ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL:

Transcripción

1 ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL: DETECCIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO Bioq. Elisa Sajaroff Laboratorio de Inmunología Celular Servicio de Inmunología y Reumatología Hospital de Pediatría Dr.J.P.Garrahan

2 ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR) DEFINICIÓN: DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CANTIDADES MÍNIMAS DE BLASTOS (NO DETECTABLES POR OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA) EN MÉDULA ÓSEA. MÉTODOS DISPONIBLES: CITOMETRÍA DE FLUJO BIOLOGÍA MOLECULAR

3 EMR: MÉTODOS DISPONIBLES Citometría de flujo (CF) Fundamento -Inmunofenotipo aberrante. Ventajas -Cuantificación directa. -Menor cantidad de células. -Más económico. Resultados más rápidos Limitaciones -Posibles falsos negativos por cambios inmunofenotípicos. -Sensibilidad limitada. Biología molecular -Rearreglos de Ig/TCR. -Genes de fusión -Mayor sensibilidad. -Target paciente específico. -Posibles falsos negativos por pérdida del target. -Mayor cantidad de células. -Muy laborioso.

4 EMR por citometría de flujo (CF) La identificación de los blastos se basa en su inmunofenotipo diferente al de la célula normal de médula ósea. FENOTIPO ABERRANTE DE LOS BLASTOS ASINCRONISMO MADURATIVO ANTÍGENOS DE OTRO LINAJE NIVEL DE EXPRESIÓN ANTIGÉNICA DIFERENTE AL NORMAL EXPRESIÓN ECTÓPICA LLA-B: CD20+CD34+ LLA-B: CD13+CD33+ CD117+ LLA-T: CD79a+CD33+ LLA-B: SUB-EXPRESIÓN CD10, CD45, CD38 SOBRE-EXPRESION CD10, CD58, CD19 LLA-T CD3 CITO +Tdt+ LLA-T: SOBRE-EXPRESIÓN CD99, CD7 SUB-EXPRESIÓN CD3, CD5

5 Detección de eventos poco frecuentes por CF: DEPENDE DE DOS VARIABLES: * Diferencia fenotípica entre blastos y células normales * Número de células analizadas. SENSIBILIDAD: *Condiciones ideales (células con inmunofenotipo muy diferente y adquiriendo > 10 7 células): 1 en 10 6 *Habitualmente: 1 en 10 4 / 10 5

6 Que debemos saber antes de hacer EMR: 1. Inmunofenotipo normal de células hematopoyéticas en médula ósea. 2. Inmunofenotipo de la leucemia al debut.

7 Panel para EMR LLA-B en 4 colores Tubo FITC PE PerCP APC 1 Syto-16 CD10 CD45 CD19 2 CD20 CD10 CD34 CD19 3 CD58 CD10 CD45 CD19 4 CD10+ CD20 CD38 CD45 CD19

8 Tu bo FITC PE PerCP PE- Cy7 1 Syto- 16 CD10 CD45 APC APC- H7 CD19 2 CD20 CD10 CD34 CD19 CD45 3 CD58 CD10 CD45 CD34 CD19 CD45 4 CD10+ CD20 CD38 CD45 CD34 CD19

9 Panel para EMR LLA-T en 4 colores Tubo FITC PE PerCP APC 1 Syto-16 CD7 CD45 CD3 2 CD99 CD7 CD5 CD3 3 Tdt CD7 CD3 CITO CD3 4 CD4 CD8 CD45 CD3

10 Perfil normal de expresión antigénica en MO. Linaje linfoide B.

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12 Diagnóstico Día 15 Día 33 Sem 12 MO normal

13 M.O. Normal linaje B regenerativo LLA-B día 15 Blastos CD45 negativo-tenue y CD38 negativo, ambos hallazgos aberrantes.

14 M.O. Normal LLA-T dia 15 Normal #1 Normal #2 Los blastos muestran > expresion de CD99 y CD7 que los normales y CD3 superficie parcial

15 LLA-B dia 33 Negativa, solo Ejemplo se observan de día 33 LB sin blastos maduros.

16 Médula regenerativa con blastos

17 Médula regenerativa con blastos

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19 CAMBIOS INMUNOFENOTÍPICOS: 16/31 casos (2010) (52%) <CD34 >CD20 >CD45

20 PORQUE HACER EMR EN LLA?

21 Asignación de grupos de riesgo (GR) en LLA pediátrica Características biológicas al Dx Edad WBC Alteraciones citogenéticas y/o moleculares Rta. a la prednisona en SP Respuesta temprana al tratamiento MO día 15 -Protocolo ALLI-2002 Morfológica (<5%, 5-25%, >25%) - Protocolo ALLIC-2009 EMR por CF al Día 15 (<0.1%, %, >10%)

