Flick y colb. (1983). III AUXINAS Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por primera vez por Went en 1926, quien describió la acción elongadora del IAA en coleóptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las cuales la más usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintéticas o reguladores de crecimiento de las cuales las más usadas son el 2,4-D, el NAA y el IBA (Krikorian, 1991). Los efectos de las auxinas más importantes para el cultivo de tejidos son el crecimiento celular y la elongación celular. Algunos tejidos sólo forman callos en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas concentraciones de auxina para la iniciación del callo, aunque en el caso del 2,4- D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.

31 Este regulador es la auxina más efectiva para la proliferación de callos usándose a concentraciones de M y aún en ausencia de una citoquinina exógena (Yeoman y Forche, 1980). Además de inducir la proliferación celular, el 2,4-D tiende a suprimir la morfogénesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de diferenciación (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea mas estudiada, la auxina mas usada en la obtención de callos en diferentes explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y Altmann, 1994). III CITOCININAS En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la promoción de la citocinesis, el que se formaba por la descomposición parcial de ADN, llamándolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el término cinina para denominar las sustancias naturales y sintéticas que presentaban el mismo tipo de actividad biológica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia usada en cultivo de tejidos animales, se optó por el nombre citocinina para estas sustancias (Krikorian, 1991). Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la división celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la división celular sincrónica a las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la formación de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995). Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo compuestos sintéticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y Roberts, 1995).

32 Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, así algunos cultivos no requieren de una auxina exógena y otros requieren de una auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado además que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 25 mg/l) inhiben la formación de callos (Yeoman y Forche, 1980). En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicación personal) utilizó un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100 µm, utilizando como explantes, la raíz, hoja, peciolo e hipocótilo. III EL EXPLANTE Los requerimientos hormonales para la iniciación del callo dependen del origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen células del cambium pueden formar callos sin adición de reguladores de crecimiento; pero la mayoría de los explantes requiere de uno o más reguladores de crecimiento para iniciar la formación de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta también depende del estado fisiológico del tejido y del tiempo de escisión, (Yeoman y Forche, 1980). Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos exógenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995). III CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a

33 programas intensivos de mejoramiento genético y se presentan además problemas técnicos y económicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995). El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos secundarios cuya extracción a partir de las plantas que los producen puede resultar difícil o económicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera necesario, por el riesgo de sobreexplotación al que se expone el cultivo; por las pequeñas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas plantas (Dodds y Roberts, 1995). La noción de que una línea celular altamente productiva podía ser seleccionada para generar compuestos útiles fue introducida en la década de 1970, en la década de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en cooperación con la industria privada, produjeron shikonina de Lithospermum erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996). La producción de shikonina, un pigmento que se extrae de las raíces de la planta asiática Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del uso del cultivo de tejidos vegetales en la producción de metabolitos secundarios. En la planta el rendimiento de shikonina, además de ser muy bajo, depende de la distribución geográfica y el clima, habiendo sufrido una rápida disminución en su población. Luego de establecer una estrategia de producción in vitro, la empresa petroquímica Mitsui del Japón logró la primera producción industrial del compuesto, vendiendo a 4000 dólares el kilo de shikonina producida in vitro (Robert y colb., 1991).

34 En la década de los noventa el número de compuestos producidos por cultivo de tejidos aumentó y la mejora de la tecnología Hara permitió obtener compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta tecnología es la producción comercial, por Kao, de un polisacárido tuberoso usado en cosméticos (Hara, 1996). Actualmente existen al menos tres programas de búsqueda de compuestos con actividad biológica, llevados a cabo por las industrias farmacéuticas, cada año varios cientos de plantas son colectados y se intenta en ellas la inducción de callos, con un éxito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996). Todo el proceso desde la colección hasta la obtención de un compuesto puro es estimado entre los 2 y 4 años. Algunos resultados de estas búsquedas han sido publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los dehidrodiconiferil alcohol glucósidos aislados de cultivos celulares de Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996). La búsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de reducir el número de cultivos de interés, muchas veces el paso de callos a suspensiones celulares representa una reducción considerable de los niveles de ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la pérdida completa de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos celulares no sean capaces de producir compuestos de interés, por el contrario, Ruyter y Stöckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos. Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la producción de metabolitos secundarios son las siguientes:

35 Producción a escala industrial Producción de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis química Reducción de los costos de producción a largo plazo Eliminación de la dependencia en materia de importación Producción continua y controlada de sustancias independiente- mente de los factores del medio ambiente. Precios estables Posibilidad de realizar la producción cerca de las fábricas de procesamiento final y de los mercados. Se ha estudiado también la posibilidad de aumentar significativamente la productividad del cultivo usando un medio de inducción (para la producción de los metabolitos secundarios) (Becker, 1987). III.4.- CROMATOGRAFÍA La cromatografía es la técnica analítica usada para la separación de mezclas y sustancias, por adsorción selectiva (Microsoft Encarta Online Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botánico ruso Michael Tswett en 1903, quien descubrió que los pigmentos de las plantas podían separarse al filtrarlos con éter de petróleo a través de una columna de carbonato de calcio. Pero el desarrollo de esta técnica empieza realmente en 1931, cuando, posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968). Actualmente se usa un amplio rango de técnicas cromatográficas de acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografía de columna utiliza sílica, alúmina y sílica gel; en la cromatografía de capa fina el adsorbente se encuentra

