CAPITULO IV MATERIAL Y MÉTODOS

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1 CAPITULO IV MATERIAL Y MÉTODOS IV.1.- INDUCCIÓN DE CALLOS Para la inducción de callos se siguió un protocolo en base al trabajo realizado por Carhuaz en 1997 (comunicación personal) según se describe a continuación. IV MATERIAL VEGETAL Se utilizaron plántulas de maca amarilla, morada y negra, germinadas in vitro en medio Murashigue y Skoog (1962), sin hormonas, suplementado con vitaminas, mioinositol, pantetonato de calcio, 20% de sucrosa, y 2% de gelrite. Las semillas fueron gentilmente proporcionadas por el Ing. Rolando Aliaga (CIMA UNA) y provinieron de la comunidad de Huayre Junín. IV DESINFECCIÓN La desinfección de las semillas se realizó adecuando el protocolo de desinfección de rutina usado en el LRGB, de la manera siguiente: Inmersión en alcohol al 70% : 1 minuto Inmersión en hipoclorito de Na al 2% : 10 minutos Enjuague con agua destilada estéril : 1 minuto, cuatro veces IV CONDICIONES DE CULTIVO Las condiciones del cuarto de cultivo fueron: 18 C, 1,500 Lux, fotoperíodo de 16 h de luz. A los 40 días, las plántulas tuvieron el tamaño de hoja necesario para obtener dos explantes: apical y proximal.

2 Los colores del ecotipo de maca correspondiente a cada plántula de origen fueron denominados utilizando la siguiente nomenclatura: M1 = Ecotipo amarillo, M2 = Ecotipo morado, M3 = Ecotipo negro. IV EXPLANTES Los explantes obtenidos fueron los siguientes: E1: Región apical de la hoja (Aprox. 0.5 cm de longitud x 0.5 en la base.) E2: Región proximal de la hoja del mismo tamaño que el explante anterior. Los bordes de las hojas fueron cortados para obtener una mayor área de inducción de callos. E3: Porción de peciolo aprox. 1 cm de longitud. E4: Hipocótilo completo, incluyendo la roseta meristemática, la mayoría de ellos medía tuvieron aproximadamente 0.4 cm. E5: raíces segmentos sin puntas de aprox.1 cm se escindieron de la región proximal. IV MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIÓN DE CALLOS: Se utilizaron dos hormonas vegetales para la inducción de callos, una auxina (2,4-D) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µm y una citoquinina (kinetina) en concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 µm; como medio básico se utilizó el medio descrito por Murashige y Skoog (1962) al que se le agregaron mioinositol 100 ppm, pantotenato de calcio 2 ppm, vitaminas: tiamina 2 ppm, piridoxina 0.5 ppm, ácido nicotínico 0.1 ppm y glicina 0.5 ppm; 2% de sucrosa y 0.2% de gelrite, tal como se utiliza en rutina en el LRGB, obteniéndose un factorial de 17 medios de inducción semisólidos con diferentes concentraciones de hormona incluyendo el control negativo.

3 V INDUCCIÓN DE CALLOS: Se sembraron los explantes en placas petri descartables con 25 ml de medio de inducción, haciendo cinco repeticiones por cada medio de inducción. Las placas se mantuvieron en oscuridad a 25 C. realizándose evaluaciones a partir de los 25 días de siembra con un intervalo de 10 días por evaluación durante dos meses, estas evaluaciones fueron cualitativas para confirmar el crecimiento de los callos. A los dos meses de crecimiento se hizo el primer subcultivo en placas petri descartables con medios de inducción frescos, a los cuatro meses se evaluó el material midiendo el área ocupada por cada callo sobre una cuadrícula milimetrada, para determinar así la masa relativa de los mismos y por consiguiente el medio con mayor rendimiento en masa. Seguidamente, se realizó el subcultivo de todos los callos en el medio K (ver apéndice), a partir de entonces se realizaron subcultivos cada dos meses hasta los ocho meses cuando se cosecharon los callos para la extracción de metabolitos secundarios. IV.2.- DETECCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Se realizaron cromatografías de papel para la detección de glucosinolatos y cromatografías de capa fina ascendente para la detección de alcaloides tanto en los callos obtenidos como en los controles, no se utilizó una sola línea celular debido a la pequeña cantidad de materia seca obtenida de los callos como consecuencia de su alto porcentaje de humedad. Para la extracción de los metabolitos se utilizaron 30 mg muestra estabilizada. La estabilización se realizó secando los callos en una estufa a 37 C por 36 horas para luego molerlos y guardar los frascos en un lugar seco y sin luz. Como control, se usaron muestras de hipocótilos amarillos morados y negros

4 provenientes de la localidad de Huayre y estabilizadas en las mismas condiciones que los callos. Los callos se clasificaron de acuerdo al color y naturaleza del explante del que provenían, así un callo proveniente de la zona apical de la hoja de ecotipo amarillo se denominó M1E1 y así sucesivamente (ver apéndice). Esta clasificación nos facilitó el manejo de las muestra en las cromatografías. Antes de la pulverización de las muestras se determinó el % de humedad. IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE GLUCOSINOLATOS Para la extracción y cromatografía de glucosinolatos se adecuó el protocolo de rutina utilizado por el Dr. César Fuertes en el Instituto de Química Orgánica Aplicada a la Farmacia, en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (ver apéndice), como se describe a continuación: Para la extracción etanólica se tomaron 30 mg de cada tipo de callo y se pusieron a macerar en 2 ml de etanol al 96% durante dos semanas. Se sembraron, 100 alicuotas de cada uno de estos extractos en hojas de papel Wathman N 1 de 11 x 29 cm y se colocaron en un tanque de cromatografía de papel descendente, dejándose desarrollar por 22 horas. Como sistema solvente se usó una solución de n-butanol:etanol:agua (4:1:4) descrito por Kjaer en Después de retirar los papeles del tanque de cromatografía se secaron a temperatura ambiente e inmediatamente se revelaron para lo cual se pulverizaron primero con una solución de nitrato de plata:acetona 15 mg/ml, y luego de dejar secar por unos minutos, con una solución de KOH:Etanol 20 mg/ml. Se dejaron secar las hojas de papel unos minutos y se colocaron en una estufa caliente. Una

