RESUMEN INTRODUCCION

Transcripción

1 RESUMEN En México, la trichinellosis es transmitida por la carne de cerdo o sus derivados, crudos o mal cocidos, que contienen la larva infectante de Trichinella spiralis. Diversos reportes han demostrado que la inmunidad protectora es mediada por una respuesta tipo Th la cual esta dirigida hacia la larva recién nacida y el adulto del parásito, en este último, la fecundidad es afectada considerablemente. A pesar de estos hallazgos, es notable la poca información que hay sobre la identificación y caracterización inmunoquímica de los antígenos blanco del adulto que pueden inducir inmunidad protectora y se ha señalado la importancia de realizar este tipo de estudios. Por esta razón, se llevó a cabo la infección experimental de ratas con T. spiralis para analizar la respuesta de anticuerpos IgA, IgG y totales, séricos e intestinales, contra el estadio adulto durante la infección, e identificar el perfil de antígenos que indujeron dichas respuestas de anticuerpos. Por otra parte, se determinó la cantidad de anticuerpos inducidos por la inmunización con los antígenos del adulto potencialmente protectores. Los resultados obtenidos indicaron que el estadio adulto de T. spiralis indujo la producción de anticuerpos a nivel sistémico e intestinal en ratas infectadas experimentalmente; la respuesta humoral es más rápida en intestino que a nivel sistémico, sin embargo, esta última fue mayor y más persistente durante la infección. Los antígenos inmunodominantes correspondieron a proteínas de 74, 8 y 4 kda las cuales fueron reconocidas por los anticuerpos IgG y totales tanto séricos como intestinales mientras que los componentes de 4, 44, 6, y 65 kda fueron reconocidos únicamente por los coproanticuerpos. La respuesta de IgA sérica e intestinal fue la más baja y los anticuerpos se unieron débilmente a tres proteínas del parásito de 69, y 9 kda. En las ratas inmunizadas, la producción de anticuerpos contra las diferentes proteínas del adulto fue variable, lo cual se pudo deber al fondo genético del animal, la dosis o el esquema de inmunización necesarios para inducir la producción de anticuerpos, o bien, a las diferencias en la naturaleza química de las proteínas del adulto utilizadas en la inmunización. Extender la caracterización inmunoquímica de los anticuerpos monoespecíficos proporcionará información útil sobre el papel de los antígenos en la inmunobiología del parásito y su relevancia en diagnóstico y protección. INTRODUCCION Las infecciones helmínticas representan al grupo más importante de las infecciones que afectan a la humanidad y animales de importancia económica en el planeta. En este sentido, uno de los parásitos helmintos más estudiados es el nemátodo Trichinella spiralis el cuál representa un modelo admirable para el estudio de las infecciones producidas por los nemátodos en general. Es importante señalar que en nuestro país, la trichinellosis es considerada un problema de salud pública. Asimismo, esta infección tiene una amplia distribución mundial y puede ser transmitida al humano por animales domésticos y una gran variedad de animales silvestres. El estudio de la interacción huéspedparásito es un requisito indispensable para poder entender las bases moleculares de la misma a diferentes niveles. La caracterización de la respuesta de anticuerpos (Acs) y de componentes de estos organismos metazoarios relevantes en la biología del parásito es necesaria para identificar componentes esenciales en diagnóstico, protección, estudios epidemiológicos y en la sobrevivencia del parásito. En este contexto, T. spiralis presenta varias fases de desarrollo con diferentes localizaciones en el huésped; el adulto (AD) en el intestino, la larva recién nacida (LRN) en la sangre y brevemente en el miocito, y la larva infectiva (LM), en la célula muscular y brevemente en el intestino. Estudios