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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : C07K 7/06 A61K 38/04 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Ligando peptídico del receptor de la trombina resistente a peptidasas. k Prioridad: US k 73 Titular/es: The Research Foundation of State University of New York P.O. Box 9 Albany, New York , US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Coller, Barry S. y Prestwich, Glenn D. k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Capitán García, Nuria ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Esta invención se hizo con financiación del Gobierno bajo el número de concesión HL19278, adjudicada por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención. Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención La invención se refiere a la sustitución de un aminoácido del extremo N en un ligando peptídico del receptor de la trombina en las plaquetas, con lo que se confiere resistencia a la ruptura enzimática del ligando y, así, se evita la inactivación de la actividad de agregación plaquetaria mediada por el ligando. 2. Descripción de la técnica relacionada La hemostasia es un proceso complejo que implica la coagulación de la sangre, que sigue una ruta extrínseca o una ruta intrínseca. En ambas rutas, las etapas finales implican la formación de la enzima trombina que cataliza la conversión del fibrinógeno, una proteína plasmática, a fibrina insoluble. En la ruta intrínseca, las plaquetas se adhieren a un vaso sanguíneo roto y empiezan a agruparse. A continuación, sirven para acelerar la generación de la enzima trombina que hace que la sangre se coagule. La trombina también hace que se agrupen más plaquetas y facilita la generación de aun más trombina. In vitro, la trombina es un potente agonista de plaquetas. Produce el cambio de forma de las plaquetas, su agregación y la liberación de los contenidos de los gránulos. La importancia de la trombina ha estimulado la investigación de los mecanismos mediante los cuales ésta activa las plaquetas. Un receptor de la trombina funcional ha sido identificado en la membrana superficial de las plaquetas por Vu et al., Cell 64, 7-68 (1991). La ruptura con trombina del receptor produce un ligando peptídico enlazado a través del nuevo extremo amino (SFLLRNDKYEPF, T-14) en la superficie de la plaqueta. El ligando peptídico es capaz de agregar directamente plaquetas filtradas en gel. Por lo tanto, la trombina induce la activación de las plaquetas, al menos en parte, mediante la ruptura del receptor situado en las plaquetas, lo que permite que el nuevo extremo amino funcione como un ligando enlazado que interacciona con otra región del receptor para inducir la señal (señales) de activación. Estudios posteriores han demostrado que los ligandos peptídicos que sólo contienen los primeros cinco oseisaminoácidos del T-14, también son activos. (Vassallo et al., J. Biol. Chem., 267, 81-8 (1992); Hui et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, (1992); Sabo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun,. 188, 4-6 (1992); Scarborough et al., J. Biol, Chem., 267, (1992). La mayoría de los grupos hallaron que el 6-mero es más activo que el 14-mero. La importancia de una carga positiva en la serina del extremo N fue sugerida a partir de estudios realizados por los autores de esta invención, Coller et al., Biochem., 31, (1992), y por otros. Coller et al., y otros, también mostraron que la acetilación del extremo amino conduce a la pérdida de la actividad peptídica, e identificaron una correlación entre la actividad peptídica y la carga positiva en la serina del extremo N. Coller et al., Id., y otros (Vassallo et al., J. Biol. Chem., 267, 81-8 (1992); Scarborough et al., J. Biol. Chem., 267, (1992)) mostraron que la omisión de la serina del extremo N del ligando conduce a la pérdida de actividad. Sin embargo, el grupo hidroxilo de la serina del extremo N no es crucial para la actividad, puesto que los péptidos en los que la alanina sustituye a la serina retienen una actividad sustancial, como han mostrado Sabo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 188, 4-6 (1992); y Chao et al., Biochem, 31, (1992). Por último, Coller et al., Biochem., 31, (1992) demostraron que la aminopeptidasa M, que se da de forma natural en el plasma y el suero, y sobre las células endoteliales, rompe rápidamente la serina del extremo N de los ligandos peptídicos, lo que conduce a la pérdida de su capacidad para activar los receptores de trombina. A concentraciones micromolares del péptido, la ruptura es suficientemente rápida en el plasma rico en plaquetas (PRP), como para afectar la respuesta de agregación plaquetaria. Incluso a concentraciones milimolares, la incubación a 37 C con plasma al 0%, conduce a un grado significativo de ruptura de la serina del extremo N por la aminopeptidasa M, y a la pérdida de actividad de agregación plaquetaria. La aminopeptidasa M es la principal enzima responsable de la capacidad del plasma para romper los 2