36 sobre un vidrio o una película plástica, mientras que en la cromatografía de papel, una muestra líquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras técnicas cromatográficas son: la cromatografía gas-líquida, que permite la separación de sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografía iónica donde un gas puede ser descompuesto en iones que interactúan con el adsorbente; la cromatografía de permeación de gel usa un adsorbente con poros de tamaño uniforme, y finalmente, la cromatografía líquida de alto perfomance (HPLC) donde el adsorbente es líquido, esta técnica es ampliamente usada actualmente (Microsoft Encarta Online Encyclopedia 2001). III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL La electroforesis en gel es un método de separación, en el que las partículas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en interacción con la matriz circundante, la cual actúa como un filtro molecular, generándose como consecuencia, tasas diferenciales de migración para las proteínas contenidas en una muestra (Garfin, 1990). Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de papel y acetato de celulosa, y se utilizaron principalmente para separar aminoácidos, péptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografía (Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel, acetato de celulosa, silicagel, alúmina y celulosa y actuar como tamices moleculares como son los geles de almidón, agarosa y poliacrilamida (Hames, 1981, citado por Gálvez, 1990). El método más utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), por proporcionar un tamaño de poro controlable, ser repetible y de alta resolución (Garfin, 1990).

37 Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero de acrilamida y un co-monómero de ligamiento cruzado, la N,N -metilenbisacrilamida. Esta polimerización es catalizada por un sistema generador de radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que actúa como iniciador, y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formación de radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la polimerización del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y oxígeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la polimerización (Gálvez, 1990). Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la acrilamida y la bisacrilamida, y su tamaño disminuye a medida que la concentración de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como tamiz. La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante (SDS PAGE)(Garfin, 1990). La separación por electroforesis en gel esta basada en los tamaños, formas y cargas netas de las macromoléculas, los sistemas diseñados para proteínas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas

38 de proteínas; pero no para medir la pureza de una preparación o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamaño, forma y carga en la movilidad electroforética, debido a que proteínas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante (Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes iónicos como el SDS (sodium dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la proteína de tal forma que las proteínas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Gálvez, 1990). El método más popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en 1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un método discontinuo con dos tipos de geles: un gel de separación y uno de concentración, ambos geles tienen diferentes porosidades y ph, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo, donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separación que se halla inmediatamente debajo y que posee un tamaño de poro más pequeño. Además, se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad permite concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel de concentración, resultando en una mejor resolución (Laemmli, 1970).

39 CAPITULO IV MATERIAL Y MÉTODOS IV.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS Para la inducción de callos se siguió un protocolo en base al trabajo realizado por Carhuaz en 1997 (comunicación personal) según se describe a continuación. IV MATERIAL VEGETAL Se utilizaron plántulas de maca amarilla, morada y negra, germinadas in vitro en medio Murashigue y Skoog (1962), sin hormonas, suplementado con vitaminas, mioinositol, pantetonato de calcio, 20% de sucrosa, y 2% de gelrite. Las semillas fueron gentilmente proporcionadas por el Ing. Rolando Aliaga (CIMA UNA) y provinieron de la comunidad de Huayre Junín. IV DESINFECCIÓN La desinfección de las semillas se realizó adecuando el protocolo de desinfección de rutina usado en el LRGB, de la manera siguiente: Inmersión en alcohol al 70% : 1 minuto Inmersión en hipoclorito de Na al 2% : 10 minutos Enjuague con agua destilada estéril : 1 minuto, cuatro veces IV CONDICIONES DE CULTIVO Las condiciones del cuarto de cultivo fueron: 18 C, 1,500 Lux, fotoperíodo de 16 h de luz. A los 40 días, las plántulas tuvieron el tamaño de hoja necesario para obtener dos explantes: apical y proximal.

40 Los colores del ecotipo de maca correspondiente a cada plántula de origen fueron denominados utilizando la siguiente nomenclatura: M1 = Ecotipo amarillo, M2 = Ecotipo morado, M3 = Ecotipo negro. IV EXPLANTES Los explantes obtenidos fueron los siguientes: E1: Región apical de la hoja (Aprox. 0.5 cm de longitud x 0.5 en la base.) E2: Región proximal de la hoja del mismo tamaño que el explante anterior. Los bordes de las hojas fueron cortados para obtener una mayor área de inducción de callos. E3: Porción de peciolo aprox. 1 cm de longitud. E4: Hipocótilo completo, incluyendo la roseta meristemática, la mayoría de ellos medía tuvieron aproximadamente 0.4 cm. E5: raíces segmentos sin puntas de aprox.1 cm se escindieron de la región proximal. IV MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS: Se utilizaron dos hormonas vegetales para la inducción de callos, una auxina (2,4-D) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µm y una citoquinina (kinetina) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µm; como medio básico se utilizó el medio descrito por Murashige y Skoog (1962) al que se le agregaron mioinositol 100 ppm, pantotenato de calcio 2 ppm, vitaminas: tiamina 2 ppm, piridoxina 0.5 ppm, ácido nicotínico 0.1 ppm y glicina 0.5 ppm; 2% de sucrosa y 0.2% de gelrite, tal como se utiliza en rutina en el LRGB, obteniéndose un factorial de 17 medios de inducción semisólidos con diferentes concentraciones de hormona incluyendo el control negativo.