22 Estratificación en grupos de riesgo ALLIC 2009 Diagnóstico y Día 8 Edad 1-5 años WBC < 20000/ul Blastos D8 1000/ul Edad <1 y 6 años ó WBC 20000/ul Blastos D8 1000/ul Blastos D8 1000/ul t (9;22) ó t(4;11) ó hipodiploidía < 45Cr EMR D15 <0.1% >0.1 y <10% >10% <10% >10% Todos los resultados RIESGO ESTÁNDAR RIESGO INTERMEDIO RIESGO ALTO

23 Cosas importantes a tener en cuenta: Muestra: sangre periférica vs MO Momento del tratamiento. Método Impacto pronóstico

24 Evaluar el impacto pronóstico de la determinación de EMR por CF al día 15 en los pacientes de AEIOP 2000 en los que se asignó grupo de riesgo por BM D33 y D78. APLICACIONES CLÍNICAS DE LA EMR OBJETIVO

25 Determinación de los valores de EMR CF para la asignación de GR % ptes. % MRD SLE 5 años IAR 5 años GR 42% <0.1% 89.9 % 7.5% RS 47% % 79.3 % 17.2% RI 11% 10% 46.1 % 47.2% RA EMR por CF al día 15 en MO Identificar pacientes con alto y bajo riesgo de recaída Ajustar la intensidad del tto para evitar la recaída

26 EMR al Dia 15 por CF factor pronóstico independiente más importante disponible en este momento del tto. En un análisis multivarianza la EMR por CF al día 15 10% resultó ser un factor de riesgo de recaída independiente aún en los pacientes que habían sido estratificados en base a la EMR por BM al día 33 y 78.

27 Resumiendo Riesgo estándar EMR <0.1% RE EMR % RI EMR >10% RA Riesgo intermedio EMR <10% RI EMR >10% RA Riesgo alto cualquier valor EMR RA

28 ALLIC 2009 (Acute Lymphoblastic Leukemia Intercontinental 2009) EMR por CF es incorporada como criterio de estratificación sólo después de que haya sido estandarizada y evaluada para los laboratorios participantes. PAUTAS ALLIC 2009

29 PAUTAS ALLIC 2009 para obtener la habilitación del laboratorio para EMR-CF *Monitoreo Intralaboratorio: -Control estricto de calibración y mantenimiento del citómetro. -Estandarización de metodologías. *Monitoreo Interlaboratorios: -Entrenamiento: Transferencia de pautas de trabajo en el laboratorio sponsor AIEOP-BFM -Control de calidad: I.-Los laboratorios participantes deben completar exitosamente 2 rondas de análisis de datos. II.- Control de calidad externo UK-NEQAS. III.-Control de resultados de EMR en laboratorio sponsor: -Envío copia del análisis y resultado alcanzado de EMR D15. -Evaluación por el sponsor. -Conclusión final del análisis y ratificación del resultado.

30 Pautas ALLIC 09. Marcación y adquisición. Muestra: Médula ósea del Día 15. Marcación y adquisición: Marcación seguida de lisis ( salvo en casos de hipocelularidad extrema donde se lisa primero). Adquirir al menos células nucleadas (cél syto +), y que representen el 30% de la celularidad de la médula (%syto+ 30%) Cargar al menos 700,000 céls/tubo. Nosotros normalmente marcamos 2x10 6 cél para adquirir 1x10 6 cells

31 Criterios evaluabilidad: 1. Eritroblastos >2% (células syto+cd45- FSC/SSC adecuado) 2. Syto + >30% y > células nucleadas 3. Cluster EMR de al menos 30 células (30 cél patológicas en totales para alcanzar la sensibilidad de 0,01% requerida para la EMR)

32 Reporte Identificación del paciente Panel utilizado, # y % células nucleadas, % eritroblastos, % EMR. Si hay discrepancia en el valor entre los tubos, se reporta el valor más alto del tubo donde se ve con mayor claridad la población.

33 Nuestra experiencia

34 RESULTADOS (Presentado en BFM, Kiel, 2013) EMR AL DÍA 15 por CITOMETRÍA DE FLUJO EMR D15 ALLIC-09 (pac elegibles n=163, jul 11-mayo 13) n (%) No evaluables 8 (5) < 0.1% 43 (26.5) Pacientes (n) reasignados de GR por EMR D15 CF % 87 (53.7) 19 10% 24 (14.8) 10 (8 RI a RA y 2 RE a RA) La EMR D15CF permitió reasignar a 29 pacientes (18%) a un grupo de mayor riesgo con la consiguiente adecuación de la intensidad del tratamiento.

