NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN274 :2012
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- José Francisco Rodríguez Juárez
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1 Quito - Ecuador NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN274 :2012 AZUCAR. DETERMINACIÓN DEL DIOXIDO DE AZUFRE Primera edición SUGAR. SULFUR DIOXIDE DETERMINATION First edition DESCRIPTORES: AZUCAR, DIOXIDO,AZUFRE CDU: 664.1
2 Norma Técnica Ecuatoriana AZUCAR DETERMINACION DEL DIOXIDO DE AZUFRE NTE INEN 274 : Objeto 1.1 Es t a n o r m a describe el m é t o d o p a r a d e t e r m in a r e l c o n t e n id o d el d ió x id o d e azufre en el azúcar. 2. Alcance y campo de aplicación Este método es oficial para productos que contienen bajos niveles de sulfitos tales como los azucares blancos (General Subject 2) y especialidades de azúcar (General Subject 3), con la excepción de azúcares morenos, para los cuales es tentativo. En el caso de la Determinación de Sulfitos en Azúcar Blanco, si el usuario tiene la libertad de elección de método, ICUMSA recomienda que se dé preferencia al Método GS2/1/7/ Fundamento En presencia de oxigeno, los sulfitos son oxidados a sulfatas usando sulfito oxidasa: SO O 2 +H 2 O SO H 2 O El peróxido de hidrógeno que se forma es reducido utilizando NADH - peroxidasa en presencia de la forma reducida del nicotinamida adenín dinucleótido, esto es, el NADH: 2 H NAD La reducción de absorbancia a la longitud de onda escogida (334 ó 340 nm) es proporcional a la cantidad de NADH consumido en la segunda reacción y por tanto a la cantidad de sulfitos en la muestra. 4 Reactivos 4.1 Sulfato de amonio, aprox. 3 mol/l. Disolver 396 g de sulfato de amonio en un matraz aforado de 1000 ml y llevar hasta el enrase con agua destilada. 4.2 Tampón, ph 8.0. Disolver 5,57 g de clorhidrato de trietanolamina en 40 ml de agua destilada en un matraz aforado de 50 ml. Ajustar e1 ph a 8,0 con hidróxido de sodio de 0,1 mol/l y luego enrasar con agua destilada. 4.3 Solución de NADH (7 mmol/l). Disolver 25 mg de NADH-Na2 y 5 mg de NaHC03 en 5 ml de agua destilada. DESCRIPTORES: AZUCAR, DIOXIDO, AZUFRE -1-
3 4.4 Suspensión de NADH-peroxidasa (NADH-POD U/L). Diluir 0,1 ml de la suspensión de enzima con 0,2 ml de solución de sulfato de amonio 3,0 mol/u (3.1). 4.5 Suspensión de sulfito óxidasa (S02-OD conteniendo U/L). Diluir 1 ml de esta suspensión con 1 ml de solución de sulfato de amonio de 3,0 mol/l 4.6 Soluciones de NADH para el control del espectrofotómetro. Cuando se emplee un espectrofotómetro nuevo, verificar el coeficiente de absorción, s, de la solución de NADH (3.3); a 340 nm el valor de s deberá ser 6,3 ± 0,04; a 334 nm el valor de s deberá ser 6,18 ±0,04. NADH (0,07 mmol/l). Diluir 20 ul de solución (3.3) con ul de agua destilada. NADH (0,035 mmol/l). Diluir 20 ul de solución (3.3) con ul de agua destilada. NADH (0,017 mmol/l). Diluir 10 ul de solución (3.3) con ul de agua destilada. (3.1). Ajustar la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm ó a 334 nm. Medir la absorbancia, A, de las tres soluciones de control. Calcular el coeficiente de absorción, є, para NADH con la ecuación de Lambert-Beer: En donde: A = Valor de absorbancia registrado. c = Concentración de la solución de NADH (mmol/l). d = Camino óptico (cm). Calcular el coeficiente de absorción, e, para NADH partiendo de las tres soluciones de control y sus valores promedio. NOTA - Reactivos listos para usar en forma de kit: Para un número reducido de determinaciones, es