41 V INDUCCIÓN DE CALLOS: Se sembraron los explantes en placas petri descartables con 25 ml de medio de inducción, haciendo cinco repeticiones por cada medio de inducción. Las placas se mantuvieron en oscuridad a 25 C. realizándose evaluaciones a partir de los 25 días de siembra con un intervalo de 10 días por evaluación durante dos meses, estas evaluaciones fueron cualitativas para confirmar el crecimiento de los callos. A los dos meses de crecimiento se hizo el primer subcultivo en placas petri descartables con medios de inducción frescos, a los cuatro meses se evaluó el material midiendo el área ocupada por cada callo sobre una cuadrícula milimetrada, para determinar así la masa relativa de los mismos y por consiguiente el medio con mayor rendimiento en masa. Seguidamente, se realizó el subcultivo de todos los callos en el medio K (ver apéndice), a partir de entonces se realizaron subcultivos cada dos meses hasta los ocho meses cuando se cosecharon los callos para la extracción de metabolitos secundarios. IV.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Se realizaron cromatografías de papel para la detección de glucosinolatos y cromatografías de capa fina ascendente para la detección de alcaloides tanto en los callos obtenidos como en los controles, no se utilizó una sola línea celular debido a la pequeña cantidad de materia seca obtenida de los callos como consecuencia de su alto porcentaje de humedad. Para la extracción de los metabolitos se utilizaron 30 mg muestra estabilizada. La estabilización se realizó secando los callos en una estufa a 37 C por 36 horas para luego molerlos y guardar los frascos en un lugar seco y sin luz. Como control, se usaron muestras de hipocótilos amarillos morados y negros

42 provenientes de la localidad de Huayre y estabilizadas en las mismas condiciones que los callos. Los callos se clasificaron de acuerdo al color y naturaleza del explante del que provenían, así un callo proveniente de la zona apical de la hoja de ecotipo amarillo se denominó M1E1 y así sucesivamente (ver apéndice). Esta clasificación nos facilitó el manejo de las muestra en las cromatografías. Antes de la pulverización de las muestras se determinó el % de humedad. IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS Para la extracción y cromatografía de glucosinolatos se adecuó el protocolo de rutina utilizado por el Dr. César Fuertes en el Instituto de Química Orgánica Aplicada a la Farmacia, en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (ver apéndice), como se describe a continuación: Para la extracción etanólica se tomaron 30 mg de cada tipo de callo y se pusieron a macerar en 2 ml de etanol al 96% durante dos semanas. Se sembraron, 100 alicuotas de cada uno de estos extractos en hojas de papel Wathman N 1 de 11 x 29 cm y se colocaron en un tanque de cromatografía de papel descendente, dejándose desarrollar por 22 horas. Como sistema solvente se usó una solución de n-butanol:etanol:agua (4:1:4) descrito por Kjaer en Después de retirar los papeles del tanque de cromatografía se secaron a temperatura ambiente e inmediatamente se revelaron para lo cual se pulverizaron primero con una solución de nitrato de plata:acetona 15 mg/ml, y luego de dejar secar por unos minutos, con una solución de KOH:Etanol 20 mg/ml. Se dejaron secar las hojas de papel unos minutos y se colocaron en una estufa caliente. Una

43 vez obtenidas las manchas indicadoras, se colocaron los cromatogramas en una solución decolorante de hiposulfito de potasio al 5%, durante 20 hrs. IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES Se utilizaron 30 mg de cada muestra, las que se pusieron a macerar en éter etílico, realizándose tres extracciones sucesivas. La cromatografía de capa fina se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Stahl (1958 y 1965), en cromatofolios de silicagel GF254 ( para las cromatografías preliminares se usaron cromatofolios de 2 x 10 cm) y cromatoplacas Kieselgel 60 G F254 (Merck) de 20 x 20 cm. En las cromatografías preliminares se realizaron con las muestras de hipocótilos de maca (controles) y se probaron las siguientes soluciones para el sistema solvente: Benzol : éter dietílico : metanol : amoniaco (75 : 75 : 6 : 0.7); Cloroformo : metanol : amoniaco (2 : 0.12 : 0.02); Cloroformo : metanol (2 : 1), (2 : 0.25), (2 : 0.15) y (2 : 0.12), siendo esta última la que se utilizó en la estandarización de la cromatografía. Se desarrollaron cromatografías de muestras acidificadas y sin acidificar. Para el revelado de las placas se utilizó el reactivo de Dragendorff y posteriormente el reactivo yodoplatinato de potasio. Antes de revelar las placas se observaron en el espectro de luz UV. En vista de la ausencia de resultados congruentes en la primera cromatografía, se procedió a estandarizar la extracción en una muestra de

