11 Número de publicación: Int. Cl.: 72 Inventor/es: Lanquetin, Michel. 74 Agente: Gil Vega, Víctor

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 8/97 (06.01) C07D 311/36 (06.01) A23L 1/ (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Procedimiento de extracción de mezclas flavonoides y utilización de las mezclas así obtenidas en dermocosmética, alimentación y farmacia. Prioridad: FR Titular/es: LABORATOIRE THERAMEX 6, avenue du Prince Hereditaire Albert Monaco, MC 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Lanquetin, Michel 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Gil Vega, Víctor ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 2 3 DESCRIPCIÓN Procedimiento de extracción de mezclas flavonoides y utilización de las mezclas así obtenidas en dermocosmética, alimentación y farmacia. La presente invención se sitúa en el ámbito de la química y, más en particular, de la química de extracción de sustancias naturales. Más en particular, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de extracción y de enriquecimiento en constituyentes biológicamente activos de extractos vegetales. En especial, la invención tiene por objeto un nuevo procedimiento de extracción que conduce a productos ricos en isoflavonas a partir de extractos o de mezclas ya concentradas de derivados isoflavónicos y particularmente de derivados de genisteína. En el campo de la alimentación es conocida la importancia de un importante aporte de isoflavonas, ya que el alto consumo que se hace de ellas en el Extremo Oriente, y en particular en Japón, mediante derivados de la soja, ha demostrado el papel beneficioso para la salud desempeñado por estos compuestos, sin riesgo de efectos secundarios nocivos. El consumo de productos derivados de la soja estimado se sitúa entre a 0 mg de isoflavonas totales al día, mientras que en los países occidentales se consumen menos de mg de isoflavonas al día. Estos pseudo-estrógenos desempeñan un papel beneficioso manteniendo una acción biológica similar a la de los estrógenos naturales y sobre todo de los estrógenos conjugados. Las isoflavonas proporcionan buenos resultados en el tratamiento de los síntomas relacionados con la menopausia. Producen una disminución importante de los trastornos del climaterio, por ejemplo de los sofocos, mejora la dispareunia y la vaginitis. Una publicación de Heart and Health Report (PR Newswire, de Junio de 00) ha demostrado, basándose en 38 estudios, que la soja permite reducir significativamente el porcentaje de colesterol y particularmente el porcentaje de LDL-colesterol. Sin embargo, hasta ahora la administración de estas isoflavonas o fitoestrógenos se realiza por vía oral, pues las dosis a administrar eran relativamente importantes. Habida cuenta del hecho de que las leches de soja o los jugos de semillas de soja contienen pocas isoflavonas, en general de a 70 mg de producto de soja por 0 gramos, para alcanzar una dosis eficaz es necesario utilizar o administrar cantidades importantes de productos derivados de la soja. Por consiguiente, existe una verdadera necesidad de formas más concentradas en isoflavonas extraídas de la soja y que presenten un alto porcentaje elevado de genisteína y de sus derivados Ya se conocen derivados O-malonil de genisteína y daidzeína, los cuales se obtienen con un bajo rendimiento a partir de 1 kg de materia prima y llegando a mg de producto final. Ya se ha llevado a cabo un primer intento concentrando los extractos de semillas de soja por el procedimiento descrito en la patente europea 079.3, a nombre de la Sociedad Archer Daniels Midland Co., partiendo de melazas de soja. Se obtienen así extractos que, sin embargo, contienen pequeñas cantidades de isoflavonas y principalmente de genistina (77%) y algo de daidzina (17%). También parece necesario tratar de obtener extractos más concentrados que presenten el máximo contenido en derivados de genistina y sobre todo en compuestos O-malonil de genistina, presentes de forma natural en las preparaciones de soja. En la patente US , a nombre de Archer Daniels Midland Co., ya se ha llevado a cabo un segundo intento, siendo el objeto de la misma un procedimiento para la producción de isoflavonas a partir de leche de soja utilizando las diferencias de solubilidad de las isoflavonas en función de la temperatura. Se obtiene así una fracción de isoflavonas con una concentración comprendida entre un y un 70% en peso de extracto seco, pero cuyo contenido en derivados O-malonil no se menciona. Por consiguiente, el problema según la invención es encontrar un procedimiento que permita obtener, sin desnaturalización ni modificación química, extractos de soja muy ricos en isoflavonas en su forma O-malonil y glicosiladas, donde la relación genisteína/daidzeína total sea básicamente idéntica a la presente en la naturaleza. Igualmente, el problema de la invención reside en conseguir eliminar otras isoflavonas poco activas o por completo inactivas, como principalmente glicitina y sus derivados. Preferentemente, el contenido residual en glicitina y sus derivados será inferior al 4% y, en particular, inferior al 1,%. El problema de la invención reside también en la posibilidad de obtener formas farmacéuticas, en particular tópicas, a base de concentrados de isoflavonas, lo suficientemente ricos en principios activos para alcanzar concentraciones activas con volúmenes pequeños. 2