efectuados en el modelo murino han permitido demostrar que a nivel intestinal, el parásito induce una respuesta tipo Th que se caracteriza por la expresión de IL-4, IL-5, IL-9, IL- e IL- las cuales tienen varios efectos como son la elevación de células cebada, la hiperplasia de células caliciformes en la mucosa intestinal, la hipersecreción de moco y la hipercontractibilidad del músculo liso intestinal, así como la producción elevada de inmunoglobulinas IgA, IgG, IgE e IgM. Todos estos cambios conducen a la eliminación del parásito del intestino del huésped. En diversos estudios, se ha descrito la participación de las distintas clases de Acs en protección, por ejemplo: los Acs pueden interferir en la penetración de la larva infectiva al epitelio intestinal, mediar la expulsión de los parásitos intestinales, dañar directamente al adulto y disminuir su fecundidad. También, se ha observado que hay un incremento rápido de las células productoras de Acs específicos en la mucosa intestinal a partir del día postinfección. Por otra parte los productos de excreción-secreción del parásito AD pueden alcanzar la vía sanguínea e inducir la producción de Acs a nivel sistémico. Sin embargo, hasta el momento no se han identificado los antígenos del AD que inducen (indirectamente) las alteraciones fisiológicas intestinales relacionadas con la expulsión o la producción de los anticuerpos anti-ad protectores. Asimismo, no se sabe la relevancia inmunológica de los Acs anti-ad producidos sistémicamente. Resultados de proyectos anteriores han permitido demostrar en ratas infectadas experimentalmente con el parásito, la producción de Acs totales anti-ad a nivel sistémico. El nivel máximo ocurre el día 9 postinfección y están dirigidos contra varias proteínas del AD que también son reconocidas por los anticuerpos totales inducidos por el parásito en pacientes con trichinellosis. En ratas infectadas experimentalmente con el parásito, se ha detectado la producción de anticuerpos totales intestinales los días, 7 y y de IgA anti-ad el día postinfección. Se han producido anticuerpos policlonales contra varias proteínas del AD potencialmente protectoras reconocidas por los anticuerpos séricos totales de ratas y humanos infectados con T. spiralis. Así, el propósito de este proyecto consistió en identificar los antígenos del AD reconocidos por los Acs IgA, IgG y totales séricos e intestinales durante la infecciôn y determinar la cantidad de Acs especîficos en los sueros de las ratas inmunizadas con las proteînas del AD potencialmente protectoras. Los datos obtenidos de este proyecto aportarán más información sobre la caracterización de antígenos del estadio AD de T. spiralis, y darán más soporte para determinar más adelante su papel en la biología del parásito. Además, permitirán identificar antígenos del adulto con valor potencial en diagnóstico y protección.

2 METODOS EXPERIMENTALES Animales.- Se emplearon ratones NIH, para mantener el ciclo vital de Trichinella spiralis. Se utilizaron ratas Wistar, para obtener el estadio adulto, así como para efectuar el estudio longitudinal de la respuesta de Acs séricos e intestinales. Los animales se desparasitaron previamente utilizando mebendazol, praziquantel y metronidazol durante 7 días y se albergaron en cajas de plástico con aserrín esterilizado a C durante 5 min en autoclave. Se les proporcionó alimento comercial para ratas y ratones esterilizado con calor seco a 5 C durante minutos y agua acidificada y suplementada con vitaminas. La presencia de huevecillos, quistes o nemátodos (larvas o adultos) se analizó periódicamente mediante la técnica de flotación con ZnS4 (Faust y col. 99) o de Baermman, muestreando los animales al azar antes y después del tratamiento. Obtención de LM de T spiralis.