44 hipocótilos de varios colores, la cantidad de metabolitos no deseables para la cromatografía fue bastante alta por lo que se procedió a lavar el extracto acidificando el extracto etéreo con HCl acuoso, recuperándose la fase acuosa a la cual, luego de ser alcalinizada con NaOH concentrado, se le agregó dos volúmenes de éter etílico para recuperar la fase orgánica. Se cromatografió este extracto en una cromatoplaca Kieselgel 60 F F254 (Merck) de 20 x 20 cm. Se revelaron los bordes de la placa con el reactivo de Dragendorff modificado por Munnier (1955) y el reactivo yodoplatinato de potasio, aislando luego las regiones correspondientes a las manchas positivas. Una vez obtenidas las fracciones positivas para alcaloides, se cromatografiaron los extractos de callos y los controles, junto con el extracto etéreo y sus cuatro fracciones, las que se usaron como un control extra. IV.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS IV ELECTROFORESIS.- Se utilizó la electroforesis en geles de policrilamida (PAGE) para separar las mirosinasas, los geles y buffers fueron preparados de acuerdo al sistema de Laemmli (1970), pero eliminando el uso de SDS y mercaptoetanol tanto de las soluciones de los geles como de las de los buffers para obtener una PAGE en condiciones no denaturantes. La concentración de los geles fue de 8.6 y 7.5%. Las corridas en los geles se llevaron a cabo con una corriente constante de 30 ma, el voltaje inicial fue de 80 V y el final de 250V. La duración de las corridas fue de 5 horas. IV EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS. Se llevó a cabo adaptando el protocolo de MacGibbon y Allison (1964): 0.5g de muestra fueron molidos en un mortero frío con 2 ml de buffer Tris-Cl ph 6.8,

45 se centrifugó a 10,000 rpm por 4 min, se tomaron 80 µl del sobrenadante a los que se añadieron mercaptoetanol 5 µl, glicerol 10 µl y 5µl de un stock de azul de bromofenol preparado para los procedimientos de rutina del LRGB. Se colocaron 50 µl de muestra en cada pocillo del gel. Se utilizaron hipocótilos y hojas de campo. IV DETECCIÓN DE ACTIVIDAD.- Se adaptó la modificación del método de detección de actividad basado en la formación de bandas de BaSO 4, descrito por MacGibbon y Allison (1970), esta modificación fue gentilmente proporcionada por el Dr. Atle Bones en una comunicación personal (1999). Para adaptar este protocolo se utilizó un extracto etanólico de semillas de mostaza, preparado moliendo 100 g de semillas y macerándolas en 250 ml de alcohol etílico al 96%. Cuando los geles fueron removidos, fueron colocados entre dos placas de vidrio e incubados a 50 C en una solución acuosa de ácido ascórbico 1mM; Acetato de Bario 10mM; Buffer Tris-Cl 0.5 M; ph ml/l; extracto etanólico de semillas de mostaza 300 ml/l. Cuando se hicieron evidentes las bandas, los geles fueron fotografiados con una cámara digital DAGEMIT CCD100 en blanco y negro.

46 CAPITULO V RESULTADOS V.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS: En la primera evaluación, realizada a los 25 días de la incubación (Foto nro. 1), se observó la turgencia de las zonas del explante en donde se formarán los callos y la formación de pequeños callos en varias zonas de los cortes. La tabla Nro. 1 muestra la presencia de callos en los explantes (+). TABLA Nro.1.- PRESENCIA DE CALLOS EN LOS EXPLANTES A LOS 25 DÍAS DE INCUBACIÓN COLOR MEDIO DE CULTIVO AMARILLO MORADO NEGRO EXPLANTE E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 A B C D E F G H I J K L M N O P Q

47 La Tabla Nro. 2 muestra los resultados obtenidos en cada medio en los tres colores de maca. Como muestra el gráfico Nro. 1 (apéndice) el medio K es el que produjo una mayor área de callos callos y los medios I y M los que no produjeron callos. Las variaciones de respuesta de cada ecotipo, pueden verse en el gráfico Nro. 2 (apéndice) TABLA Nro. 2.- ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS (mm 2 ) EN UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA MEDIO DE COLOR TOTAL CULTIVO AMARILL MORAD NEGR (mm) O O O A B C D E F G H I J K L M N O P Q

48 El mayor número de callos en total, se obtuvo con el medio D, como se puede ver en la Tabla Nro 3. El ecotipo negro como se puede ver en esta tabla rindió el mayor número de callos. El gráfico Nro. 3 (apéndice) muestra las variaciones de respuesta de cada ecotipo. TABLA Nro. 3.- NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL PRIMER SUBCULTIVO MEDIO DE CULT. AMARILL O COLOR MORAD O NEGR O TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q TOTAL

49 La Tabla Nro. 4 muestra el número de callos por explante en el ecotipo amarillo. El mayor número de callos se logró en el medio K, mientras que en los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 4, apéndice). TABLA Nro. 4.- NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL PRIMER SUBCULTIVO ECOTIPO AMARILLO MEDIO DE EXPLANTE CULTIVO E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

50 La Tabla Nro. 5 muestra el área total obtenida en cada medio por cada explante en el ecotipo amarillo. Siendo el medio K el que produjo una mayor área (gráfico Nro. 5). TABLA Nro. 5.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm 2 ) SOBRE UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DEL SUBCULTIVO ECOTIPO AMARILLO MEDIO DE EXPLANTE CULT. E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