3 Otro objeto de la invención consiste en la realización de preparaciones alimentarias, en particular galletas, barquillos, barritas chocolateadas y otras preparaciones sólidas o fluidas, que contienen un concentrado de isoflavonas de soja según la invención La invención tiene también por objeto la obtención de concentrados de extractos de soja desprovistos de gliciteína que incluyen cantidades elevadas de derivados O-malonil de isoflavonas superiores al % y pudiendo alcanzar el 3% y preferentemente conteniendo de un 28 a un 3% de isoflavonas. Estos concentrados encuentran un doble uso, por una parte permitiendo obtener preparaciones ricas en isoflavonas y también proporcionando un medio para reforzar el contenido en isoflavonas en preparaciones menos concentradas, para garantizar una preparación estandarizada cuyo contenido no fluctúe en función del resultado de la recogida de semillas. Estos problemas han encontrado una solución mediante la utilización de un nuevo procedimiento de concentración de un permeato de soja que, mediante un procedimiento de osmosis inversa, ha permitido obtener un retentado de osmosis cuya concentración se aproxima al % en extracto seco. Este retentado constituye la materia prima que permite obtener mezclas en polvo que tienen concentraciones de isoflavonas y de sus derivados que varían de un 3, a aproximadamente un %, con diferentes rendimientos de separación. El esquema de producción adjunto (Figura 1) simboliza los diferentes procesos de concentración. Estas vías de producción de los diferentes productos de concentración de isoflavonas permiten obtener materias primas que presentan un perfil cromatográfico con una naturaleza parecida a la observada en la semilla. Estos productos de concentración permiten, cuando se mezclan con extractos menos ricos, obtener concentrados dosificados a un 3,- % sin desnaturalización de los productos obtenidos. Esencialmente, el procedimiento según la invención consiste en tratar las semillas de soja previamente peladas en un medio acuoso para obtener un jugo de soja, éste se somete a una primera ultrafiltración sobre membrana con un umbral de corte superior a.000, para producir un permeato de soja, el cual se concentra mediante osmosis inversa, obteniéndose así un concentrado de soja rico en extracto seco, se evapora este concentrado a presión reducida para recoger una preparación de soja con un alto contenido en isoflavonas, que puede alcalzar el 28 al % aproximadamente de extracto seco, se eluye esta preparación en un disolvente de bajo punto de ebullición sin modificación de su perfil, sin que se formen derivados acetilados no naturales y entonces se atomiza el residuo de cristalización resultante a baja temperatura, para obtener una mezcla en polvo con una concentración en isoflavonas superior al %. El disolvente de bajo punto de ebullición es, en particular, un disolvente hidroxilo, más específicamente etanol. En otra forma de realización del procedimiento según la invención, el permeato de soja se concentra por osmosis inversa para obtener un retentado de osmosis al % en materias sólidas, se separa por cromatografía y se eluye una fracción rica en isoflavonas, que se concentra a presión reducida y luego se lleva a estado seco por atomización. Mediante esta forma de realización, el rendimiento en isoflavonas es el % de la cantidad teórica. El retentado de osmosis puede también someterse a una ultrafiltración, seguidamente se recoge el retentado, que se concentra también por atomización, obteniéndose una materia prima que presenta un contenido en isoflavonas superior o igual al %. El rendimiento de este tratamiento es del orden del 3 al %. Las isoflavonas obtenidas por el procedimiento de la invención se básicamente se presentan en forma de derivados O-malonil y glicosilados de genisteína, muy poco de gliciteina o de glicitina. Además, las preparaciones concentradas según la invención no incluyen o lo hacen en una cantidad no detectable, derivados acetilados (acetildaidzina, acetilgenistina, acetilglicitina), lo cual indica que las operaciones de extracción se han realizado a temperaturas lo suficientemente bajas como para evitar una reacción de descarboxilación del derivado malonil y de esterificación en presencia de alcohol. Bajo estas condiciones, las proporciones de isoflavonas expresadas en agliconas de isoflavonas respetan las encontradas en la naturaleza, esto es aproximadamente 3/1/0-1 (genisteína/daidzeína/gliciteína). Una ventaja importante del procedimiento según la invención deriva del hecho de que las semillas de soja se pelan previamente. De este modo, se eliminan los gérmenes que hacen que los concentrados no sean comestibles. El procedimiento según la invención proporciona un concentrado en el cual aparecen mayoritariamente derivados de genisteína, mientras que los procedimientos de la técnica anterior, que comprenden fases de recristalización de extractos acuosos o alcohólicos, proporcionan mezclas más ricas en daidzeína, según los parámetros de solubilidad de este último compuesto. Así, un producto comercial actualmente en el mercado contiene (en mg por 0 g): 3