- La recuperación de LM se hizo de ratones con días de infección. Se obtuvo el músculo esquélético. El tejido muscular cortado finamente se agregó a una solución de pepsina %-ácido clorhídrico % para digerirlo. La solución de digestión se tamizó sobre un embudo conectado a un tubo de ensayo (aparato de Baerman). Las larvas se colectaron del fondo del tubo por sedimentación espontánea. El procedimiento se efectuó para preparar una suspensión de larvas infectivas para determinar la carga parasitaria en el tejido muscular cuantificando el número de LM/g de tejido, para infectar por vía intragástrica a ratones para el mantenimiento del ciclo vital del parásito o para la infección experimental de las ratas. Obtención de parásitos adultos (AD).- Los parásitos AD se obtuvieron del intestino de ratas Wistar días después de la infección con T. spiralis. El intestino cortado en trozos se depositó en un aparato de Baermman provisto de gasa y PBS. Después de un período de incubación de horas a 7 C, los parásitos AD se recuperaron del fondo del tubo, se lavaron y se almacenaron en regulador Trizma adicionado de inhibidores de proteasas a - º C hasta su uso. Obtención de extracto soluble total (EST) de AD.- El EST se obtuvo de los parásitos AD resuspendidos en el regulador Tris-HCl mm ph 8. con inhibidores de proteasas (TPCK 5 µg/ml, TLCK 5 µg/ml y PMSF 74 µg/ml). Los AD se homogenizaron en frío en un homogenizador de tejidos. Posteriormente, se agregó desoxicolato de sodio a una concentración final del % y se continuó con la homogenización. Por último, el lisado se centrifugó a rpm durante minutos a 4 C en una centrífuga Eppendorf 544. Se separó el sobrenadante, el cual se utilizó como antígeno después de determinar la concentración de proteínas mediante el método de Lowry modificado pordulley y Grieve. El antígeno se almacenó - C hasta su uso. Obtención de sobrenadante de heces de ratas infectadas experimentalmente con T. spiralis.- Ratas Wistar se infectaron por vía intragástrica con LM y las muestras de heces se colectaron individualmente en los días,, 5, 7,,, 4, 7, 9 postinfección. La materia fecal se mezcló en PBS (: o : P/V), se dejó reposar durante 5 minutos y se centrifugó a 5 rpm durante minutos. El sobrenadante se separó y almacenó a -º C hasta su uso para la determinación de los coproanticuerpos por ELISA e IET. El sobrenadante preparado : P/V se diluyó :6 o : durante las pruebas de titulación de los diferentes isotipos de anticuerpos. Se continuó la colección de materia fecal hasta el día 6 después de la infección y las muestras se congelaron a - º C. Las ratas se sacrificaron y se obtuvo el diafragma para evaluar la carga parasitaria. Obtención de sueros de ratas infectadas experimentalmente con T. spiralis.- Ratas Wistar se infectaron por vía intragástrica con LM y las muestras de suero se colectaron individualmente en los días,, 5, 7,,, 4, 7, 9,, 4, 6, 8,, 4 y 6 postinfección. Los sueros se almacenaron a - º C hasta su uso. ELISA-I para la detección de anticuerpos de rata.- Para analizar la reactividad de los Acs séricos o de heces, el ELISA se realizó utilizando como fase sólida placas de poliestireno de 96 pozos (COSTAR), un volumen de μl para cualquiera de los reactivos empleados en el ensayo, la concentración de ug/ml del EST de AD, el sobrenadante de heces de rata diluído :, :6, : o :, la dilución óptima de IgG de chivo anti-inmunoglobulinas totales (:) o anti IgG de rata-peroxidasa (:), de anticuerpo de conejo anti-iga (cadena α) de rata, sérica y de secreción, y como conjugado peroxidasa-igg de chivo anti-anticuerpo de conejo (cadena γ). La reacción antígeno anticuerpo se reveló utilizando peróxido de hidrógeno/o-fenilendiamina en regulador de citratos fosfatos ph5. Se determinó la absorbencia a 49 nm en un fotocolorímetro automático. Los valores de DO indican los niveles de anticuerpos en la muestra. Inmunoelectrotransferencia.