51 La Tabla Nro. 6 muestra el número de callos por explante en el ecotipo morado. El mayor número de callos se logró en el medio L, mientras que en los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 6). TABLA Nro. 6.- NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS 2 MESES DESPUÉS DEL PRIMER SUBCULTIVO ECOTIPO MORADO MEDIO DE CULTIVO EXPLANTE E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

52 La Tabla Nro. 7 muestra el área total obtenida en cada medio en cada explante en el ecotipo morado. Siendo el medio K el que produjo una mayor área (gráfico Nro. 7). TABLA Nro. 7.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm 2) SOBRE UNA CUADRÍCULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DELPRIMER SUBCULTIVO ECOTIPO MORADO MEDIO DE EXPLANTE CULT. E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

53 La Tabla Nro. 8 muestra el número de callos por explante en el ecotipo negro. El mayor número de callos se logró en el medio Q, mientras que en los medios I y M no se obtuvieron callos (gráfico Nro. 8). TABLA Nro. 8.- NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS. 2 MESES DESPUÉS DEL PRIMER SUBCULTIVO ECOTIPO NEGRO MEDIO DE EXPLANTE CULTIVO E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

54 La Tabla Nro. 9 muestra el área total obtenida en cada medio en cada explante en el ecotipo negro. Siendo los medio D y K los que produjeron una mayor área (gráfico Nro. 9). TABLA Nro. 9.- ÁREA TOTAL OCUPADA POR LOS CALLOS (mm 2) SOBRE UNA CUADRICULA MILIMETRADA 2 MESES DESPUÉS DEL SUBCULTIVO ECOTIPO NEGRO MEDIO DE EXPLANTE CULTIVO E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL A B C D E F G H I J K L M N O P Q

55 En 10 de los medios se obtuvieron callos friables, como puede verse en la Tabla Nro. 10, el medio en el que se logró mayor cantidad de callos friables fue el medio K y el explante en el que se obtuvo mayor cantidad de callos friables fue la raíz (E5), tanto en el ecotipo amarillo y morado como en el negro. (Gráfico Nro. 10) TABLA N 10.- NÚMERO DE CALLOS FRIABLES OBTENIDOS POR MEDIO DE CULTIVO Y EXPLANTE COLOR MEDIO DE AMARILLO MORADO NEGRO TOTAL CULTIVO EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 A 0 B 4 4 C D G 0 F 0 G H I 0 J 0 K L M 0 N O P Q 0 TOTAL

56 Se observó que algunos callos presentaban zonas pigmentadas de negro. El mayor número se presentó en los explantes E5 (raíces) tanto en el ecotipo amarillo y morado como en el negro; y en el medio L, como se puede apreciar en la Tabla Nro. 11. ME- DIO TABLA Nro NÚMERO DE CALLOS CON ZONAS PIGMENTADAS OBTENIDOS EN LOS TRES ECOTIPOS COLOR AMARILLO MORADO NEGRO EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE E1 E2 E3 E4 E5 TOT E1 E2 E3 E4 E5 TOT E1 E2 E3 E4 E5 TOT TOTAL EN LOS TRES ECOTIP. A B C D E F G H I J K L M N O P Q TOTAL

57 En los medios C, D, K, L y O se observaron algunos callos completamente negros tabla Nro. 12 y 12A, gráfico Nro. 11 (apéndice) TABLA NRO NÚMERO DE CALLOS TOTALMENTE NEGROS OBTENIDOS EN LOS TRES ECOTIPOS DE ACUERDO AL MEDIO DE CULTIVO MEDIO COLOR AMARILLO MORADO NEGRO EXPLANTE EXPLANTE EXPLANTE E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL C 1 O O O O O O O O 2 O O 1 O O 4 D O O 1 O O O O O O O O O O O O 1 K O O O O O O O O O 2 2 O O O O 4 L O O O O O 1 O O 1 O O O O O O 2 O O O 2 O O O 2 O O 1 O O O O O 5 TOTAL

58 CUADRO NRO. 12A.- NÚMERO DE CALLOS NEGROS OBTENIDOS POR ECOTIPO Y EXPLANTE ECOTIP EXPLANTE O E1 E2 E3 E4 E5 TOTAL AMARILL O MORAD O NEGRO TOTAL V.2.- DETECCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Los callos mostraron un porcentaje de humedad de 94%. V GLUCOSINOLATOS. La presencia de las fracciones se observó como una mancha negra como puede apreciarse en las fotografías. Se observaron dos fracciones que se nominaron como fracción 1 y fracción 2 (Fotografías 2 6). En 13 de las muestras se observaron dos fracciones de glucosinolatos. En las siete muestras restantes (M1E2, M1E3, M2E2, M2E3, M2E5, M3E3, y callo negro), se observó la presencia de la fracción 1, como puede apreciarse en la Tabla Nro. 19.