5 vez obtenidas las manchas indicadoras, se colocaron los cromatogramas en una solución decolorante de hiposulfito de potasio al 5%, durante 20 hrs. IV EXTRACCIÓN Y DETECCIÓN DE ALCALOIDES Se utilizaron 30 mg de cada muestra, las que se pusieron a macerar en éter etílico, realizándose tres extracciones sucesivas. La cromatografía de capa fina se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Stahl (1958 y 1965), en cromatofolios de silicagel GF254 ( para las cromatografías preliminares se usaron cromatofolios de 2 x 10 cm) y cromatoplacas Kieselgel 60 G F254 (Merck) de 20 x 20 cm. En las cromatografías preliminares se realizaron con las muestras de hipocótilos de maca (controles) y se probaron las siguientes soluciones para el sistema solvente: Benzol : éter dietílico : metanol : amoniaco (75 : 75 : 6 : 0.7); Cloroformo : metanol : amoniaco (2 : 0.12 : 0.02); Cloroformo : metanol (2 : 1), (2 : 0.25), (2 : 0.15) y (2 : 0.12), siendo esta última la que se utilizó en la estandarización de la cromatografía. Se desarrollaron cromatografías de muestras acidificadas y sin acidificar. Para el revelado de las placas se utilizó el reactivo de Dragendorff y posteriormente el reactivo yodoplatinato de potasio. Antes de revelar las placas se observaron en el espectro de luz UV. En vista de la ausencia de resultados congruentes en la primera cromatografía, se procedió a estandarizar la extracción en una muestra de

6 hipocótilos de varios colores, la cantidad de metabolitos no deseables para la cromatografía fue bastante alta por lo que se procedió a lavar el extracto acidificando el extracto etéreo con HCl acuoso, recuperándose la fase acuosa a la cual, luego de ser alcalinizada con NaOH concentrado, se le agregó dos volúmenes de éter etílico para recuperar la fase orgánica. Se cromatografió este extracto en una cromatoplaca Kieselgel 60 F F254 (Merck) de 20 x 20 cm. Se revelaron los bordes de la placa con el reactivo de Dragendorff modificado por Munnier (1955) y el reactivo yodoplatinato de potasio, aislando luego las regiones correspondientes a las manchas positivas. Una vez obtenidas las fracciones positivas para alcaloides, se cromatografiaron los extractos de callos y los controles, junto con el extracto etéreo y sus cuatro fracciones, las que se usaron como un control extra. IV.3.- DETECCIÓN DE MIROSINASAS IV ELECTROFORESIS.- Se utilizó la electroforesis en geles de policrilamida (PAGE) para separar las mirosinasas, los geles y buffers fueron preparados de acuerdo al sistema de Laemmli (1970), pero eliminando el uso de SDS y mercaptoetanol tanto de las soluciones de los geles como de las de los buffers para obtener una PAGE en condiciones no denaturantes. La concentración de los geles fue de 8.6 y 7.5%. Las corridas en los geles se llevaron a cabo con una corriente constante de 30 ma, el voltaje inicial fue de 80 V y el final de 250V. La duración de las corridas fue de 5 horas. IV EXTRACCIÓN DE LAS MUESTRAS. Se llevó a cabo adaptando el protocolo de MacGibbon y Allison (1964): 0.5g de muestra fueron molidos en un mortero frío con 2 ml de buffer Tris-Cl ph 6.8,

7 se centrifugó a 10,000 rpm por 4 min, se tomaron 80 µl del sobrenadante a los que se añadieron mercaptoetanol 5 µl, glicerol 10 µl y 5µl de un stock de azul de bromofenol preparado para los procedimientos de rutina del LRGB. Se colocaron 50 µl de muestra en cada pocillo del gel. Se utilizaron hipocótilos y hojas de campo. IV DETECCIÓN DE ACTIVIDAD.- Se adaptó la modificación del método de detección de actividad basado en la formación de bandas de BaSO 4, descrito por MacGibbon y Allison (1970), esta modificación fue gentilmente proporcionada por el Dr. Atle Bones en una comunicación personal (1999). Para adaptar este protocolo se utilizó un extracto etanólico de semillas de mostaza, preparado moliendo 100 g de semillas y macerándolas en 250 ml de alcohol etílico al 96%. Cuando los geles fueron removidos, fueron colocados entre dos placas de vidrio e incubados a 50 C en una solución acuosa de ácido ascórbico 1mM; Acetato de Bario 10mM; Buffer Tris-Cl 0.5 M; ph ml/l; extracto etanólico de semillas de mostaza 300 ml/l. Cuando se hicieron evidentes las bandas, los geles fueron fotografiados con una cámara digital DAGEMIT CCD100 en blanco y negro.