preferible emplear ciertos reactivos ya preparados que están disponibles en forma de kit, por ejemplo en Boehringer Mannhein. Estos kits constan de tres soluciones: Tampón de ph 8,0 conteniendo NADH Suspensión de NADH-POD Suspensión de S0 2 -OD El empleo de estos reactivos requiere ligeras modificaciones de los volúmenes utilizados durante el ensayo y en los cálculos finales. Estas modificaciones se encuentran en las instrucciones del kit. 4.7 Coadyuvante de filtración - para usar con azúcares en polvo que contengan un agente antiaglomerante (ej. Clarcel Flo-TR, Elf Atochem U K Ltd. Thatcham, Newbury, UK). -2-
4 5 Aparatos 5.1 Espectrofotómetro - para leer a 340 nm (lámpara de espectro continuo) ó a 334 nm (lámpara de vapor de mercurio). 5.2 Celda con camino óptico de 1 cm preferiblemente de cuarzo. 5.3 Micropipetas - de 10, 20, 50 y 100 µl preferiblemente pipetas automáticas con sus respectivas puntas de: pipeta. 5.4 Cronómetro. 5.5 Filtros de membrana - Tamaño de poro 0,45 µm diámetro 50 mm. NOTA - El tamaño de poro se determina con el ensayo del 'punto de burbuja'. 5.6 Soporte para filtro de membrana y matraz el embudo del filtro deberá preferiblemente estar ajustado a un soporte de acero inoxidable. 6 Muestras La cantidad de sulfitos en la celda del espectrofotómetro deberá estar entre 3 y 30 ug. Para azúcares, usar una solución de 40 g de azúcar disuelto en agua hasta obtener un volumen final de 100 ml. Para jarabes con contenido de sulfitos entre mg/kg, diluir la muestra en la proporción 1 a 5 con agua destilada, por ej g en 500 ml. NOTA - Para azúcares en polvo que contengan un agente anti-aglomerante, añadir 0,2 g de coadyuvante de filtración a los 40 g de muestra, disolver, llevar hasta 100 ml y después filtrar a través del filtro de membrana. Usar el filtrado para los ensayos subsecuentes. 7 Procedimiento Mantener los reactivos, el tampón y el agua a temperatura ambiente (20 a 25 C). Pipetar las siguientes cantidades en las celdas de 1 cm respectivas. Celda Celda S Muestra (ml) Blanco Azúcar Jarabe (ml) Solución tampón (3.2) 1,00 1,00 1,00 Solución de 0,1 0,10 0,10 NADH (3.3) NADH - 0, 01 0,01 0,01 Peroxidasa (3.4) Muestra - 2,00 0,2 Agua destilada 2,0-1,8 Sellar las celdas con película de plástico y mezclar suavemente por volteo. Después de un periodo de 5 min, medir la absorbancia a la longitud de onda seleccionada (334 ó 340 nm) con respecto al aire (sin celda en el paso de luz). Se obtienen de esta forma la absorbancia del blanco, A 1B, y la de la muestra, A 1S -3-
5 Añadir 0,05 ml de sulfito oxidasa (3.5) a cada celda y mezclar el contenido de la misma manera descrita previamente. Después de 30 min. Medir absorbancia nuevamente. Se obtienen de esta forma la absorbancia del blanco, A 2B y la de la muestra, A 2S. NOTA - Para ciertos azúcares blancos la concentración de S02 es inferior que la requerida para el ensayo (3 mg/kg). La sensibilidad del ensayo se puede incrementar utilizando una celda de 2 cm de camino óptico, siempre y cuando los volúmenes utilizados para el ensayo sean todos incrementados proporcionalmente para obtener un volumen suficiente que permita llenar la celda 8. Expresión de resultados 8.1 Cálculos. Calcular las siguientes diferencias de absorción: Blanco Muestra Calcular la concentración de sulfitos como S02 en mg/ml de la solución analizada empleando la siguiente fórmula: En donde: V = volumen final en la celda, aquí es 3,16 ml (este volumen puede ser diferente cuando se emplean kits). MW = peso molecular de la sustancia en