59 TABLA N 2.- PRESENCIA DE GLUCOSINOLATOS EN HIPOCOTILOS Y CALLOS DE MACA. MUESTRA FRACCION 1 FRACCION 2 Hipocótilo amarillo + + Hipocótilo morado + + Hipocótilo negro + + M1E1 + + M1E2 + - M1E3 + - M1E4 + + M1E5 + + M2E1 + + M2E2 + - M2E3 + - M2E4 + + M2E5 + - M3E1 + + M3E2 + + M3E3 + - M3E4 + + M3E5 + + CALLO NEGRO + - CALLO BLANCO + +

60 V ALCALOIDES. En las cromatografías preliminares se observó la separación de cuatro fracciones al usar como solvente la solución Cloroformo:metanol 2:0.12. Las muestras acidificadas desarrollaron una sola fracción, mientras que las sin acidificar mostraron cuatro fracciones. Los resultados de la primera cromatografía (de todas las muestras) se observan en la fotografía Nro. 7. En el extracto lavado de hipocótilos de maca se obtuvieron cuatro fracciones que fueron positivas tanto para el reactivo de Dragendorff. Estas fracciones también fueron positivas para el reactivo yodoplatinato de potasio, la fracción N 1 de color amarillo fue la de mayor Rf, y se presentó en la mancha más grande, la fracción N 2 de color plomizo debajo de ésta se halla en cantidades pequeñas. La fracción N 3 presentó un color marrón oscuro. La fracción N 4 que se encontró en el punto de siembra presentó un color azul cemento (Fotografía Nro 8). En la segunda cromatografía de todas las muestras, se observó la presencia de las fracciones 1, 3 y 4, la segunda fracción no se observó en ninguna de las muestras, incluyendo el extracto patrón, (fotografía Nro.9). Al observar la cromatoplaca en la lámpara de luz ultravioleta, los patrones de extractos de callos presentaron una gran cantidad de fracciones de metabolitos mostrando patrones diferentes para cada muestra (Fotografía Nro 10). Las fracciones correspondientes a los alcaloides no mostraron fluorescencia.

61 V.3.- DETECCION DE MIROSINASAS Se observó un patrón de una sola banda por muestra (foto), las bandas se observaron demasiado cerca del borde superior del gel por lo que no se midieron los Rf.

62 CAPITULO VI DISCUSIÓN VI.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS.- 1. La respuesta a las diferentes concentraciones de hormonas fue variable. La mayor producción de callos se obtuvo con los medios K,( 0.5/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN), D ( 1/0 ìm 2,4-D/ìM KIN) y Q (10/10 ìm 2,4-D/ìM KIN) los medios C ( 0.5/0 ìm 2,4-D/ìM KIN), L ( 1/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN) y P ( 1/1 ìm 2,4-D/ìM KIN) tuvieron una respuesta menor a los anteriores pero superior a los demás. Del mismo modo los medios M ( 0/1 ìm 2,4-D/ìM KIN) e I ( 0/0.5 ìm 2,4-D/ìM KIN) no produjeron ninguna respuesta callogénica, mientras que el medio E ( 0/0.1 ìm 2,4-D/ìM KIN) produjo una bajísima respuesta. De todo esto y de la observación del comportamiento de los explantes en los demás medios, podemos inferir que la presencia del 2,4-D es de mayor importancia para la inducción de callos que la KIN, siendo inclusive suficiente para la callogénesis. Esta observación es congruente con el análisis estadístico realizado para esta prueba, el cual nos muestra que el 2,4-D tiene un efecto estadísticamente significativo en la inducción de callos. Siendo su significancia mayor que la de la auxina y la interacción de ambas hormonas. Este dominancia ya fue señala da en otras ocasiones, Dodds ( 1982) hace referencia a su uso junto con el agua de coco para inducir la proliferación celular, al parecer esta alta eficiencia del 2,4-D en la inducción de callos se debe a la alta disponibilidad de auxinas en los tejidos de la mayoría de las dicotiledóneas ( Jacobsen, 1983) 2. En crucíferas, los callos son generalmente iniciados y mantenidos en medios que presentasn una relacion auxina, citoquinina mayor que 1. en nuestro caso en presencia de la KIN, la concentración de 2,4-D que dio mejores resultados fue la de 0.5 ìm, ya que en concentraciones mayores el rendimiento del medio

63 disminuye, aun cuando la relación con la citoquinina es 1/1. Por otro lado, podemos ver que la presencia de la KIN potencia la efectividad del 2,4-D siempre y cuando su concentración no exceda la del 2,4-D, pues en estos casos el rendimiento del medio disminuye. Esta disminución de la actividad podría estar relacionada a la toxicidad del 2,4- D, pues como reportan Carew y Krueger (1977, citados por Yerman ) tiene efectos inhibitorios a concentraciones de 1 mgr. por litro. De la misma la disminución en la producción de callos cuando la relación auxina/citoquinina disminuye pueden explicarse por la actividad inhibitoria que tienen las citoquininas cuando se presentan en altas concentraciones (Yeoman y Forsche, 1980). 3. El medio que produjo mayor número de callos fue el medio D, seguido por los medios O, Q, K y L, el rendimiento de masa en los medios D y Q está relacionado al número de callos generado más que al tamaño de los mismos. La significancia de cada una de las hormonas en el número de callos producidos es mayor para el 2,4-D que para la KIN, sin embargo la combinación de ambas hormonas no tiene un efecto significativo en el número de callos obtenidos. (ver apéndice: análisis estadístico) lo cual nos indicaría que cuando el objetivo es lograr un mayor número de líneas celulares quizá sería conveniente experimentar con una sola hormona, especialmente el 2,4 D. 4. La mayor efectividad del 2,4 D corresponde a la esperada, pues es congruentes con los resultados obtenidos por Carhuaz en Lepidium peruvianum (1997, sin publicar) y por los resultados obtenidos en el cultivo de tejidos de diferentes especies de la familia Cruciferae. (Flick y colb. 1983) 5. La respuesta de los ecotipos a cada uno de los medios de cultivo no fue uniforme, como puede observarse en los gráficos 2C, 2D y 2E, siendo el ecotipo negro el que presento mayor diferencia, sin embargo estas diferencias no son