- La inmunoelectrotransferencia se realizó en tres fases: electroforesis, electrotransferencia e inmunodetección. La electroforesis se efectuó en condiciones reductoras utilizando 5 μg de antígeno soluble de adulto y -5 V. Las proteínas del adulto separadas se transfirieron a papel durante h a V. Las membranas se cortaron en tiras, se hidrataron y se bloquearon con Trizma 5 mm-nacl 5 mm-tween. %-Leche % (TBSTL) y se incubaron con: a) Suero o sobrenadante de heces de ratas infectadas con el parásito para identificar los antígenos del AD potencialmente protectores. El sobrenadante se probó con diferentes diluciones de anticuerpo secundario (conjugado POD-IgG de chivo anti-inmunoglobulinas totales o IgG de rata, anticuerpo de conejo anti-iga (cadena α) de rata, sérica y de secreción, y como conjugado peroxidasa-igg de chivo anti-anticuerpo de conejo (cadena γ). La reacción antígeno-anticuerpo se puso de manifiesto utilizando opti4cn hasta la aparición de bandas de color morado. Titulación de anticuerpos policlonales contra las proteínas del adulto de T. spiralis potencialmente protectoras. Los sueros de las ratas inmunizadas con las proteínas del adulto potencialmente protectoras se diluyeron en forma seriada y se analizaron por ELISA para determinar la cantidad de anticuerpos contra el antígeno soluble de AD por ELISA empleando como anticuerpo secundario IgG de chivo anti inmunoglobulinas totales de rata conjugada a peroxidasa. Se determinó el título como la dilución máxima en la que se observó una DO de.5.

3 Análisis de resultados. Se utilizó la prueba de ANOVA para medidas repetidas para analizar los valores de DO obtenidos del ensayo de ELISA, ANOVA unifactorial para evaluar la carga parasitaria en los diferentes grupos de ratas. Para hacer la comparación de las medias de todos los grupos se empleó el método de comparación múltiple de Kneuman-Student-Keuls. Para identificar los antígenos del AD potencialmente protectores se ilustra en las fotografías las proteínas contra las cuales están dirigidos los anticuerpos de rata. RESULTADOS Meta,, 5. Anticuerpos IgG.- La producción de IgG sérica e intestinal en las ratas infectadas con el parásito fue heterogénea, y la magnitud de la respuesta de IgG sérica (suero diluído :) fue más elevada que la de IgG intestinal (sobrenadante diluído :6) (figura A y B). No hubo producción de IgG sérica durante los primeros 7 días, sino hasta el día postinfección, alcanzó un máximo el día 7, decreció el día y se incrementó nuevamente hasta el día postinfección (figura A). Los anticuerpos IgG séricos (figura C), se unieron a 9 proteínas de 5, 4, 74,, 97, 57, 4, y 9 kda. De estas resaltó el reconocimiento de la proteína de 4 kda seguida de la de 5 kda, lo cual ocurrió en los días a 9 postinfección, después de este período de tiempo, la intensidad del reconocimiento hacia estas proteínas disminuyó. El reconocimiento de las proteínas de y 97 kda ocurrió durante la infección a partir del día 7, mientras que contra las proteínas restantes se observó lo mismo excepto, que el reconocimiento inició después; el día para la de 4 kda, el día 9 para la de 57 kda, y el día postinfección para la de y 9 kda. Con respecto a la respuesta de IgG intestinal en las ratas, la producción de anticuerpos fue heterogénea y baja en general. De acuerdo con la cinética de producción de este isotipo (figura B) niveles detectables se observaron a partir del día 5, la respuesta se incrementó alcanzando un pico el día, decreció hasta el día 9 y nuevamente se incrementó el día 8. Dos picos de producción de diferente magnitud se observaron los días y 8. En el día se observó la mayor producción de anticuerpos. Los antígenos reconocidos (datos no mostrados) correspondieron a aproximadamente componentes cuyo peso molecular estuvo dentro de un intervalo de 4 a 4 kda. El mayor número de componentes fue reconocido en los días 5, 7 y ; 9 componentes de 4 a kda. Asimismo, los