4 .9 mg de daidzina mg de genistina.163 mg de glicitina mg de acetildaidzina mg de acetilgenistina 3.34 mg de acetilglicitina (relación genisteína/daidzeina/gliciteína: 0,39/1/0,97). 2 Estas cifras permiten apreciar el mayor grado de purificación proporcionado por el procedimiento según la invención. Las composiciones farmacéuticas, alimentarias, dietéticas y cosméticas que contienen el concentrado de isoflavonas según la invención incluyen proteínas y/o lípidos y/o glúcidos y/o fibras alimentarias y/o ácidos grasos saturados y/o ácidos grasos poliinsaturados y/o sales minerales y/o vitaminas y/o agentes aromatizantes y/o edulcorantes y/o productos amiláceos y/o sustancias de carga inorgánicas u orgánicas y/o agentes de textura. En el caso de una barra chocolateada de g conteniendo isoflavonas, el valor energético será del orden de 0 Kcal o de 800 a Kj. El contenido en ácidos grasos poliinsaturados (ácido linoleico, ácido linolénico, EPA, DHA) puede ser de 0 a 0 mg de DHA por 0 g En una composición alimentaria según la invención, los contenidos en isoflavonas oscilan entre el 0,2 y el 0,%; esto es, para una barra chocolateada de g, una cantidad que oscila aproximadamente entre y 0 mg por barra. Entre los elementos minerales presentes en las composiciones alimentarias según la invención se pueden citar derivados de calcio, de fósforo, de magnesio, de metales alcalinos, de hierro, de zinc, de cobre, de manganeso, de yodo y/o de selenio. Entre las vitaminas contenidas en las composiciones alimentarias según la invención se pueden citar vitamina A y sus precursores, vitamina C, vitamina B1, vitamina B2, vitamina PP, vitamina B, vitamina B12, vitamina B6, ácido fólico, folinato de calcio y/o biotina. La invención se refiere igualmente a composiciones cosméticas a base de los concentrados de isoflavonas según la invención, particularmente en forma de leche, de crema, de gel, de loción, de baño, de emulsión y similares. Así, se prepararán emulsiones H/E antienvejecimiento para el contorno de los ojos, geles antibolsas o antiojeras para los ojos, geles hidratantes, cremas de día protectoras, cremas suavizantes o cremas de cuidado para pieles secas. La invención tiene igualmente por objeto las composiciones farmacéuticas que incluyen como principio activo los concentrados de isoflavonas, en asociación o mezclados junto con uno o más excipientes o vehículos apropiados para la vía digestiva o tópica. Los excipientes o diluyentes más utilizados son lactosa, carbonato de calcio, hidróxido u óxido de magnesio, fosfato tricálcico, carbonato de magnesio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, polivinilpirrolidona reticulada o polivinilpolipirrolidona. A tales preparaciones se pueden añadir agentes ligantes como etilcelulosa, adyuvantes de compresión como hidrotalcita o una zeolita, agentes de deslizamiento como estearato de calcio o estearato de magnesio o agentes lubricantes como talco y glicerol ésteres (estearato, palmitato) o agentes antiestáticos como sílice coloidal (Aerosil ). Igualmente se pueden incorporar agentes de aromatización sintéticos o naturales (vanillina, etilvanillina, maltol, furaneol, etc.), proteínas alimentarias como caseína o sus hidrolizados o polisacáridos como almidón o dextrinas. Las composiciones a base de extractos vegetales concentrados pueden contener de a 0 mg de isoflavonas por toma unitaria. Las composiciones se administrarán de 1 a 3 veces por día y encuentran su aplicación en el tratamiento de trastornos orgánicos relacionados con la menopausia. Por ejemplo, se dirigen a tratar los sofocos relacionados con la menopausia fisiológica o con la menopausia de origen quirúrgico o para la prevención de trastornos relacionados con fenómenos circulatorios, osteoporosis y acción antiradicales, entre otras. 4

