1. RESUMEN.- Trichinella spiralis es el causante de la trichinellosis en nuestro país. Uno de los problemas más importantes es la dificultad para

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1 1. RESUMEN.- Trichinella spiralis es el causante de la trichinellosis en nuestro país. Uno de los problemas más importantes es la dificultad para diagnosticar la trichinellosis tempranamente y tratarla oportunamente. El tratamiento de la trichinellosis se realiza utilizando derivados de benzimidazol los cuales son eficaces contra los parásitos intestinales. Estos antihelmínticos se administran comúnmente en la fase parenteral donde el parásito probablemente es poco sensible. Se ha reportado falla terapéutica y esto evidencia la necesidad de efectuar el diagnóstico temprano y de buscar nuevos fármacos más eficaces para el tratamiento de la trichinellosis. Sin embargo, aun cuando se ha observado falla terapéutica, no hay estudios sistemáticos en los que se analice el efecto del albendazol (ABZ) en la producción de anticuerpos (Acs) contra los antígenos del parásito. En un proyecto previo se encontró que el ABZ administrado en la fase migratoria no afectó el establecimiento del parásito pero sí su infectividad; los parásitos recuperados de las ratas tratadas con ABZ fueron 100 % viables pero aproximadamente el 1% de ellos se establecieron en el ratón en comparación con los testigos infectados con larvas recuperadas de ratas no tratadas o tratadas con el vehículo. Los resultados obtenidos permitieron tener un modelo de falla terapéutica. Por otra parte, la trichinellosis al ser una zoonosis, es difícil de erradicar por lo que una alternativa es la búsqueda de antígenos protectores que pueden ser empleados para controlar la transmisión de la infección con el parásito. Uno de los mecanismos de inmunidad protectora observado en el cerdo y roedores de laboratorio es el que ocurre a nivel intestinal; disminuye el tamaño de los parásitos adultos (AD), se afecta su fecundidad y posteriormente son expulsados. Sin embargo, aun no se identifican los antígenos blanco de dicha inmunidad, en el estadio adulto. El propósito de este estudio consistió en determinar en el modelo murino el efecto del ABZ, administrado en la fase migratoria, sobre la respuesta de Acs contra antígenos de la larva muscular (LM) ; extracto soluble total (EST), productos de excreción-secreción (PES) y PES destivelosados (PESd) para determinar el valor diagnóstio y pronóstico de estos ensayos serológicos. Además, se analizó la reactividad del anticuerpo policlonal contra el antígeno de 49 kda de la larva recién nacida (AcPo antiag49) hacia los PESd para determinar si el antígeno de 49 kda tiene relación antigénica con alguno de los componentes de los PESd de la LM. Dado que dicho anticuerpo se une a la proteína de ES de 49 kda de la larva recién nacida la cual es reconocida por ratas infectadas con el parásito en una etapa temprana de la infección, y muy débilmente, a por lo menos tres proteínas de ES de la larva muscular no tivelosadas, es posible que este componente sea un antígeno que se expresa durante la maduración de la larva. Asimismo, se analizó la producción de coproanticuerpos IgA contra el estadio AD mediante ELISA durante la infecciónn y se produjeron AcPo contra los antígenos del AD potencialmente protectores. Para ello se utilizaron ratas que se dividieron en grupos. Se infectaron con 2000 LM de T. spiralis. Un grupo no recibió tratamiento (A), otro fue tratado con el vehículo (B) o con ABZ (C). Se administró una dosis de 20 mg/kg/día de albendazol en los días 13, 14 y 15 postinfección (fase de encapsulamiento temprano) y se colectaron muestras de suero a diferentes tiempos postinfección para analizarlas por ELISA con los antígenos de LM. De otro grupo A se colectaron muestras de heces a diferentes tiempos postinfección, se obtuvo el sobrenadante de heces que se analizó por ELISA con antígeno de AD. Al final de la colección de muestras de heces, se recuperaron las LM el diá 45 postinfección para evaluar la carga parasitaria en diafragma. Se obtuvieron las proteínas de AD reconocidos predominantemente por ratas y humanos infectados con el parásito y se utilizaron para inmunizar ratas. Después de completar el esquema de inmunización se colectaron los sueros y se analizaron por ELISA con antígeno soluble de AD. Los EST de la LRN, AD y LM mostraron un perfil de proteínas complejo con un peso molecular de a más de 200 kda, mientras que los PES de la LM, obtenidos de 18 a 24 h después del cultivo contuvieron aproximadamente 13 componentes dentro de un intervalo de 14 a kda. De todos estos componentes los más abundantes fueron 5 con un peso molecular de a 90 kda los cuáles además comparten tivelosa. Como resultado de la desglicosilación, del patrón característico de las 5 proteínas de ES más