3 1 2 aminoácidos neutros/básicos del extremo N de péptidos de bajo peso molecular (Ward et al., Biochem. Pharmacol.,, (1990); Ahmad y Ward, J. Pharmacol. Exp. Ther., 22, 643- (1990). Se sabe que las células endoteliales, las células de la musculatura lisa, los leucocitos, los monocitos y otras células, contienen aminopeptidasa M (Look et al., J. Clin. Invest., 83, (1989); Palmieri et al., Biochem. Pharm., 38, (1989); Semenza, Rev. Cell. Biol., 2, (1986)). La rápida degradación e inactivación del ligando peptídico en presencia de plasma y suero hace difícil evaluar de forma precisa las relaciones dosis-respuesta. Además, una evaluación del proceso de ruptura con aminopeptidasas y de desactivación hace surgir la posibilidad de que alguno de los efectos observados de los péptidos hayan resultado de sólo una breve activación del receptor, puesto que la disociación del péptido del receptor puede tener lugar rápidamente al ir disminuyendo la concentración de péptido intacto en la fase líquida. Aunque la aminopeptidasa M puede ser inhibida por compuestos tales como la amastatina, lo que conduce a respuestas aumentadas de agregación plaquetaría de PRP a ligando peptídico (Coller et al, Biochem. 31, (1992)), la amastatina y otros inhibidores de la aminopeptidasa M pueden tener efectos desconocidos sobre las proteínas del plasma o las células. La acetilación del extremo N es el método tradicional para producir un péptido que resista la ruptura por aminopeptidasa M, pero la acetilación de este ligando elimina la actividad como activador del receptor. La Solicitud de Patente Internacional PCT WO-A describe agonistas de trombina que tienen un aminoácido modificado en el extremo N. No obstante, esta referencia no sugiere a la isoserina, el 2,3-diaminopropanoato o el 2,3-dihidroxipropanoato como el resto del extremo N. De acuerdo con ello, un objetivo de la invención es proporcionar un medio para prevenir la inactivación del ligando peptídico del receptor de la trombina. Otro objetivo de la invención es proporcionar un ligando peptídico del receptor de la trombina que conserve una actividad funcional sustancial, pero que sea resistente a la ruptura mediante la aminopeptidasa M. Otro objetivo adicional es proporcionar un péptido que no se da de forma natural,que active la agregación plaquetaria. 3 Resumen de la invención La invención proporciona un método para inhibir la acción enzimática de la aminopeptidasa M sobre un resto peptídico, permitiendo así que el péptido retenga la actividad para la agregación plaquetaria. 4 0 El péptido de la invención incluye una isoserina u otro resto que sustituye al resto de serina de tipo salvaje en el extremo N. Por tanto, se proporciona un péptido de fórmula I como sigue: en la que: R 1 -R 2 -R 3 -R 4 -R -Z Fórmula I R 1 es isoserina, 2,3-diaminopropanoato, 2,3-dihidroxi-propanoato, o derivados de los mismos que tienen sustituyentes nucleófilos R 2 es un aminoácido hidrófobo que tienen un grupo aromático o cíclico R 3 es un aminoácido hidrófobo R 4 es un aminoácido hidrófobo R es un aminoácido Z es carboxilo, carboxamida, al menos un aminoácido o un grupo que aumenta la solubilidad o la capacidad de penetración celular de la fórmula I. Los péptidos preferidos de fórmula I son (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-nh 2 Arg-Asn-NH 2.Elmás preferido es el 6-mero. o (iso-ser)-phe-leu-leu- 3

4 Un método para resistir la inactivación, por aminopeptidasa M, del péptido de activación del receptor de la trombina, comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto polipeptídico que tenga la fórmula I. Las realizaciones preferidas del método utilizan la fórmula I, que tiene las secuencias (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-nh 2 o (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn-nh 2.Elmás preferido es el 6-mero Descripción breve de las figuras La Figura 1 es una comparación gráfica de la dosis respuesta de agregación plaquetaria inducida por T-11, (DS)T-11, SFLLRN e (iso-s)fllrn; La Figura 2 es una comparación gráfica del efecto de la incubación de SFLLRN e (iso-s)fllrn en plasma, durante diversos periodos de tiempo, sobre la capacidad de los péptidos para inducir plaquetas y agregación; La Figura 3 es una comparación de los tiempos de elución en HPLC de SFLLRN e (iso-s)fllrn, durante la incubación con plasma; La Figura 4 es una representación