componentes de más alto peso molecular (4 y 8 kda) fueron reconocidos los días 9 y mientras que dos de los componentes de más bajo peso molecular (44 y 4 kda), fueron reconocidos durante la infección, a partir del día 7 postinfección. Tomando en consideración que la respuesta de coproanticuerpos IgG fue baja utilizando mezclas de sobrenadante de heces diluidas :6 P/V, se realizó un ensayo más diluyendo las muestras de heces : P/V para analizarlas individualmente en la inmunodetección en un intervalo más corto de tiempo (del día al 7 postinfección), dado que es de nuestro interés analizar la respuesta temprana de anticuerpos. Los resultados obtenidos por ELISA (datos no mostrados) fueron similares a los de los sobrenadantes de heces diluidos :6 con diferencias menores; se observó la producción de anticuerpos a partir del día 5, un pico en el día 7 y posteriormente, la producción de IgG se abatió hasta el día 7 postinfección. Para la inmunodetección (figura D), Se escogieron los sobrenadantes de heces con mayor reactividad por ELISA; dos del día 5, una del día 7 o del día. Se incluyeron muestras de los días y. No se observó reconocimiento de antígenos en los días y postinfección, posteriormente en los días 5 se reconocieron 4 proteínas de 4, 44, 65 y 68 kda reconocidos por IgG. Así mismo, los anticuerpos IgG producidos en los días 7 y reconocieron los componentes de 4 y 67 kda. Cabe mencionar que el reconocimiento de dichas proteínas fue más nítido. Meta,, 5. Anticuerpos IgA.- Las muestras de suero colectadas a diferentes tiempos postinfección se diluyeron : para analizarlas por ELISA utilizando antigeno soluble total del estadio adulto, anticuerpo de conejo anti-iga (cadena α) de rata, sérica y de secreción, y como conjugado peroxidasa-igg de chivo anti-anticuerpo de conejo (cadena γ). En la gráfica se muestra la media de los valores de DO y el error estándar (figura A). La respuesta de este anticuerpo fue baja o nula en el transcurso de la infección (p>.5). Se utilizó una mezcla de sueros de 6 ratas para cada día post infección y se diluyó :. Los sueros se hicieron reaccionar con las proteínas del estadio adulto unidas a la membrana y para evidenciar la reacción Ag-Ac se usaron los anticuerpos empleados en el ELISA correspondiente. En la figura B se muestra el reconocimiento de antígenos en los tiempos postinfección indicados, los marcadores de peso molecular (a), las proteínas totales del parásito adulto (b) y como testigo positivo, la inmunotinción con una mezcla de sueros de ratas infectadas con 8 larvas musculares revelada con un conjugado peroxidasa-antiinmunoglobulinas totales de rata (T+). A pesar de que los niveles de IgA no fueron detectables por ELISA, los anticuerpos de la clase IgA presentes en el suero se unieron débilmente a tres proteínas del parásito de 69, y 9 kda; el componente de kda fue reconocido a partir del día 7 y el de 9 kda, a partir del día 4 p.i., el reconocimiento de ambas proteínas permaneció así hasta elfinal del estudio mientras que la proteína de 69 kda fue reconocida los dias 7 y 4 p.i. La producción de IgA intestinal fue similar a la de IgA sérica descrita anteriormente. Anticuerpos totales.- El análisis de anticuerpos totales en las muestras de suero colectadas antes y a diferentes intervalos de tiempo después de la infección de las ratas con el parásito se muestra en la figura A. La respuesta individual (datos no mostrados) de anticuerpos totales fue heterogénea en las ratas conforme progresó la infección. Para observar la tendencia en la respuesta de dichos anticuerpos se calculó la media y el error estándar de los valores de DO individuales (figura A). La producción de anticuerpos totales en suero se detectó a partir del día 7 postinfección alcanzó un pico el día que se mantuvo hasta el final del estudio. Con respecto al perfil de proteínas reconocidas por los anticuerpos totales séricos (figura C), se observó el reconocimiento inespecífico de una proteína de kda. Posteriormente en los días, 4 y 7 las proteínas de 8,