5 Las composiciones según la invención presentan una biodisponibilidad muy buena después de la administración vía oral de comprimidos, en particular dosificados con 37, mg y con una posología de 2 comprimidos al día. Los ensayos farmacocinéticos se han realizado con una administración única en un día o se reiteran durante días. Los ejemplos siguientes explican la invención, sin embargo no la limitan. Ejemplo I Preparación de polvos concentrados según la invención Se concentró un permeato de soja por osmosis inversa a un caudal de litros/semana para obtener un retentado de osmosis veces concentrado (caudal.000 litros/semana). Este se concentró por evaporación a presión reducida a razón de.000 litros/semana para obtener un jugo concentrado al 12% aproximadamente de extracto seco y se eliminó el efluente. Por evaporación suplementaria en un evaporador rotativo, se recogió un concentrado de jugo de soja al % de extracto seco, que se eluyó en etanol a baja temperatura, se evaporó la fase etanólica por atomización a baja temperatura y se recogió un polvo amarillo en un 28 a un % formado por isoflavonas, constituido principalmente por genisteína y en segundo lugar por daidzeína. Esta forma concentrada se empleará, en particular, para la realización de formas tópicas vía local. 2 El polvo de mg de isoflavonas/%g se empleó también para ajustar formas menos concentradas (6.000 a mg/% g) a un valor constante de mg/% g. Los diagramas de cromatografía de alto rendimiento realizados sobre polvo al 3,% (diagrama 2) y al % (diagrama 3) muestran que la concentración no tuvo incidencia sobre la composición cualitativa del concentrado. Ventaja del procedimiento de concentración por osmosis inversa del permeato de soja 3 La materia prima de partida, el permeato de soja, es un producto muy rico en agua (1% de extracto seco). La recuperación de las isoflavonas contenidas en este permeato sólo se puede adaptar a escala industrial bajo la condición de reducir los volúmenes de líquido utilizados. La estabilidad de las isoflavonas puede verse alterada por un tratamiento térmico prolongado, una filtración en condiciones de temperatura que no sobrepasen los 0ºC y que permita una eliminación de una parte del agua. Esta filtración, que permite la retención total de las moléculas de bajo peso molecular que son las isoflavonas (PM de 24 Dalton a 32 Dalton), sólo es posible mediante un procedimiento, la osmosis inversa, utilizando membranas de filtración de muy baja porosidad. Bajo una presión de a bar, aproximadamente un 90% del agua contenida en el permeato de soja se elimina, obteniéndose para el retentado una concentración en extracto seco del % aproximadamente. Al mantenerse la proporción en isoflavonas, este producto puede utilizarse ventajosamente como materia prima para la extracción siguiente. 4 (Tabla pasa página siguiente) 0 6

6 Composiciones de polvo concentradas obtenidas según el procedimiento del Ejemplo 1 a - producto I 2 3 b - producto II

7 Ejemplo II Formulaciones cosméticas: ejemplos de realización de composiciones 1 - Crema de día protectora Emulsión H/E anti-envejecimiento Leche H/E anti-envejecimiento para el cuerpo 0 6 7

8 4 - Emulsión H/E anti-envejecimiento contorno de los ojos 2 - Gel antibolsas/antiojeras Gel hidroalcohólico

9 Ejemplo III Formulaciones dietéticas 1 - Barras de chocolate (de o g aproximadamente)

10 2 2 - Galletas vitaminadas

11 3 - Galletas energizantes Comprimidos para chupar 3 4 La mezcla se comprimió en tabletas con un diámetro de 17 mm y un peso medio de 0 mg. 0 - Granulado chocolateado 0 ml de una solución al % de hidroxipropilcelulosa en etanol. La mezcla se trituró, se extrusionó en filamentos y se secó para formar granulados. 6 11