del sitio del receptor de trombina, antes y después de la ruptura y después del cambio conformacional. Descripción detallada de la invención Los péptidos de la invención se caracterizan por la capacidad de resistir la degradación mediante aminopeptidasa M, al tiempo que los péptidos conservan su actividad de inducción de la agregación plaquetaria. Por lo tanto, la invención contribuye a la coagulación de la sangre y es útil, como un ejemplo no limitativo, en la aplicación tópica en zonas heridas del cuerpo donde se desea una coagulación local. Además, puesto que la trombina es mitogénica para los fibroblastos, los péptidos que activan el receptor de la trombina pueden potenciar la curación de heridas. La nomenclatura utilizada para describir los péptidos de la presente invención sigue la práctica convencional en la que el grupo amino se representa a la izquierda y el grupo carboxilo a la derecha de cada resto aminoácido. El término resto, cuando hace referencia a un aminoácido, significa un radical obtenido a partir del correspondiente α- o β- aminoácido, por eliminación del hidroxilo del grupo carboxilo y un hidrógeno del grupo α- o β- amino. Las abreviaturas utilizadas para denominar los aminoácidos son denominaciones de una letra o denominaciones de tres letras de acuerdo con las siguientes abreviaturas convencionales y según el 37 C.F.R. &1.822: 4 0 Aminoácido Abreviatura de tres letras Abreviatura de una letra alanina Ala A arginina Arg R asparragina Asn N ácido aspártico Asp D cisteína Cys C ácido glutámico Glu E glutamina Gln Q glicina Gly G histidina His H isoleucina Ile I leucina Leu L lisina Lys K metionina Met M fenilalanina Phe F Prolina Pro P 4

5 (Continuación) Aminoácido Abreviatura de tres letras Abreviatura de una letra serina Ser S treonina Thr T triptófano Trp W tirosina Tyr Y valina Val V otro Xaa Porejemplo,S,F,L,L,R,N,P,N,D,K,Y,E,P,FoSer,Phe,Leu,Leu,Arg,Asn,Pro,Asn,Asp,Lys, Tyr, Glu, Pro, Phe, representan los restos de L-serina, L-fenilalanina, L-leucina, L-leucina, L-arginina, L-asparragina, L-prolina, L-asparragina, ácido L-aspártico, L-lisina, L-tirosina, ácido L-glutámico, L- prolina y L-fenilalanina. Excepto la isoserina, los aminoácidos poseen la configuración L, salvo indicación en contrario, y los materiales de partida para proporcionar los restos de aminoácidos, normalmente los correspondientes N-α aminoácidos protegidos, están disponibles comercialmente o pueden prepararse por métodos convencionales. El grupo amino básico de los aminoácidos puede unirse a un protón de la solución y convertirse en un catión; el carboxilo ácido puede liberar un protón en la solución y convertirse en un anión. Por tanto, dado que los aminoácidos son iónicos, pueden ser preparados como sales. El término isoserina se refiere a un isómero de la serina que tiene la fórmula NH 2 CH 2 CHOHCOOH, y que también puede denominarse 2-hidroxi-beta-alanina o ácido 3-amino-2-hidroxipropanoico. La posición C-2 de la isoserina es quiral, y la isoserina que emplearon los autores de la invención en primer lugar, ha sido descrita como racémica, esto es, una mezcla a partes iguales de los isómeros D y L. No obstante la terminología D y L resulta algo ambigua para la isoserina. Otra nomenclatura que se utiliza con más precisión debido a que no es ambigua cuando describe la configuración absoluta de sustituyentes no naturales en esta solicitud, es la (R,S). Se dice que la L-serina presenta la configuración (S) en el carbono activo. Los autores de la invención han probado iso-ser racémica, esto es, una isoserina que presenta la configuración (R,S) en el C-2. Los isómeros (2R) y (2S) de la realización preferida pueden presentar diferentes actividades. La mayoríade los aminoácidosque se dan de forma natural son α-aminoácidos, lo que quiere decir que tienen un grupo amino (-NH 2 ) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos al mismo átomo de carbono. En la invención se utiliza un β-aminoácido que no se da de forma natural, la isoserina. El uso del β-aminoácido continúa resultando en un polipéptido que tiene actividad biológica para la activación plaquetaria. En los péptidos, el extremo de la izquierda se denomina extremo N y el extremo de la derecha se denomina extremo C. Cuando el extremo C está seguido en la práctica corriente, por un -NH 2,esto indica amidaciones del extremo C. Normalmente, esta regla se utiliza cuando otros restos de aminoácidos pueden estar a continuación de este extremo. Esta regla se utiliza en la presente solicitud. La secuencia de aminoácidos del sitio del receptor de la trombina en las plaquetas, ha sido identificada por Vu et al., Cell, 64, 7-68 (1991). El ADNe contiene un marco de lectura abierto de 42 