4 67 la de kda fueron reconocidas con intensidad variable. El reconocimiento hacia estas proteínas disminuyó el día 9 y nuevamente se intensificó a partir el día hacia la proteína de kda, y a partir del día 4 hacia el componente de 4 mientras que se detectó el reconocimiento de otra proteína adicional de 74 kda. Asimismo la intensidad del reconocimiento hacia la proteína de 67 fue casi imperceptible, comparada con la que se observó los días a 7 postinfección. Asimismo, ocurrió el reconocimiento tardío y muy débil de proteínas de y de 57 kda (día 6 a pi). Cabe mencionar que el número de proteínas reconocidas por los coproanticuerpos totales es muy pequeño respecto al de las proteínas que constituyen al antígeno soluble total o al que es reconocido por el suero de ratas infectadas con 8 larvas musculares (T+). En lo que se refiere a la producción de anticuerpos totales en intestino a lo largo de la infección, se observaron resultados similares en cuanto a la variabilidad de la respuesta entre las diferentes ratas (datos no mostrados). Sin embargo, la producción de anticuerpos (figura B) fue diferente a la observada en suero (figura A); no hubo producción de anticuerpos durante los primeros cinco días, esta se detectó a partir del día 7 y el nivel correspondió al más elevado durante la infección. Dicha respuesta decreció hasta el día 4 y nuevamente se incrementó hasta el día 9 para disminuir hasta el final del estudio. Por otra parte, el reconocimiento de antígenos por los coproanticuerpos totales (sobrenadante diluído : P/V) reveló varias proteínas que solo fueron evidentes los días 7 y postinfección (figura D); el día 7, fueron seis de 8, 74, 45, 7, 44,4 kda. A diferencia de la respuesta de anticuerpos totales séricos, en la respuesta de coproanticuerpos (figuras C y D) el reconocimiento de antígenos importante ocurrió el día 7 y mientras que el reconocimiento por anticuerpos totales séricos del al 7 y posteriormente, del 4 al. Además, de las proteínas reconocidas por los anticuerpos en suero y en heces, dos parecen ser las mismas; 4 y 8 kda mientras que tres proteínas son reconocidas solo por anticuerpos séricos 74, 67 y kda o los coproanticuerpos 45, 7, 44 y 4 kda, así como también, el reconocimiento fue más intenso por los anticuerpos totales séricos que por los coproanticuerpos totales. Metas,. Carga parasitaria muscular en las ratas infectadas con T. spiralis. Concluídos los períodos de colección de materia fecal y suero las ratas se sacrificaron para obtener el diafragma y determinar el nivel de infección mediante digestión artificial del músculo. De las ratas Wistar infectadas con larvas musculares de T. spiralis se recuperaron aproximadamente en promedio entre 55 a 9 larvas musculares/g de diafragma (figura 4). Meta, 4, 5. Titulación de los anticuerpos monoespecíficos de rata contra los antígenos inmunodominantes del estadio AD. Los sueros obtenidos de las ratas Wistar inmunizadas con las proteínas inmunodominantes del parásito AD indicadas en la figura 5, se titularon por ELISA-Indirecto (figuras 6 y 7). En las titulaciones de los anticuerpos se analizaron los sueros monoespecíficos, así como los correspondientes sueros preinmunes (sueros colectados antes de la inmunización). En la titulación de anticuerpos contra las proteínas de 9 kda y 69 kda, se observó que los valores de DO obtenidos con los sueros preinmunes fueron cercanos a cero; sin embargo, los valores de DO de los sueros obtenidos después de completar el esquema de inmunización fueron igualmente cercanos a cero, lo que indicó que no hubo producción de anticuerpos contra las proteínas antes mencionadas (figura 6). Por otro lado, en la titulación de los anticuerpos contra