abundantes, se obtuvo un doblete de aproximadamente kda. También se observaron otras proteínas menos abundantes en un intervalo de a 76 kda después de la desglicosilación. Este conjunto de proteínas conformó a los PES destivelosados. En los grupos A, B y C, en comparación con el D, no hubo producción de Acs contra el EST en los primeros 7 días de la infección. A partir del día 10 posinfección, empezó la producción de Acs, se incrementó hasta alcanzar un pico discreto el día 14 y el nivel máximo el día 28 postinfección para luego permanecer estable hasta el final del estudio (p<0.05). Se observó que no hubo producción de Acs contra los PES en los tres grupos A, B y C, en los primeros 12 días postinfección. A partir del día 14 posinfección, empezó la producción de Acs en los grupos A y B; mientras que en el grupo C comenzó el día 26 postinfección, posteriormente, se incrementó hasta alcanzar un máximo el día 61 postinfección (p<0.005). Por otra parte al comparar el efecto del ABZ en la producción de Acs contra el EST en relación a la observada hacia los PES de la larva muscular se encontró que al utilizar el EST, transcurrió un intervalo de tiempo más corto (día 0 a 7 postinfección) para observar la seroconversión en los grupos A, B y C que con los PES (del día 0 al 12 en los grupos A y B, y del día 0 al 24, en el grupo C). Así mismo, se observó que la respuesta de Acs fue más elevada hacia el EST que contra los PES del día 10 al 21, en los grupos A y B, y del día 10 hasta el final del estudio, en los grupos C (p>0.005). La respuesta de Acs contra PESd en el grupo B (resultados similares que se obtuvieron con el grupo A, no son mostrados) comenzó a partir del dia 10, alcanzó un máximo el día 14 la cuál se mantuvo hasta el día 61 postinfección. Dicha respuesta de Acs fue afectada claramente por el tratamiento con ABZ pero más tempranamente que con PES. La cinética de producción de Acs IgA mostró un pico el día 3 después de la infección en las ratas infectadas con el parásito. Se obtuvieron Acs Po contra 5 proteínas de 78, 111, 119, 139 y 134 kda. El AcPo anti-ag 49 de la larva recién nacida se unió a una proteína de ES de aproximadamente 55 kda y a otras de mayor peso molecular débilmente. Después de la desglicosilación, la reactividad del AcPo anti Ag49 fue más intensa; se unió a dos proteínas de 53 y 55 kda, a tres en un intervalo de 116 a 170 kda y a dos más con un peso molecular por arriba de 220 kda. El AcPo anti-ag49 se unió al componente de 49 en el EST de la larva recién nacida de T. spiralis.

2 2. INTRODUCCION Las infecciones helmínticas representan al grupo más importante de las infecciones que afectan a la humanidad y animales de importancia económica en el planeta. En este sentido, uno de los parásitos helmintos más estudiados es el nemátodo Trichinella spiralis el cuál representa un modelo admirable para el estudio de las infecciones producidas por los nemátodos en general. Es importante señalar que en nuestro país, la trichinellosis es considerada un problema de salud pública. Asimismo, esta infección tiene una amplia distribución mundial y puede ser transmitida al humano por animales domésticos y una gran variedad de animales silvestres. Un requisito indispensable ha sido el estudio de la interacción huésped-parásito para poder entender las bases moleculares de la misma a diferentes niveles; la caracterización de la respuesta de anticuerpos (Acs) y de componentes de estos organismos metazoarios relevantes en la biología del parásito para identificar antígenos útiles. 1) en diagnóstico 2) en protección, 3) esenciales en la sobrevivencia del parásito, y 4) estudios epidemiológicos. En este contexto, en proyectos previos se ha estudiado la respuesta inmune humoral en dos tipos de huéspedes. En el humano el análisis de la respuesta de anticuerpos inducida por el parásito en el transcurso de la infección y la caracterización de antígenos (Ags) de T. spiralis, han permitido la identificación de Ags específicos con valor potencial en diagnóstico en la fase aguda y crónica. Un análisis similar en el modelo murino reveló similitudes en el valor diagnóstico de los antígenos de la larva muscular (LM) y del adulto (AD) y algunas diferencias principalmente cuando se utilizan los Ags somáticos de la LRN; se observó el reconocimiento de dos componentes de peso molecular (PM) alto del día 10 al 19 post infección, y de uno de bajo PM (49 kda) del día 10 al 31 después de la infección de manera prominente. El PM de este último es similar al de uno que forma parte de las proteínas tivelosadas de excreción-secreción (ES) de la LM. Estas últimas se encuentran en el citoplasma y núcleo de la célula nodriza, razón por la cual se cree induce la formación y mantenimiento del complejo célula nodriza-lm. A este respecto, se ha reportado mediante análisis de transcripción, una