aminoácidos, y una representación gráfica de la hidroafinidad sugiere la presencia de siete dominios transmembrana. El sitio del receptor de la trombina con dominios transmembrana, y los resultados de la ruptura con trombina se ilustran gráficamente en la Figura 4. La Figura 4A ilustra el receptor de la trombina con sus siete dominios transmembrana. La Figura 4B ilustra el ligando enlazado después de la ruptura con trombina. La Figura 4C ilustra un cambio conformacional tras la unión del ligando que activa al receptor de la trombina y da lugar a la agregación plaquetaria. Se identificó el supuesto sitio de ruptura con trombina entre el R41 y el S42 como sigue:... N A T L D P R/ S F L L R N P N D K Y E P F Un péptido de 14 aminoácidos que es una copia exacta del nuevo extremo amino SFLLRNPNDKYEPFT14 S42 - F

6 es capaz de agregar directamente plaquetas filtradas en gel. Los ligandos peptídicos que sólo contienen los primeros cinco o seis aminoácidos del T-14 también son activos. Los péptidos con D- y L-serina se muestran en el Esquema I. Esquema I El resto de L-serina que se da de forma natural, está representado por la fórmula a. La D-serina, prácticamente inactiva está representada por la fórmula b. La ruptura con trombina entre el R41 y el S42 da como resultado un péptido ligando enlazado que presenta una serina en el extremo N. La aminopeptidasa M del plasma puede romper la serina del extremo N de los péptidos ligando enlazados, obtenidos a partir del sitio del receptor de la trombina que se ha roto, lo que lleva a una pérdida total de la actividad de activación plaquetaria. A concentraciones micromolares de ligando peptídico, la inactivación tiene lugar con suficiente rapidez como para afectar a la agregación plaquetaria en plasma rico en plaquetas. Así, después de una exposicióntantoaplasmacomo asuero,laconcentración de ligando peptídico cambia rápidamente, lo que hace que los experimentos de dosis respuesta y a largo plazo sean difíciles de realizar e interpretar. Para superar este problema, se ha producido un análogo de ligando peptídico que resiste la ruptura con aminopeptidasas y la inactivación, haciendo ciertas sustituciones de la serina del extremo N. La estereoquímica de la isoserina y de la serina puede representarse como sigue: L-serina ácido(s)-s-amino-3-hidroxi-propanoico D-serina ácido (R)-2-amino-3-hidroxi-propanoico 6

7 (R)-isoSerina ácido (S)-2-hidroxi-3-amino-propanoico (S)-isoSerina ácido (S)-2-hidroxi-3-amino-propanoico 1 (R) y (S) no son denominaciones ambiguas pero sí arbitrarias, basadas en la disposición espacial de los grupos unidos al átomo de carbono central. Para la Ser, las prioridades son N > CO 2 > C-O; para la iso-ser, las prioridades son O > C-N > CO 2. Los restos que pueden utilizarse para R 1, en la invención incluyen (R)-isoserina (ácido (R)-2-hidroxi- 3aminopropanoico), (S)-isoserina (ácido (S)-2-hidroxi-3-aminopropanoico), 2,3-diaminopropanoato y 2,3- dihidroxipropanoato. Los restos para R 1, pueden tener sustituyentes nucleófilos tales como OH, NH, SH y acilo. Los análogos de serina preferidos para R 1, son (R,S) isoserina. En el esquema II se muestra un péptido de fórmula I que contiene isoserina racémica. Esquema II iso-sfllrn racémico 2 (uno o ambos isómeros son activos) 3 fórmula c fórmula d 4 isoserina isoserina 0 Los análogos de la (R) y (S) isoserina que no se dan de forma natural, están representados por las fórmulas c y d. Otros restos para R 1 se muestran en las fórmulas e y f. 7

8 1 2,3-diaminopropanoil FLLRN fórmula e ácido 2,3-diamino-propanoico 2 2,3-dihidroxi-propanoil FLLRN fórmula f ácido 2,3-dihidroxi-propanoico Los estudios han sugerido que el resto de Phe en R 2 es importante (chao et al., Biochem., 31, (1992)). Se ha expuesto la teoría de que un grupo Phe-fenilo en R 2 correctamente orientado, es crucial para una interacción hidrófoba necesaria con el receptor de la trombina, y que el receptor tiene un sitio de unión específica para este grupo fenilo. Nose et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, (1993), hallaron que una sustitución del Phe-2 por fluorofenilalanina aumentaba la activación del receptor de la trombina. En el ligando peptídico de fórmula I, R 2 puede ser cualquier resto de aminoácido hidrófobo que tenga un grupo cíclico o aromático. Los aminoácidos de este tipo, que se dan de forma natural, incluyen la fenilalanina y el triptófano. Los análogos de fenilalanina que no se dan de forma natural, pueden incluir sustituciones que no se dan de forma natural, tales como p-benzoilo, p-fluoro-, p-metilo, p-metoxi y similares. Un resto de aminoácido preferido para R 2, que no se da de forma natural, la p-benzoilfenilalanina, está representado por la fórmula h, en el Esquema III siguiente: 8