las proteínas de 9, 49, 99 (figura 6), 94, 5,, 9 y 78 kda (figura 7), la densidad óptica de los sueros preinmunes correspondientes fue, en general, cercana a cero, en tanto que los sueros contra las proteínas indicadas presentaron valores de densidad óptica mucho mayores que los de los sueros preinmunes (figuras 6 y 7). Además, se observó que en el caso de las proteínas de 94, 9, y 78 kda (figura 7), aún a una dilución de :,4 la producción de anticuerpos fue todavía detectable; en contraste, en la titulación del suero contra la proteína de 99 kda (figura 6) y 5 kda (figura 7), a la dilución de :5,, la cantidad de anticuerpos estuvo disminuida, y en el suero contra la proteína de 49 kda (figura 6), se observó lo mismo pero a la dilución :56. De acuerdo a estos resultados, la producción de anticuerpos contra cada una de las proteínas fue diferente; asimismo, la producción de anticuerpos contra las proteínas de 9, 94, y 78 kda (figura 7) fue la más elevada mientras que la menor producción de anticuerpos se observó contra las proteínas de 9, 49 y 99 (figura 6) y 5 kda (figura 7). La pequeña variación observada en la intensidad de la infección sugiere diferencias en la susceptibilidad o resistencia a la infección de las ratas analizadas en este estudio. Estas diferencias pueden ser debidas al diferente fondo genético de las ratas ( outbred ) como se ha observado entre cepas de ratones inbred con MHC diferente. En este contexto, la heterogeneidad de la respuesta de anticuerpos IgG, IgA y totales e intestinales observada en este estudio puede estar también bajo el control de genes dentro del MHC. Resultados similares se han encontrado en la respuesta de anticuerpos hacia los antígenos de ES del adulto o los de superficie de los tres estadios de T. spiralis entre cepas de ratones inbred con MHC diferente. No solo la capacidad del hospedero para producir una determinada clase de anticuerpo influye en el tipo de respuesta inmunitaria que se produzca por la infección, la concentración relativa de los antígenos de cada estadio de T.spiralis, la naturaleza química y densidad de los epitopos presentes en los mismos y el tiempo en que los antígenos de cada estadio entran en contacto con el sistema inmunológico pueden ser factores determinantes. Esto probablemente se reflejó en las diferentes cinéticas de producción de los anticuerpos evaluados en este trabajo lo cual se tradujo en un reconocimiento diferencial de los antígenos de T. spiralis durante la infección; se observaron variaciones cuantitativas y cualitativas en el reconocimiento de los mismos y la respuesta fue más temprana en la mucosa intestinal que a nivel sistémico. Las diferentes cantidades de anticuerpos monoespecíficos producidos por las ratas inmunizadas indicaron que no hubo un patrón respecto al peso molecular de las proteínas para inducir la producción de anticuerpos. La no producción de anticuerpos contra las proteínas de 9 kda y 49 kda, se pudo deber a múltiples factores; el fondo genético del animal, la dosis o el esquema de inmunización necesarios para inducir la producción de anticuerpos, o bien, a las diferencias en la naturaleza química de las proteínas del adulto utilizadas en la inmunización. Esto último también explicaría las diferencias en los títulos de los anticuerpos policlonales.

5 D O 4 9 n m D.O B A C.5. B kda T IE MP O P O S T IN F E C C IO N 5 4 c kda T IE MP O P O S T IN F E C C IO N 5 8 D a b T+ DIAS POSTINFECCION a b T+ DIAS POSTINFECCION Figura. Producción de IgG sérica e intestinal en ratas infectadas con T. spiralis.- Se muestra la producción de IgG sérica (A) e intestinal (B) durante la infección, así como el perfil de antígenos reconocidos por los anticuerpos IgG séricos (C) e intestinales (D). Del lado izquierdo de los paneles C y D se Indican los marcadores de peso molecular (a) y las proteínas totales del parásito (b).