familia de genes homólogos a la DNasa II distintos, detectados en la LRN y la LM y no en el AD, que son regulados diferencialmente durante el desarrollo del parásito. Estos genes corresponden a isoformas de p, proteina secretada por la LM e involucrada en los cambios de la célula muscular, lo cual puede ser relevante inmunológicamente. Sin embargo, los determinantes antigénicos del componente de 49 kda de la LRN (Ag49) no se localizan en la superficie de la LRN o LM, se expresa muy débilmente en tres componentes de ES de la LM no tivelosados, y no está en las proteínas del extracto total de LM. Asimismo, la producción de Acs contra este componente se abate transitoriamente en las ratas infectadas y tratadas con albendazol (ABZ) en la fase migratoria (motivo por el cual los pacientes con trichinellosis tratados con ABZ posiblemente no lo reconocen) que sugieren que Ag49 es una molécula de ES. Se ha reportado que los productos de ES de la LM y LRN, no así los del AD, producen alteraciones estructurales y morfológicas de células musculares in vitro e in vivo relacionados con los eventos de la transformación de la fibra muscular a célula nodriza. Sin embargo, hasta ahora no se han identificado los componentes de la LRN que presumiblemente están involucrados en dichos eventos. Tampoco se sabe si los productos de ES de la LRN contienen enzimas que le permiten a la LRN penetrar a la fibra muscular. Los efectos del ABZ sobre los preadultos intestinales son la desaparición selectiva de los microtúbulos citoplasmáticos de las células tegumentarias e intestinales alterando la secreción de sustancias del aparato de Golgi, por ejemplo de acetilcolinesterasa, se altera el consumo de glucosa y el agotamiento del glucagón, produciéndoles inmovilización y muerte. De la dosis de ABZ administrada, sólo un 5 % del ABZ se absorbe a través de la mucosa gastrointestinal y la concentración en plasma que alcanza su principal metabolito es muy baja (a la dosis de 6.6 mg/kg de ABZ, el sulfóxido de ABZ, alcanza un máximo de 0.25 a 0. µg/ml después de aproximadamente 2 1/2 horas). Por esto, el ABZ es eficaz para el tratamiento de parasitosis intestinales. No se sabe la sensibilidad de la LRN circulante y de la que está madurando en la célula muscular al ABZ (lo cuál estaría relacionado con la accesibilidad del sulfóxido de ABZ al interior de la célula nodriza-lm), ni cómo afecta la producción de anticuerpos contra los antígenos parasitarios. Asimismo, se ha reportado falla terapéutica en el tratamiento de la trichinellosis humana con derivados de benzimidazol, y resultados controvertidos en el tratamiento de la trichinellosis experimental. En este sentido, resultados del proyecto anterior permitieron demostrar que la viabilidad de las LM recuperadas de las ratas tratadas con el ABZ no se afecta pero sí su infectividad. Datos adicionales obtenidos en el modelo murino, demuestran el reconocimiento temprano de un componente de 45 kda de la LM a partir del día 10 pi, por lo que es necesario: demostrar si Ag49 está relacionada antigénicamente con la parte proteica de los Ags tivelosados (TSL-1 destivelosados), así como determinar la producción de Acs (temprana o tardía) que se induce en el huésped contra las proteínas destivelosadas. Esto puede ser relevante en diagnóstico debido a que los Ags TSL-1 inducen una respuesta de Acs importante, pero la detección de los anticuerpos anti-tivelosa permite el diagnóstico tardío. Por otra parte, los Ags del AD no contienen tivelosa y se ha propuesto que esto es resultado de la regulación, también diferencial, de la glicosilación durante el desarrollo del parásito; la glicosiltransferasas encargadas de la tivelosación no se expresan en el adulto, se sabe que este estadio es menos sensible al ABZ que el preadulto, y que la inmunidad a nivel intestinal, afecta al menos su fecundidad por lo que se obtendrán Acs policlonales contra los Ags del AD potencialmente protectores y se determinará si estos inducen la producción de anticuerpos IgA. Así, en este proyecto se analizará la inmunogenicidad de las proteínas destivelosas de la LM durante la infección en ratas infectadas con el parásito que han sido tratadas o no, con ABZ comparada con la del extracto soluble y los PES no destivelosados. En forma similar, se determinará si los Ags del AD potencialmente protectores inducen la producción de coproanticuerpos del isotipo IgA durante la infección y se obtendrán los Acs policlonales correspondientes. Además, se continuará la caracterización de Ag49, para esto, se estudiará la reactividad del Ac policlonal correspondiente hacia las proteínas destivelosadas de la LM. Los datos que se obtengan de este proyecto aportarán más información sobre la caracterización de antígenos y darán más soporte para determinar más adelante su papel en la biología del parásito.