9 Esquema III SBLLRN (B=p-Benzoilfenilalamina) 1 fórmula h p-benzoilfenilalamina Los análogos de fenilalanina que no se dan de forma natural, están representados por la fórmula II: 2 x= fluor, metilo o benzoilo 3 Los aminoácidos preferidos para R, son fenilalanina, p-benzoilfenilalanina, p-fluorofenilalanina y p- metilfenilalanina. El grupo X también puede ser cualquier grupo hidrófobo, y el grupo X puede estar localizado en la posición orto o meta del anillo de benceno. R 3 puede ser cualquier aminoácido hidrófobo tal como alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, serina, treonina, triptófano y valina. Son preferidos la leucina, la fenilalanina y la alanina. Más preferida es la leucina. R 4 puede ser cualquier aminoácido hidrófobo tal como los enumerados para R 3. Son preferidas la leucina y la alanina. Más preferida es la leucina. 4 0 R puede ser cualquier aminoácido, p. ej., alanina, arginina, asparragina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, preferiblemente uno que sea básico. Son preferidos la arginina y la alanina. Más preferida es la arginina. Z puede ser carboxi, carboxiamida, una secuencia de aminoácidos que contenga, por lo menos, un resto de aminoácido que comience en el extremo N de la secuencia Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr-Glu-Pro- Phe-NH 2, cualquier otro aminoácido o grupo, que aumente la solubilidad o la capacidad de penetración celular de la fórmula I. Tales grupos son conocidos en la técnica e incluyen, p. ej., lípidos, esteroides, aminas de cadena larga tales como la decilamina, azúcares tales como conjugados de glucosamina, ácido glucurónico, etc. El péptido (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn-nh 2, se preparó sintetizando, en primer lugar, Phe-Leu- Leu-Arg-Asn-NH 2,enunsintetizadorautomático de péptidos, utilizando la química del t-boc y, a continuación, añadiendo manualmente t-boc isoserina racémica. Resultó que la (iso-ser)-phe-leu-leu- Arg-Asn-NH 2 era sustancialmente activa en comparación con el péptidoquesedadeformanatural.es posible que sólo uno de los diastereoisámeros del (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn-nh 2 sea activo. 9

10 Por otra parte, cuando se incubó con plasma a 37 C, el péptidoquesedadeformanatural,experimentó una degradación progresiva, que dio como resultado una ruptura casi total (96%) del péptido después de alrededor de dos horas. De hecho, con el péptido que se da de forma natural, la actividad de agregación plaquetaria disminuyóen1minutosyhabía desaparecido prácticamente a los minutos. Por el contrario, el (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn-nh 2 no experimentó ninguna ruptura identificable, ni tan siquiera a los 4 minutos; a las dos horas, sólo tuvo lugar alrededor de un 17% de ruptura, y la actividad de agregación plaquetaria permaneció inalterada durante, por lo menos, dos horas. Por tanto, el péptido sustituido con isoserina resiste la ruptura e inactivación por la aminopeptidasa M del plasma. La estabilidad del péptido sustituido con isoserina mejora los estudios llevados a cabo en medios que contenían plasma o suero. Además, el fragmento de péptido sustituido puede añadirse exógenamente para suplementar la acción del péptido que se da de forma natural, y aumentar la coagulación local en el sitio donde se haya producido una herida. La invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes, que no son limitativos. Ejemplo 1 Péptidos: El péptido de 11 aminoácidos Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr (T-11), que representa la secuencia de aminoácidos 42-2 del receptor de la trombina; el mismo péptido que contiene D-serina en lugar de L-serina ((ds)t-11); y el péptido de 6 aminoácidos Ser-Phe-Leu-Leu-Arg- Asn (que representa los aminoácidos 42-47), fueron sintetizados por métodos convencionales de síntesis peptídica. Los péptidos fueron sintetizados como amidas del extremo C, en un sintetizador automático de péptidos (Applied Biosystems 4A, Foster City, CA) utilizando la química del t-boc, resinas de 4-metilbenzohidrilamina, y N-metilpirrolidona como disolvente de acoplamiento, como ha sido descrito por Beer et al., Blood, 79, (1992). Los grupos protectores fueron éster de β-bencilo para el ácido aspártico, bencilo para la serina, 2-bromobenciloxicarbonilo para la tirosina, 2-clorobenciloxicarbonilo para la lisina, y tosilo para la arginina. La arginina, la asparragina, la tirosina y restos de prolina y fenilalanina seleccionados fueron sometidos a un acoplamiento doble. Se incluyó dimetilsulfuro y anisol en todas las soluciones de ruptura con fluoruro de hidrógeno. Los péptidos se verificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa, y los péptidos seleccionados fueron purificados con esta técnica. La masa de los péptidos seleccionados se determinó mediante espectrometría de masas por bombardeo rápido con átomos, como ha sido descrito por Beer et al., Blood, 79, (1992). Un péptido en el que se sustituyó la serina del extremo N de Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn por isoserina, esto es (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn, se preparó sintetizando, en primer lugar, el péptido Phe-Leu- Leu-Arg-Asn, por el método automático y, a continuación, añadiendo manualmente la isoserina racémica protegida con t-butiloxicarbonilo (t-boc) en diclorometano + dimetilformamida (2:1), al péptido de la resina, utilizando 1-hidroxibenzotriazol para activar la isoserina, y N,N -diisopropilcarbodiimida para unirla al péptido. A continuación,elpéptido se cortó separándolo de la resina con una solución de fluoruro de hidrógeno, y se utilizó directamente como una mezcla de diasteroisómeros. El análisis por HPLC demostró que alrededor del 68% de la absorbancia a 2nm estaba en el pico mayoritario para los péptidos (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn y T-11, el 2% estaba en el pico mayoritario para el péptido (D-Ser)T-11, y alrededor del 7% estaba en el pico mayoritario para el péptido Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn. Las concentraciones de los péptidos de los que se informa en los resultados fueron corregidas para estos valores. Ejemplo 2 0 Agregación plaquetaria. Se obtuvo plasma rico en plaquetas (en lo sucesivo PRP ) a partir de sangre humana anticoagulada con citrato sódico (0,01 volúmenes de citrato trisádico al %), o con una solución ácido-citratodextrosa (en lo sucesivo ACD ) en una solución A (ACD-A; 8, ml de sangre: 1, ml de ACD-A), mediante centrifugación a 700g, durante 3, min., a 22 C. Se obtuvo plasma pobre en plaquetas (en lo sucesivo PPP ) por centrifugación del PRP a 00g, durante 8 min., a 22 C. El ph del PRP con citrato, después de la preparación, era alrededor de 7,7, mientras que el ph del PRP con ACD-A era alrededor de 7,0. El ph del PRP se ajustó, cuando fue necesario, con NaOH 1 M o con HCl 1 M, y se mantuvo a alrededor del 7,70. La agregación plaquetaria se llevó a cabo en un agregométro de doble canal (Chronolog, Havertown, PA) utilizando varillas de agitación apareadas. Dosis-respuesta de la agregación inducida con péptidos. Se agitó plasma rico en plaquetas con citrato (PRP; plaquetas/µl, ph 7,0; 0,4 ml) en una cubeta a 37 C y, a continuación, se añadieron ml de los péptidos Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr (T-11), (D-Ser)-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn- Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr ((DS)T-11), Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn o (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn, para al-

11 1 2 3 canzar la concentraciónes finales siguientes: se añadió Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys-Tyr hasta una concentración máxima de 2.9 µm; se añadió (D-Ser)-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-Pro-Asn-Asp-Lys- Tyr hasta una concentración máxima de 9 µm; se añadió Ser-Phe-Leu-Leu Arg-Asn hasta una concentración máxima de 1,7 µm; se añadió (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn hasta alcanzar una concentración máxima de 4,9 µm. Una comparación de la dosis-respuesta en cuanto a la agregación plaquetaria inducida mediante T-11, (DS)T-11, SFLLRN e (iso-s)fllrn se muestra en las Figuras 1A, B, C y D. Los resultados de la Figura 1B demuestran que el (DS)T-11 sólo tiene una mínima actividad de agregación. Incluso una dosis de 9 µm de (DS)T-11 producía menos actividad de agregación que una de 2,9 µm de T-11. La pendiente de la última fase de desagregación plaquetaria identificable en las muestras que no experimentaron una agregación máxima, era menos pronunciada con el (DS)T-11 que con el T-11, a dosis que daban picos equivalentes de respuesta de agregación (1 U/min para el T-11 a 1,8 µm y U/min para el (DS)T-11 a 680 µm). La reducción en la pendiente de desagregación con D-serina es compatible con una disminución de la ruptura con aminopeptidasa M del péptido con D-serina. La Figura 1C muestra que el péptido SFLLRN era el más activo, necesitándose 0,8 µm para alcanzar una agregación equivalente a la mitad de la máxima. La Figura 1A muestra que el SFLLRNPNDKY (T-11) tenía una potencia similar a la del (iso-s)fllrn que se muestra en la Figura 1D, con una concentración de agregación equivalente a la mitad de la máxima de 3,3 y 4,0 µm, respectivamente. El DSFLLRNPNDKY ((DS)T-11) era sólo mínimamente activo, siendo incapaz de