64 demasiado grandes. 6. La masa de callos obtenidas en cada uno de los ecotipos fue mayor en el medio K en todos los casos, mientras que los medios con los que se obtuvo un mayor número de callos fue diferente para cada ecotipo (K, L y Q para amarillo, morado y negro respectivamente) lo que nos muestra que la respuesta de los explantes respecto al número de callos por explante no es uniforme. Al analizar la respuesta de los explantes por ecotipo, se ha observado que las raíces tienen una respuesta significativamente diferente a los otros explantes. Mientras que para la respuesta de los explantes en relación del área ocupada por los callos se observa una respuesta descendente de raíz a hoja. Es así que en ambos casos las raíces son los tejidos de mayor potencial callogenético. 7. El medio A no contiene hormonas, sin embargo en este medio se produjo una pequeña cantidad de callos, estos podrían deberse a la presencia de hormonas endógenas en este explante que permiten la callogénesis como respuesta al corte, esto sería coherente con la observación de que este es el explante que produce mayor número y masa de callos en todos los ecotipos y medios y al hecho de que en las raíces se producen auxinas endógenas (Hopkins 1999). 8. No se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de explantes de hoja, lo cual es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos, de otro lado el medio Q fue el que produjo el mayor número de callos en estos explantes. 9. Los peciolos e hipocótilos tuvieron una respuesta mucho mayor a los tratamientos siendo el hipocótilo el más susceptible de los dos, esto tendría relación con la presencia de tejido meristemático en este explante.

65 10. El medio que produjo mayor cantidad de explantes friables fue el medio K, aunque la cantidad obtenida de este tipo de callos fue bastante pequeña, lo cual se podría deber a una predisposición de la especie o al tipo de actividad de las hormonas usadas, de todos modos a diferencia del número de callos obtenido y el área ocupada por los callos, en este caso puede observarse que la interacción de las hormonas tiene un efecto más significativo que el de las hormonas solas. 11. Los explantes que produjeron la mayor cantidad de callos friables fueron los provenientes de las raíces, mientras que los provenientes de los hipocótilos produjeron menor cantidad de callos friables que los pecíolos, siendo igual que en los explantes de la región terminal de la hoja. En este caso no se observaron diferencias significativas entre los explantes de hoja terminal y proximal, aunque el menos susceptible fue el explante proximal. Si bien la raíz y el hipocótilo produjeron mayor número de callos friables, la diferencia entre ambos explantes no fue significativa. 12. El efecto del color del ecotipo en la obtención de callos friables fue significativamente diferente para el color amarillo, mientras que entre el el ecotipo morado y negro, las diferencias no fueron significativas. 13. La presencia de callos con pigmentación negra puede explicarse por la presencia de metabolitos secundarios en los callos, el número obtenido en los explantes provenientes del ecotipo amarillo fue similar al obtenido del ecotipo negro, y ambos fueron superiores a la cantidad obtenida en el ecotipo morado, por otro lado la cantidad de callos totalmente negros obtenido en el ecotipo morado fue mucho mayor que en los ecotipos negro y amarillo. Esto nos indicaría que esta pigmentación no está relacionada con el color del ecotipo del que proviene el explante.

66 VI.2.- DETECCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS 13. Los callos de Lepidium peruvianum Ch. sí producen glucosinolatos. Pero la producción de estos metabolitos varía de acuerdo al callo, pudiendo ser mayor o menor. Se encontraron callos en los que se formaron solo una de las fracciones. Esto demuestra que el cultivo de callos de maca, puede ser utilizado para hallar líneas que produzcan un solo tipo de glucosinolato, o los produzcan en cantidades mayores a las obtenidas en campo. 14. Los explantes provenientes de peciolo(e3) y de la parte proximal de la hoja (E2) mostraron una sola fracción de glucosinolatos en casi todos los casos, esto sugeriría que el origen de los explantes estaría involucrado en la cantidad y tipo de glucosinolatos producidos. Para poder comprobar esta posibilidad se tendría que realizar pruebas con un tamaño de muestra estadísticamente significativa. 15. El origen de los explantes no parece ser la causa de la variabilidad de la producción de callos. Pues los callos con diferentes patrones cromatográficos provienen de diferentes tipos de explante y de plántulas de diferentes ecotipos. Sin embargo en este caso también se observa una variabilidad alta en el explante E Los Rf de cada una de las fracciones es muy similar pero no igual para cada extracto, esto puede deberse a que, por el tamaño de la cámara, las muestras no se pudieron desarrollar en una sola cromatografía por lo que no estuvieron sujetas a condiciones idénticas. 17. El mayor tamaño de las manchas de glucosinolatos en los extractos de callo, indican una mayor concentración del metabolito en éstos. Esto nos brinda muy buenas expectativas para su producción in vitro.