3 3. METODOS Y MATERIALES 3.1. Obtención de parásitos Animales.- Se emplearon cepas derivadas de ratones NIH de 2-3 meses de edad, ya sea hembras o machos, para mantener el ciclo vital de Trichinella spiralis y ratas Wistar de 2-3 meses de edad para obtener las tres fases de desarrollo del parásito, así como para efectuar el estudio longitudinal de la respuesta de anticuerpos séricos y de coproanticuerpos IgA. Los animales se desparasitaron previamente utilizando mebendazol, praziquantel y metronidazol durante 7 días y se albergaron en cajas de plástico con aserrín esterilizado a 120 C durante 15 min en autoclave. Se les proporcionó alimento comercial para ratas y ratones esterilizado con calor seco a 150 C durante minutos y agua acidificada y suplementada con vitaminas. La presencia de huevecillos, quistes o nemátodos (larvas o adultos) se analizó periódicamente mediante la técnica de flotación con ZnS04 (Faust y col. 1939) o de Baerman, muestreando los animales al azar antes y después del tratamiento Obtención de LM de T spiralis.- La recuperación de LM se hizo de acuerdo a los métodos descritos por Durham y col.59. Se sacrificaron ratones o ratas con días de infección por dislocación cervical, subsecuentemente se obtuvo el músculo esquélético el cuál se procesó en una picadora Moulinex. El tejido muscular cortado finamente se agregó a una solución de pepsina 1%-ácido clorhídrico 1% para digerirlo. La solución de digestión se tamizó sobre un embudo conectado a un tubo de ensayo (aparato de Baerman). Las larvas se colectaron del fondo del tubo por sedimentación espontánea. El procedimiento es aplicable, según sea el caso, en la preparación de una suspensión de larvas infectivas, previamente lavadas con PBS, para determinar viabilidad, para cuantificar el número de LM/mL, para infectar por vía intragástrica a ratas que sirvan para el mantenimiento del ciclo vital del parásito, para la infección experimental de ratas o para preparar EST Obtención de parásitos adultos (AD).- Los parásitos AD se obtuvieron de acuerdo a la técnica descrita por Dennis y col.60. Se extrajo el intestino de las ratas Wistar infectadas con T. spiralis. El intestino cortado en trozos se depositó en un aparato de Baermman provisto de gasa y PBS. Después de un período de incubación de 3 horas a 37 C, los parásitos AD se recuperaron del fondo del tubo. El procedimiento es aplicable según sea el caso, para preparar una suspensión de los parásitos AD para determinar viabilidad, cuantificar número de AD/rata o preparar EST Obtención de larvas recién nacidas (LRN) de T. spiralis.- Las LRN se obtuvieron de acuerdo a la técnica descrita por Dennis y col.60. Los parásitos AD recuperados de ratas Wistar infectadas con el parásito 6 días antes, se lavaron exhaustivamente con PBS estéril suplementado con antibióticos (2 g/ml de estreptomicina, 200 U/mL de penicilina y 2 µg/ml de fungizona). Finalmente, los parásitos AD se incubaron bajo las condiciones descritas por Stewart y col.61, esto es, en medio RPMI 1640 estéril adicionado de los mismos antibióticos y suero fetal de ternera al 10% v/v (Hyclone Laboratories, USA) descomplementado, en atmósfera de 6% de CO2 y a 37 C durante 18 horas. Las LRN depuestas por las hembras durante este período de incubación, se separaron de los AD y concentraron por centrifugación diferencial a baja velocidad Obtención de extracto soluble total (EST) de LM, AD y LRN.- El EST se obtuvo de acuerdo al método descrito por Philipp y col.12. Las LM y LRN se resuspendieron en un regulador Tris-HCl 10 mm ph 8.13 con inhibidores de proteasas (TPCK 50 µg/ml, TLCK 25 µg/ml y PMSF 174 µg/ml). Las LM o parásitos AD obtenidos 3 días después de la infección, se homogenizaron en frío en un homogenizador de tejidos. Posteriormente, se agregó desoxicolato de sodio a una concentración final del 2% y se continuó con la homogenización. Las LRN se sometieron a ondas de ultrasonido (12 micrones) emitidas por un sonicador eléctrico en ciclos alternantes de un minuto de sonicación y un minuto de descanso en un baño de hielo, este proceso se repitió dos veces. Posteriormente, para solubilizar proteínas se añadió desoxicolato de sodio hasta una concentración final del 2% y se prosiguió el proceso de sonicación un minuto más. Por último, los lisados se centrifugaron a rpm durante minutos a 4 C en una centrífuga Eppendorf Se separó el sobrenadante, el cual se utilizó como antígeno después de determinar la concentración de proteínas mediante el método de Lowry (1951) modificado por Dulley y Grieve (1975). Los antígenos se almacenaron -20 C hasta su uso Obtención de productos de excreción-secreción de la LM.