alcanzar una agregación máxima incluso a 1,8 µm, como se muestra en la Figura 1B. Estos datos muestran que, de acuerdo con observaciones previas, el péptido de 6 aminoácidos, SFLLRN, era más activo que el T-11 de mayor longitud, con el primero produciendo una agregación equivalente a la mitad de la máxima a 0,8µM y necesitando el último 2,2 µm comosemuestraenla Figura 1. La agregación inducida con SFLLRN, como la del T-11, presentó una pronunciada pendiente de desagregación. El péptido (iso-s)fllrn necesitó 4 µm para alcanzar la agregación equivalente a la mitad de la máxima. Así, el (iso-s)fllrn tiene 1-% de la actividad de activación plaquetaria del SFLLRN. A dosis que dieron picos equivalentes de respuesta de agregación, la pendiente de la fase de desagregación era menos pronunciada con (iso-s)fllrn que con SFLLRN (13 U/min para el SFLLRN a0,7µm y 4 U/min para el (iso-s)fllrn a 3,7 µm). Esto también sugiere que el (iso-s)fllrn es cortado con menos facilidad por la aminopeptidasa M. Ejemplo 3 Inactivación de la actividad de agregación de los péptidos mediante plasma. 4 0 Los autores de la invención han demostrado previamente que los péptidos T-11 y T-14 perdían actividad de agregación cuando eran incubados en plasma, debido a la ruptura de la serina del extremo N mediante la aminopeptidasa M; que la aminopeptidasa M de las células endoteliales también era capaz de romper el T-11; y que la inhibición de la aminopeptidasa M con amastatina aumentaba la agregación inducida por el T-11, pero no por la trombina. B. Coller et al., Biochemistry, 31, (1992). Se llevaron a cabo estudios adicionales de digestión de péptidos como sigue: Estudios de digestión de péptidos. Para las digestiones del T-11 y del (D-Ser)T-11, se añadieron 0,11 volúmenes de péptido mm en NaCl 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, ph 7,4, a plasma pobre en plaquetas con citrato, para conseguir una concentración final de 2 mm. Las muestras se incubaron durante 2 horas a 37 C, y, a continuación, las proteínas del plasma se precipitaron con ácido tricloroacéticoal9-%,a4 C, durante al menos min. Después de una centrifugación a g, a 22 C, durante 3 min, se analizó el sobrenadante para determinar la ruptura de los péptidos, mediante HPLC de fase inversa (C8; Applied Biosystems 0 RP Aquapore; columna de 2 x 4,6 mm); la elución se hizo con ácido trifluoroacético al 0,1% con un gradiente de acetonitrilo del 0-%. Para determinar la secuencia de aminoácidos de los productos de la digestión del T-11 y del (D- Ser)T-11, y para evaluar su capacidad para agregar plaquetas, el péptido (2 mm) se incubó con PPP con citrato, durante 2 horas, a 37 C, las proteínas del plasma se precipitaron con ácido tricloroacético, y el sobrenadante obtenido tras la centrifugación fue, tanto analizado como fraccionado, en la columna analítica de fase inversa. Las fracciones de los picos se secaron en una centrifuga con vacío (Speed-Vac, Savant, Farmingdale, NY) y se disolvieron, bien en tampón (NaCl 0,1 M y Tris/HCl 0,01 M, ph 7,4) para los estudios de agregación, o bien con ácido trifluoroacético al 0,1% para los análisis de aminoácidos. El análisis cuantitativo de los aminoácidos de los péptidos se llevó a cabo con reactivos y equipamientos 11

12 comerciales (equipo de trabajo Pico-Tag y columna C-18 Pico-Tag; waters-millipore, Bedford, MA). A continuación, la secuencia de aminoácidos pudo inferirse a partir del contenido de aminoácidos de cada pico La preincubacióndelt-11enplasmaa37 C condujo a una pérdida progresiva de capacidad de agregación plaquetaria. Unos tiempos de incubación de tan sólo min, fueron suficientes para producir una inhibición significativa. Después de 2 horas de incubación del péptido T-11 (2 mm), a 37 C, con plasma pobre en plaquetas, sólo el 34% del péptido permanecía intacto; por el contrario, el péptido (DS)T-11 no experimentó ninguna ruptura identificable, bajo las mismas condiciones (datos no mostrados). Para los estudios de Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn (SFLLRN) y de (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn ((iso- S)FLLRN, se mezcló péptido 2 mm en tampón (NaCl 0,1 M, Tris/HCl 0,01 M, ph 7,4) con un volumen igual de plasma pobre en plaquetas con citrato (1: 1) y, por separado, con un volumen igual de tampón, y se incubó a37 C, durante periodos variables de tiempo. Se retiraron alícuotas a los 1,, 4, y 1 minutos, y se analizaron para determinar, tanto la capacidad para agregar plaquetas como la ruptura del péptido. La agregación plaquetaria se determinó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2, utilizando un agregómetro de canal doble, salvo porque la concentración final de 2,2 µm para el SFLLRN y de 8,8 