6 DO (4 9 n m)..9.8 A DIA S P OS T INF E CCION B 9 Figura. Producción de IgA sérica en ratas infectadas con T. spiralis.- Se muestra la producción de IgA sérica (A) durante la Infección, así como el perfil de antígenos reconocidos por los anticuerpos (B). Del lado izquierdo del panel B se Indican los marcadores de peso molecular (a) y las proteínas totales del parásito (b).

7 DO (49 nm) D.O A..9.8 B Tiempo post inf ección C kda T IE MP O P O S T IN F E C C IO N P / V : D a b T+ a b s/s T- T+ Figura. Producción deanticuerpos totales séricos e intestinales en ratas infectadas con T. spiralis.- Se muestra la producción de los anticuerpos totales séricos (A) e intestinales (B) durante la infección, así como el perfil de antígenos reconocidos por los anticuerpos IgG séricos (C) e intestinales (D). Del lado izquierdo de los paneles C y D se Indican los marcadores de peso molecular (a) y las proteínas totales del parásito (b).

8 No. DE LM / g DE DI AFRAG M A No. DE LM/g DE DIAFRAGMA E+4 E RATA RATA M EDI A Y ERRO R ESTANDAR RATA Figura 4. Número de larvas /g de diafragma obtenidas a los 5 días pi, datos individuales (-6) y la media y error estándar (extremo derecho)

9 Tinción de Proteínas Totales A B R H 9 kda 9 kda 94 kda 69 kda 49 kda 5 kda 9 kda kda 99 kda 78 kda ª INMUNIZACIÓN Figura 5. Selección de proteínas inmunodominantes, del extracto soluble total del estadio adulto de T. spiralis. Se realizó la inmunoelectrotransferencia empleando como antígeno el extracto soluble total del estadio adulto de T. spiralis y se hizo la detección de las proteínas reconocidas por una mezcla de sueros colectados de pacientes con trichinellosis en la 5ª semana postinfección o de ratas infectadas con 8 larvas de T. spiralis el día después de la infección. Se muestran las proteínas estándar (A) cuyo peso molecular se indica a la izquierda, el perfil de las proteínas totales del parásito (B), el perfil de proteínas antigénicas para la rata (R) y para el humano (H). Las proteínas seleccionadas para la producción de anticuerpos monoespecíficos se indican en la parte derecha de la figura y corresponden a las proteínas reconocidas con alta frecuencia por el humano y/o la rata.

10 TITULACION DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEINA DE 9 kda TITULACIÓN DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 9 kda Dilucion TITULACION DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEINA DE 69 kda Dilucion.5 TITULACIÓN DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 49 kda TITULACION DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEINA DE 99 kda Figura 6. Titulación de los sueros de rata contra las proteínas de 9 kda, 9 kda, 69 kda, 49 kda y 99 kda del adulto de T. spiralis por ELISA. Los sueros obtenidos de las ratas inmunizadas con las proteínas que se indican se titularon utilizando extracto soluble total de adulto mediante ELISA- Indirecto según se indica en Materiales y Métodos. Se utilizaron μg/ml de antígeno y la dilución de conjugado : Dilucion Suero Monoespecífico Suero Preinmune

11 TITULACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 94 kda TITULACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 5 kda TITULACIÓN DE LOS ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 9 kda TITULACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE kda TITULACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LA PROTEÍNA DE 78 kda Sueros Monoespecíficos Figura 7. Titulación de los sueros de rata contra las proteínas de 94 kda, 5 kda, 9 kda, kda y 78 kda. Los sueros obtenidos de las ratas inmunizadas con las proteínas que se indican se titularon empleando extracto soluble total de adulto mediante ELISA-Indirecto según se indica en Materiales y Métodos. Se utilizaron μg/m de antígeno y la dilución : de conjugado Sueros Preinmunes