- Los productos de excreción-secreción se obtuvieron de acuerdo al método descrito por Gamble y col. (1985). Las LM obtenidas se lavaron con PBS estéril y se incubaron en RPMI incompleto adicionado de antibioticos (penicilina-estreptomicina-fungizona) durante h a 37 º C en atmósfera de CO2. Al término del período de incubación, se colectó el sobrenadante de cultivo, se centrifugó, filtró, dializó y concentró por liofilización. Se le determinó la concentración de proteína y se almacenó a -20 ºC hasta su uso Obtención de productos de excreción-secreción de la LM destivelosados.- Los productos de ES obtenidos se destivelosaron de acuerdo al protocolo descrito por Edge y col y modificado por Denkers y col. (1990). Se utilizaron 1 ug de proteínas de ES liofilizadas. Se hicieron reaccionar con ácido trifluorometansulónico/anisol (150 ul, 2:1 v/v) bajo atmòsfera de gas nitrógeno en tubos de borosilicato durante minutos a 0º C con agitación ocasional. La mezcla de reacción fue neutralizada con 2 ml de piridina acuosa al 60 % y dializada contra PBS. El precipitado de las proteínas desglicosiladas, se recuperó por centrifugación a 400 x g, se solubilizó con DMSO (SIGMA) al 12.5 %. Las proteínas con o sin carbohidratos se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% Obtención de sobrenadante de heces de ratas infectadas experimentalmente con T. spiralis.- Ratas Wistar se infectaron por vía intragástrica con 2000 LM y las muestras de heces se colectaron individualmente en los días 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 postinfección. La materia fecal se mezcló (1:10) en PBS, se dejó reposar durante 15 minutos y se centrifugó a rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se separó y almacenó a -20º C hasta su uso para la determinación de los coproanticuerpos por ELISA. Las ratas se sacrificaron y se obtuvo el diafragma para evaluar la carga parasitaria Inmunoensayo enzimático ELISA.- El análisis de la reactividad de los anticuerpos primarios (coproanticuerpos IgA de rata) hacia los antígenos somáticos del adulto de T. spiralis se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito por Mendez-Loredo (1999)45, ELISA-I para la detección de coproanticuerpos IgA de rata.- Para analizar la reactividad de los coproanticuerpos totales, el ELISA se realizó utilizando como fase sólida, placas de

4 poliestireno de 96 pozos (COSTAR), un volumen de 100 µl para cualquiera de los reactivos empleados en el ensayo, la concentración de 10 ug/ml del EST de AD, el sobrenadante de heces de rata sin diluir y la dilución óptima de Ac monoclonal de ratón anti-iga de rata conjugado a biotina y 2.5 mu del complejo avidina-peroxidasa biotinilada. La reacción antígeno anticuerpo se reveló utilizando peróxido de hidrógeno/o-fenilendiamina en regulador de citratos fosfatos ph5. Se determinó la absorbencia a 492 nm en un fotocolorímetro automático Inmunoelectrotransferencia.- La inmunoelectrotransferencia se realizó de acuerdo al método descrito por Towbin y col. (1989)75. a) Las proteínas del estadio adulto de T. spiralis se separaron electroforéticamente bajo condiciones reductoras, se transfirieron a una membrana y posteriormente se hicieron reaccionar con una mezcla de sueros humanos o de rata infectados con el parásito para identificar las proteínas del adulto potencialmente protectoras. La reacción antígeno-anticuerpo se puso de manifiesto utilizando opti4cn hasta la aparición de bandas de color morado. Las proteínas se ubicaron en el resto de la membrana. Se cortó cada banda y se guardaron a temperatura ambiente hasta su uso Obtención de anticuerpos policlonales contra las proteínas del adulto de T. spiralis potencialmente protectoras. Las proteínas del adulto unidas a la membrana se disolvieron en DMSO, se mezclaron con adyuvante de Freund y se administraron por vía subcutánea dos veces. Al término del protocolo de inmunización las ratas se sangraron en blanco, se obtuvo el suero y se almacenó a -20 º C hasta su uso. Los sueros se diluyeron 1:3200 y se analizaron por ELISA con antígeno de adulto y un conjugado enzima-igg de chivo anti-inmunoglobulinas totales de rata Efecto in vivo del albendazol administrado en la fase migratoria sobre la producción de anticuerpo contra antígenos de la LM de T. spiralis.