µm para el (iso-s)fllrn, se eligieron para dar lecturas máximas (escala completa) prácticamente comparables. Los resultados se muestran en la Figura 2. Para los estudios de digestión de péptidos para el SFLLRN y el (iso-s)fllrn, se retiraron muestras a diversos tiempos y se analizaron mediante HPLC para determinar la digestión de los péptidos, después de precipitar las proteínas del plasma con ácido tricloroacético. Los resultados se muestran en la Figura 3. Cinética de la pérdida de actividad de agregación de los Péptidos durante la incubación con plasma. El péptido SFLLRN pierde rápidamente la actividad de agregación plaquetaria cuando se incuba con plasma, mientras que el péptido (iso-s)fllrn pierde poca actividad, si es que pierde algo, incluso después de 2 horas. Estos resultados se muestran en la Figura 2. La disminución de densidad óptica en la Figura 2B muestra que las plaquetas se han agregado. Así, el péptido (iso-s)fllrn conserva su actividad de agregación plaquetaria en un grado mucho mayor que el del SFLLRN, cuando se incuban con plasma. De forma similar, el (DS)T-11 retiene mas de la mitad de su actividad de agregación cuando se incuba con plasma durante 1 hora, mientras que el T-11 pierde la totalidad de su actividad de agregación en el transcurso de 1 hora (datos no mostrados). Cuando, bien el SFLLRN o el (iso-s)fllrn, se incubaron con tampón en lugar de con plasma, no hubo disminución de la actividad del péptido después de 2 horas (datos no mostrados). Se incubaron concentraciones menores de los péptidos (12 µm) con plasma. El péptido SFLLRN perdió la totalidad de su actividad de agregación en 18 min. El péptido (iso-s)fllrn conservó su actividad de agregación completa después de 4 min de incubación, pero hubo alguna disminución de la actividad después de 1 hora; no obstante, incluso a las 2 horas, se mantenía algo de actividad de agregación. Cinética de la digestión de los péptidos durante la incubación con plasma. Los resultados del tiempo de elución con HPLC de la digestiónconplasmadelafigura3,muestran que cuando el SFLLRN (concentración final 1 mm) se incubó con plasma pobre en plaquetas al 0%, a37 C, el péptido SFLLRN eluyó a alrededor de los 29 min, y el péptido (iso-s)fllrn eluyó aalrededor de los min. El pico que eluyó a alrededor de los 22 min procede del plasma y sirvió como control interno. El SFLLRN experimentó una ruptura detectable en min, que fue progresando hasta una digestión prácticamente completa a las 2 horas. Por el contrario, el (iso-s)fllrn experimentó una digestión mínima, incluso después de 2 horas de precipitación más específicamente, con el SFLLRN, el 3% del péptido dejó deestarintactodespués de sólo1min. Ladigestión progresó rápidamente con el tiempo, de forma que el porcentaje que se mantenía intacto disminuyó al 49%, 23%, 16% y 4% a los, 4, y 1 min. Prácticamente la totalidad del péptido (iso-s)fllrn permaneció intacto durante los primeros min, e incluso después de 1 min de incubación, 83% del péptido permanecía intacto (Figura 3). 12

13 1. Un polipéptido que comprende la fórmula I: REIVINDICACIONES en la que: R 1 -R 2 -R 3 -R 4 -R -Z fórmula I R 1 es isoserina, 2,3-diaminopropanoato, o 2,3-dihidroxipropanoato R 2 es fenilalanina, p-fluorofenilalanina, p-metilfenilalanina o triptófano R 3 es leucina o fenilalanina R 4 es leucina R es arginina Z es carboxilo, carboxamida, uno o más aminoácidos de los aminoácidos 6 a 14 de la secuencia SFLLRNPNDKYEPF, o un grupo que aumente la capacidad de penetración celular del polipéptido, siendo seleccionado dicho grupo de penetración celular entre el grupo constituido por lípidos, esteroides, aminas de cadena larga y azúcares; y en donde dicho polipéptido activa la agregación plaquetaria y resiste la degradación por amínopeptidasa M. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que R 2 es fenilalanina, p-benzoilfenilalanina, p- fluorofenilalanina, p-metilfenilalanina o triptófano; R 3 es alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, serina, treonina, triptófano o valina, y R 4 es alanina, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, prolina, serina, treonina, triptófano o valina. 3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la fórmula I tiene la secuencia (iso-ser)-phe-leu-leu-arg-asn-nh Un medicamento para activar la agregación plaquetaria, que comprende un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones El uso de un polipéptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la fabricación de un medicamento para activar la agregación plaquetaria y resistir la degradación por aminopeptidasa M. 4 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 13

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