67 18. En los cromatogramas de glucosinolatos se observan manchas débiles a lo largo del cromatograma, estas manchas fueron asumidas como porciones de glucosionatos la por la mirosinasa, (Kjaer, 1970). Sin embargo, Genyi y col. reportaron en el año 2001, la presencia de otros glucosinolatos en maca, si bien en pequeñas cantidades. Debido a esto estas no podemos asegurar que manchas correspondan a artefactos o a esos glucosinolatos. 19. Los patrones cromatográficos de alcaloides muestran una gran variabilidad, así como los patrones de los metabolitos con fluorescencia a la luz UV, esto nos indicaría que los callos tienen una gran variabilidad respecto a su producción de metabolitos, lo que sería de gran utilidad en el caso de necesitarse la explotación de alguno de estos. Los extractos que mostraron una presencia notablemente mayor de una de las fracciones de alcaloides fueron los de los callos M3E3 y M3E La fracción N 2 del extracto de alcaloides, no es detectable cuando se cromatografiaron cantidades pequeñas de extracto, por lo que su ausencia en la cromatografía de los extractos de callos y controles no indican ausencia necesaria del metabolito. 21. El hecho de que algunos extractos de callos muestren mayor presencia de algunas fracciones de callos y dada la pequeña cantidad en la que parecen encontrarse en los hipocótilos, el cultivo de callos o suspensiones celulares puede ser utilizada para lograr mayores cantidades que permitan el estudio de las propiedades y actividad biológica de estos compuestos. 22. La poca cantidad de alcaloides que presenta la planta, puede ser aumenta en el cultivo de tejidos utilizando callos con mayor tiempo de incubación, pues, la producción de metabolitos secundarios aumenta al iniciarse la fase estacionaria

68 (Yeoman y colb. 1980), y la de los alcaloides es inversamente proporcional a la tasa de crecimiento (Carew y Krueger, 1977). Esta propiedad debe ser tomada en cuenta tanto en el caso de desear producir alcaloides como otros metabolitos. 23. El hecho de que en algunos callos se observe manchas mas intensas que en el hipocótilo y que en otros casos se observen fracciones que no se presentan en las muestras de hipocótilos, nos indicaría el gran potencial de la planta, pues usualmente los cultivos de tejidos vegetales producen metabolitos en pequeñas cantidades ( Yanadi y Fujita, 1983), por otro lado la alta variabilidad de la producción de metabolitos merece que se realicen investigaciones posteriores para determinar si estas variaciones son fisiológics o genéticas, dado del potencial mitogénico del 2,4-D y el aumento de la variabilidad producido por la tecnica de cultivo de tejidos (Reisch, 1983). VI.3.- DETECCION DE MIROSINASAS 24. La detección de mirosinasas fue cualitativa, con la finalidad de determinar únicamente la presencia de mirosinasas en los callos e hipocótilos, pues para una evaluación cuantitativa, se requeriría de mayores estudios de la presencia de esta enzima en esta especie. 25. El que las bandas de mirosinasas no migraran mucho más allá de la parte superior del gel, a pesar de dejarlas correr por encima del tiempo requerido de acuerdo a la migración del frente de corrida, nos indicaría que estas proteínas tienen un gran peso molecular, esto estaría en concordancia con los resultados obtenidos por MacGibbon y Allison (1970) en otras especies y a la vez nos indicaría que la mirosinasas de maca son mas grandes que las de otras especies estudiadas.

69 CAPITULO VII CONCLUSIONES 1. Lepidium peruvianum es susceptible a la inducción de callos con auxinas y citoquininas. 2. La auxina 2,4-D es eficiente en la inducción de callos, siendo su concentración óptima la de 0.5 ìm. 3. La relación óptima 2,4-D/KIN es de 1 4. El comportamiento de los callos de L. peruvianum es altamente variable respecto a la presencia de metabolitos secundarios. 5. Lepidium peruvianum es una especie que presenta condiciones óptimas para realizar estudios de producción de metabolitos secundarios in vitro. 6. La enzima mirosinasa sí está presente en los callos y plantas de campo de L. peruvianum. Estas enzimas son de gran tamaño molecular.

70 CAPITULO VIII RECOMENDACIONES 1. Recomendamos iniciar un estudio del metabolismo secundario de callos de L. peruvianum, maca que nos permita determinar los factores que induzcan la producción de metabolitos in vitro. 2. También es necesario profundizar el estudio de alcaloides de maca, para determinar la estructura y actividad biológica de los mismos. 3. Realizar estudios histoquímicos que determinen la distribución de los glucosinolatos y mirosinasas en la planta. 4. Sería recomendable realizar la caracterización de las mirosinasas de L. peruvianum y compararlas con las descritas en otras especies.

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