- Se formaron 3 grupos de 6 ratas cada uno. Las ratas de los grupos A (ratas infectadas sin tratamiento), B (ratas infectadas tratadas con vehículo), C (ratas infectadas tratadas con albendazol) se infectaron con 2000 LM. El grupo B recibió carboximetilcelulosa al 1 %o y el grupo C 20 mg/kg de ABZ por peso corporal vía intragástrica. La dosis se administró en una sola ocasión los días 13, 14, 15 (fase migratoria o de encapsulamiento temprano) después de la infección. Se colectaron los sueros a diferentes tiempos postinfección y se analizaron por ELISA con extracto soluble total, PES, PESd utilizando un conjugado enzima-igg de chivo anti-inmunoglobulinas totales de rata. 3.8 Análisis de resultados. Se utilizó la prueba de ANOVA para medidas repetidas para analizar la respuesta de anticuerpos durante la infección (expresados en valores de DO obtenidos del ensayo de ELISA), ANOVA unifactorial para analizar la respuesta de anticuerpos en un tiempo determinado de la infección. Para hacer la comparación de las medias de todos los grupos se empleó el método de comparación múltiple de Kneuman-Student-Keuls. Para identificar los antígenos del AD potencialmente protectores se ilustra en las fotografías las proteínas contra las cuales están dirigidos los anticuerpos de rata y humano. 4. RESULTADOS 4.1 Obténción de parásitos, extractos totales, PES y PES destivelosados de LM (meta 1, 20 %) Los extractos solubles totales de la LRN, AD (obtenido 3 días después de la infección) y LM (figura 1A) mostraron un perfil de proteínas complejo con un peso molecular de a más de 200 kda, mientras que los productos de ES de la LM (figura 1B), obtenidos de 18 a 24 h después del cultivo de la LM, contuvieron aproximadamente 13 componentes dentro de un intervalo de 14 a kda. De todos estos componentes los más abundantes fueron 5 con un peso molecular de a 90 kda los cuáles además comparten tivelosa. La calidad de los productos de ES fue variable dependiendo del tiempo de incubación de los parásitos. Se observó cierta degradación de los componentes de ES cuando el tiempo de cultivo fue de más de 24 h (datos no mostrados) (figura 1). Como resultado de la desglicosilación, del patrón característico de las 5 proteínas de ES más abundantes, se obtuvo un doblete de aproximadamente kda. También se observaron otras proteínas menos abundantes en un intervalo de a 76 kda después de la desglicosilación. Este conjunto de proteínas conformó a los PES destivelosados (figura 1C). 4.2 Análisis de la Inmunogenicidad de las proteinas destivelosadas (meta 2, 25 %) Se analizó el efecto del albendazol en la producción de anticuerpos contra el extracto soluble total de la larva muscular. En el grupo D (ningún tratamiento) se encontraron valores de DO cercanos a cero por lo que en dicho grupo no se detectó la producción de anticuerpos contra extracto soluble total de la larva muscular durante todo el estudio. En los grupos A (infectado con el parásito), B (infectado con el parásito y que recibieron el vehículo carboximetilcelulosa) y C (infectado con el parásito y tratado con albendazol en carboximeticelulosa), en comparación con el D, no hubo producción de anticuerpos en los primeros 7 días de la infección. A partir del día 10 posinfección, empezó la producción de anticuerpos, se incrementó hasta alcanzar un pico discreto el día 14 y el nivel máximo el día 28 postinfección para luego permanecer estable hasta el final del estudio (figura 2) (p<0.05). También se analizó el efecto del albendazol en la producción de anticuerpos contra los productos de excreción y secreción de la larva muscular por ELISA. Se observó que no hubo producción de anticuerpos en los tres grupos A, B y C, en los primeros 12 días postinfección. A partir del día 14 posinfección, empezó la producción de anticuerpos en los grupos A y B; mientras que en el grupo C comenzó el día 26 postinfección, posteriormente, se incrementó hasta alcanzar un máximo el día 61 postinfección (figura 2). (p<0.005). Por otra parte al comparar el efecto del albendazol en la producción de anticuerpos contra el antígeno soluble total en relación a la observada hacia los productos de excreción-secreción de la larva muscular se encontró que al utilizar el antígeno soluble total, transcurrió un intervalo de tiempo más corto (día 0 a 7 postinfección) para observar la seroconversión en los grupos A, B y C que con los productos de excreción-secreción (del día 0 al 12 en los grupos A y B, y del día 0 al 24, en el grupo C). Así mismo, se observó que la respuesta de anticuerpos fue más elevada hacia el extracto soluble total que contra los productos de excreciónsecreción del día 10 al 21, en los grupos A y B, y del día 10 hasta el final del estudio, en los grupos C (p>0.005) (figura 2).