35 Asignación de Grupos de Riesgo GR inicial (n) GR con EMR (n) % GR GRE GRI GRA

36 Demográfica de los grupos de riesgo GRE (n=17) B-ALL 17 (100%) 14 com 3 preb GRI (n=108) 100 (93%) 3 undetermined 3 BI, 70 BII 23 BIII, 1 B IV T-ALL TI 5 TIII 1 early LALA 0 1 B-My GRA (n=39) 22 (56%) 2 BI, 14 BII 4 BIII 2 Bcp with eos 17 1 TI, 1 TII 8 TIII, 6 TIV 1 early 0

37 Grupo de alto riesgo (n=31) Por Biología molecular/citogenético (n=9) 2 t(5;14) (EMR<10%) 4 BCR-ABL (1 con EMR>10%) 3 MLL rearreglado (EMR 2>10% y 1<0,1%, 2 con MRP) Por mala rta a la prednisona (n=16) 9 con EMR>10% 6 con EMR 0,1-10% 1 con EMR detectable <0,1% (Marian y paiva mll con mala rta, estan en bm) Por EMR >10% (n=6)

38 Nivel de EMR durante el tto 100% 80% 60% 40% 20% 0% Día 15 Día 33 Sem 12 no evaluable >10% % <0.1%

39 PROTOCOLO PILOTO Noviembre 2009 a Junio 2011 (Sólo HPG) PACIENTES INGRESADOS: 130 PACIENTES ELEGIBLES: % CAMBIO GRUPO DE RIESGO POR EMR D15 20% DE RECAÍDAS

40 psle global del PILOTO pefs (SE) (n=105): 72 (5)%

41 psle en los GR del PILOTO GRE (n=15).pefs (SE): 100 (0)% GRI (n= 64).pEFS (SE): 74 (7)% GRA (n=26).pefs (SE): 50 (10)% p-value:

42 Análisis de las recaídas según EMR día 33 y 78 EMR+(CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) >0,1% 27 casos Recaídas: n=13 EMR (CF y/o Rq-PCR, día 33 y/o 78) <0,1% 78 casos Recaídas: n=7 p<0,00001

43 psle según EMR+/- (día 33, CF y/o Rq-PCR n= 103) MRD + (n=26): pefs (SE): 44 (10)% MRD (n=77): pefs (SE): 82 (5)% Log-rank test: p= 0,0001

44 RqPCR MRD Análisis de concordancia al día 33 y 78 en la EMR por CF y BM (cut off 0.01%) n=24 n=29 R2= n = neg/neg n=11 (9<0.1%) FC MRD

45 PAUTAS INDISPENSABLES PARA LA PUESTA A PUNTO DE LA EMR Estandarización metodológica. Entrenamiento y desarrollo de criterio adecuado del operador. Conocimiento del inmunofenotipo normal de células hematopoyéticas en médula ósea. Panel completo al diagnóstico que permita definir el panel de seguimiento. Evaluación de posibles cambios fenotípicos.

46 CONCLUSIONES La EMR por CF: Especialmente útil en etapas tempranas del tratamiento. Es indispensable para la correcta adecuación del tratamiento en los protocolos actuales de LLA.

47 Algunos casos clínicos

48 Ojo syto+ < 30% y < eventos syto+ La muestra es no evaluable!!! la EMR lo reasignaría a un grupo de mayor Riesgo. EMR=0,07*100/22,2= 0,32%

49 Al repetir syto 60,3% y eventos syto+ EMR = 0,2*100/60,3= 0,33% Ahora podemos informar este resultado!

50 Day 0 Day 15 Syto 88,1% EMR 5,8*100/88,1=6,67%

51 Day 33 EMR D33 0,04*100/79,3=0,05%

52 EMR D78= 0,03*100/66=0,045% Day 78

53 Day 15 Syto 97% events styo+ Normoblasts 49% - MRD 0.71% Day 33 Syto 73% events styo+ Normoblasts 37% MRD % 0.04%

54 Hospital de Pediatría Dr. J.P. Garrahan Servicio de Inmunología y Reumatología Dr. Ricardo Russo Laboratorio de Inmunología Celular Bioq. Jorge Rossi Bioq. Andrea Bernasconi Téc. Marianela Sanz Bioq. Elisa Sajaroff Bioq. Carolina Carrara

55 Muchas gracias por su atención