12 Ejemplo IV Formulaciones farmacéuticas 1 - Comprimidos con 7,0 mg de isoflavonas Cápsulas Cápsulas blandas 6 12

13 4 - Cápsulas 2 - Comprimidos

14 6 - Comprimidos en grageas Comprimidos en grageas

15 8 - Comprimidos en grageas Granulados 4 0 6

16 - Comprimidos revestidos Comprimidos en grageas

17 12 - Comprimidos en grageas 2 Paras las grageas, el procedimiento de fabricación es el siguiente: 1. Compresión, secado de los núcleos con Sepifilm LP 0 2. Montaje Sepifilm SC + Talco 3 3. Recubrimiento con cera carnaúba

18 REIVINDICACIONES Concentrados de soja ricos en isoflavonas en su forma O-malonil sin desnaturalización ni modificación química de la forma natural donde los extractos obtenidos se caracterizan por un contenido en isoflavonas superior al % en peso, manteniendo una relación genisteína/daidzeína sustancialmente idéntica a la presente en la naturaleza y con una ausencia casi completa de derivados de gliciteína y con un contenido en derivados O-malonil de isoflavonas que oscila entre un % y un 3% en peso. 2. Concentrados de soja ricos en isoflavonas en su forma O-malonil sin desnaturalización ni modificación química de la forma natural según la reivindicación anterior caracterizados porque el contenido en glicitina y sus derivados en los concentrados es de un 4% o inferior al 4%. 3. Concentrados de soja ricos en isoflavonas en su forma O-malonil sin desnaturalización ni modificación química de la forma natural según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en los cuales el contenido en glicitina y sus derivados en los concentrados es inferior al 1,%. 4. Productos de concentrados de soja ricos en isoflavonas en su forma O-malonil sin desnaturalización ni modificación química de la forma natural según las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque presentan una relación genistina/daidzina/glicitina de aproximadamente de 3/1/0.. Procedimiento para obtener extractos de soja concentrados ricos en isoflavonas sin desnaturalización ni modificación química según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se tratan las semillas de soja previamente peladas, en medio acuoso, para obtener un jugo, el cual se somete a una primera ultrafiltración para producir un permeato de soja, porque se concentra éste por osmosis inversa y se obtiene un concentrado de soja rico en extracto seco, se evapora este concentrado a presión reducida para separar una preparación con un alto contenido en isoflavonas, se eluye esta preparación con un disolvente de bajo punto de ebullición sin que se modifique su perfil, luego se atomiza el residuo resultante a baja temperatura para obtener una mezcla pulverulenta con una concentración en O-malonil-isoflavonas que oscila entre un y un 3% en peso. 6. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque la ultrafiltración preliminar se realiza sobre una membrana con un umbral de corte superior a Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque la concentración por osmosis inversa se realiza en una célula con membrana de filtración de muy baja porosidad. 8. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque la evaporación del concentrado se lleva a cabo a presión reducida Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque se utiliza como medio de evaporación un evaporador rotativo.. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque la extracción con un disolvente de bajo punto de ebullición del concentrado de soja se lleva a cabo con un disolvente hidroxilado. 11. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque el disolvente hidroxilado es etanol. 12. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque el producto de la extracción etanólica se lleva a sequedad por atomización a presión reducida. 13. Procedimiento según la reivindicación, caracterizado porque el producto de atomización es un polvo con una valoración de 280 a mg/g de isoflavonas, particularmente en su forma O-malonil. 14. Concentrados de isoflavonas extraídos de semillas de soja que tienen un valoración de 0 a mg/g de isoflavonas en su forma O-malonil obtenidos por el procedimiento de una de las reivindicaciones a 13.. Formulaciones tópicas utilizables en cosmética y en dermatología caracterizadas porque el ingrediente activo es un concentrado de isoflavonas según la reivindicación Formulaciones tópicas, particularmente cremas, leches, lociones, geles, baños o emulsiones, caracterizadas porque el ingrediente activo es un concentrado de isoflavonas según la reivindicación Composiciones alimentarias o dietéticas caracterizado porque el ingrediente principal es un concentrado de isoflavonas según la reivindicación Composiciones alimentarias según la reivindicación 17, caracterizadas porque incluyen además proteínas, lípidos, glúcidos, fibra alimentaria, ácidos grasos, sales minerales, vitaminas, sustancias aromatizantes, edulcorantes, productos amiláceos, sustancias de carga inorgánicas u orgánicas y agentes de textura. 18

19 19. Composiciones farmacéuticas destinadas a la vía oral o a la vía tópica caracterizadas porque incluyen como ingrediente activo un concentrado de isoflavonas según la reivindicación

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