5 Con repecto al efecto del albendazol en la producción de anticuerpos contra los PESd se observó que la respuesta de anticuerpos en el grupo B (resultados similares que se obtuvieron con el grupo A, no son mostrados) comenzó a partir del dia 10, alcanzó un máximo el día 14 la cual se mantuvo hasta el día 61 postinfección. Dicha respuesta de anticuerpos fue afectada claramente por el tratamiento con albendazol. Los antígenos destivelosados del adulto de T. spiralis indujeron la producción de anticuerpos IgA en el intestino de las ratas infectadas con el parásito (figura 3A). La cinética de producción de anticuerpos mostró un pico el día 3 después de la infección. Las ratas infectadas con 200 larvas musculares presentaron una carga parasitaria en el músculo esquelético de 6000 larvas/g de diafragma (figura 3B). 4.4 Obtención de anticuerpos policlonales contra proteínas del adulto potencialmente protectoras (meta 4, 15 %) Se utilizaron diez proteínas del estadio adulto (inmunogénicas en el humano y la rata) con un peso molecular dentro de un intervalo de 78 a 229 kda, como se indica en la figura 4A para inmunizar ratas. Se obtuvieron anticuerpos policlonales contra 5 proteínas de 78, 111, 119, 139 y 134 kda (figura 4B) mientras que no hubo producción de anticuerpos contra las proteínas restantes cuyo peso molecular fue de 99, 149, 169, 219 y 229 kda (figura 4B). 4.5 Estadio especificidad de Ag 49 (meta 5, 10 %) El AcPo anti-ag 49 de la larva recién nacida se unió claramente a una proteína de ES de aproximadamente 55 kda y a otras de mayor peso molecular débilmente. Después de la desglicosilación, la reactividad del AcPo anti Ag49 fue más intensa; se unió a dos proteínas de 53 y 55 kda, a tres en un intervalo de 116 a 170 kda y a dos más con un peso molecular por arriba de 220 kda. El AcPo anti-ag49 se unió al componente de 49 en el extracto soluble total de la larva recién nacida de T. spiralis. 4.6 Análisis de los resultados (meta 6, 5 %). La mayor parte de las pruebas serológicas que utilizan antígeno de ES de la larva muscular resultan positivas hasta la quinta semana de infección y permanecen positivas hasta después de un año de que han desaparecido los síntomas por lo que son más apropiados para el diagnóstico en la fase parenteral (diagnóstico confirmativo) y para monitorear casos establecidos de trichinellosis, como por ejemplo, para verificar la eficacia del tratamiento con antihelmínticos. Varios estudios sugieren que cuando, la producción de anticuerpos contra la larva muscular permanece elevada varios años después de la infección con el parásito es porque el tratamiento antihelmíntico fue ineficaz. Asimismo, este tipo de ensayos no es útil para el diagnóstico temprano lo cual es importante para prevenir la patología que pone en riesgo la vida del paciente. A este respecto la detección de IgA humana contra antígeno soluble total de larva recién nacida permite la detección del 85% de los pacientes en la 3a. semana de la infección (resultados obtenidos en proyectos previos) y de acuerdo a la Comisión Internacional de Trichinellosis este método ofrece potencial para efectuar el diagnóstico temprano. Los resultados obtenidos en este proyecto muestran que la respuesta de anticuerpos del huésped hacia los antígenos del parásito es compleja pero necesaria de caracterizar para determinar el valor diagnóstico y pronóstico de los ensayos inmunológicos; el extracto soluble contiene antígenos que despiertan una respuesta temprana y tardía de anticuerpos. Los PES inducen una respuesta de anticuerpos tardía, y una vez desglicosilados, se puede evidenciar una respuesta temprana de anticuerpos. Tambien sugieren que los epitopos del antígeno de 49 kda de la larva recién nacida, los cuales son reconocidos en una etapa temprana de la infección por la rata, también se encuentran en las proteínas desglicosiladas de la larva muscular pero no se unen a la parte proteica de los antígenos TSL-1 (componentes tivelosados) por lo que es posible que estos epìtopos se presentan en una etapa temprana de la maduración de la larva. Asimismo, dichos epitopos (proteicos) son excretados-secretados por la larva recién nacida y posteriormente, también son excretadas-secretadas, como moléculas glicosiladas, por la larva muscular. Por lo tanto, los epitopos del componente de 49 kda de la larva recién nacida y presesntes en los PESd de la larva muscular son potencialmente útiles para el diagnóstico temprano de la trichinellosis. Por otra, parte el pico de respuesta de IgA observado el día 3 postinfección muestra que los componentes del adulto que la generan pueden ser antígenos potencialmente protectores. Impacto En desarrollo tecnólogico, porque se puede implentar un método serológico para el diagnóstico temprano de la trichinellosis humana. Así mismo, los datos reportados en este proyecto en lo que se refiere a la respuesta humoral que genera el parásito adulto en el huésped puede ser útil para identificar antígenos protectores. La información obtenida en este trabajo permitrá entender más la inmunobiología de Trichinella spiralis.

6 kda MPM LRN LM AD ES de LM ES de LM-Tiv MPM ES de LM-dTiv MPM kda A B C Figura 1. Obtención de antígenos de T. spiralis.- Se obtuvieron los parásitos según se describe en la metodología. Se prepararon los extractos solubles totales de los tres estadios del parásito; larva recién nacida (LRN), larva muscular (LM) y adulto (AD) y los productos de excreción-secreción (ES) de la LM det. spiralis (A), los cuales se sometieron a electroforesis bajo condiciones reductoras en geles de poliacrilamida al 7 %. Los productos de ES de la LM se liofilizaron y una parte se reconstituyó en PBS (ES de LM-Tiv) y otra parte se hizo reaccionar con TFMS para destivelosar las proteínas (ES de LM-dTiv). Los productos de ES de LM-Tiv (B) y de ES de LM-dTiv (C) se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10 % en condiciones reductoras. MPM: marcadores de peso molecular conocido.

7 A B C D (T. spiralis) (T. spiralis + vehículo) (T. spiralis + ABZ) (no infectadas, no tratadas) DO (492 nm ) 4 3 EST PES PESd 3 ES ----ESd TIEMPO POSTINFECCION Figura 2. Efecto del albendazol en la respuesta de anticuerpos hacia antígenos de T. spiralis.- Se analizó la respuesta de anticuer pos en ratas infectadas con el parásito no tratadas (A) o tratadas con el vehículo (B) o con ABZ (C) por ELISA utilizando extracto Soluble total (EST), productos de excreción-secreción (PES) o excreción-secreción destivelosados (PESd) de la larva muscular a dife Rentes tiempos después de la infección.

8 A B 1.00 RATA MEDIA Y ERROR ESTANDAR DO (492 nm) No. DE LM/g DE DIAFRAGMA DIAS POSTINFECCION RATA Figura 3.- Respuesta de coproanticuerpos IgA hacia antígenos del adulto de T. spiralis durante la infección.- Se analizó la res puesta de anticuerpos IgA en sobrenadandes de heces a diferentes tiempos después de la infección en seis ratas infectadas con el parásito (A). El día 31 postinfección, las ratas se sacrificaron y el músculo esquelético se digirió artificialmente para recuperar las larvas musculares (B)

9 A B kda 212 PT R H 229 kda 219 kda 1 kda 4 1 kd 119 kd 78 kda 139 kd 110 kd 229 kd 219 kd 169 kd 149 kd 99 kda kda 149 kda 135 kda 119 kda 110 kda 99 kda 78 kda DO (492nm) AcPo+ suero preinmune AcPo- Figura 4. Producción de anticuerpos policlonales contra proteínas del adulto de T. spiralis potencialmente protectoras.- (A) Las proteínas del antígeno soluble total de adulto (PT) se separaron por electroforesis bajo condiciones reductores en un gel de acrilamida al 7 %, se transfirieron a una membrana y se hicieron reaccionar con una mezcla de sueros de ratas en el día 21 (R), y de humanos (H), en la 5ª semana postinfección. Las proteínas reconocidas por ambos tipos de huéspedes se ubicaron en el resto de la membrana, se cortaron y se utilizaron para inmunizar ratas como se indica en Métodos Experimentales.Los marcadores de peso molecular se indican a la izquierda de la figura. (B) Los sueros colectados de las ratas inmunizadas con cada una de las 10 proteínas seleccionadas se analizaron por ELISA con antígeno de adulto

10 A B C kda PES PESd kda PES PESd NBL ML AD ES/ML Figura 5. Reactividad del AcPo anti Ag49 de la larva recién nacida hacia los productos de excreción-secreción destivelosados de la larva muscular de T. spiralis.- Los antígenos de excreción-secreción no destivelosados (PES) y destivelosados (PESd) de la larva muscular se separaron por electroforesis bajo condiciones reductores en geles de poliacrilamida al 7 %. PES y PESd se tiñeron con azul Coomasie (A) y se hicieron reaccionar con el AcPo antiag49 diluído 1:3200 (B). En (C) se muestra la reactividad del AcPo anti-ag49 diluído 1:12800 hacia el extracto soluble total de larva muscular (ML) del adulto (AD) y de excreción-secreción de larva muscular (ES/ML)