g (aquí es 64,06). є = Coeficiente de extinción molar a la longitud de onda seleccionada. Las utilizadas aquí son: 6,18 L mmol -1 cm -1 1 a una longitud de onda de 334 nm 6,30 L mmol -1 cm -1 1 a una longitud de onda de 340 nm (estos valores pueden ser verificados con una muestra de sulfito) d = Camino óptico de la celda en cm (esto es, 1 cm). v = Volumen de la muestra (ml) en la celda, esto es 2,00 ml para azúcar ó 0,20 ml para jarabes Para azúcar se obtiene: Para jarabe se obtiene: El resultado final se obtiene multiplicando los resultados anteriores por factor de dilución utilizando durante la preparación de la muestras. NOTA- El empleo de kits con reactivos listos para usar puede requerir modificaciones delos volúmenes y los cálculos presentados anteriormente. Estas modificaciones se encuentran en las instrucciones del kit. -4-
6 8.2 Precisión. Para azúcar blanco con un contenido en sulfitos en el rango de 4,02 mg/kg a 23,84 mg/kg la repetibilidad se encuentra entre 1,17 mg/kg y 6,49 mg/kg con una repetibilidad promedio de 4,46 mg/kg. Para los mismos azucares blancos, la reproducibilidad se encuentra en el rango de 1,74 a 14,58, con una reproducibilidad promedio de 7,32 mg/kg. NOTA: Esta información fue calculada por MAG Godshall y MANemeth a partir de datos de ensayos interlaboratorios que se presentaron en el General Subject -5-
7 Z.3 BASES DE ESTUDIO Libro de métodos 2011, Método GS2/ 3-35 Determinación de sulfitos en productos de azúcar refinado excluyecdo los azucares morenos, por medio de un método enzimático Oficial. Determinación de sulfitos en azúcares morenos ICUMSA), Bartens, Berlin,
8 INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA Documento: NTE INEN 274 TÍTULO: AZUFRE AZUCAR. DETERMINACIÓN DEL DIOXIDO DE Código: ORIGINAL: Fecha de iniciación del estudio: REVISIÓN: La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma Oficialización con el Carácter de Obligatoria por Resolución No. publicado en el Registro Oficial No. Fecha de iniciación del estudio: Fechas de consulta pública: No se realizó Subcomité Técnico de: Fecha de iniciación: Integrantes del Subcomité: NOMBRES: Fecha de aprobación: INSTITUCIÓN REPRESENTADA: Mediante compromiso presidencial N 16364, el Instituto Ecuatoriano de Normalización INEN, en vista de la necesidad urgente, resuelve actualizar el acervo normativo en base al estado del arte y con el objetivo de atender a los sectores priorizados así como a todos los sectores productivos del país. Para la revisión de esta Norma Técnica se ha considerado el nivel jerárquico de la normalización, habiendo el INEN realizado un análisis que ha determinado su conveniente aplicación en el país. La Norma en referencia ha sido sometida a consulta pública por un período de 30 días y por ser considerada EMERGENTE no ha ingresado a Subcomité Técnico Otros trámites: Esta NTE INEN 274 (2012), azúcar. Determinación del dióxido de azufre reemplaza a la NTE INEN 274 (1978) La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma Oficializada como: Por Resolución No. Registro Oficial No.
9 Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre Casilla Telfs: (593 2) al Fax: (593 2) Dirección General: direccion@inen.gob.ec Área Técnica de Normalización: normalizacion@inen.gob.ec Área Técnica de Certificación: certificacion@inen.gob.ec Área Técnica de Verificación: verificacion@inen.gob.ec Área Técnica de Servicios Tecnológicos: inenlaboratorios@inen.gob.ec Regional Guayas: inenguayas@inen.gob.ec Regional Azuay: inencuenca@inen.gob.ec Regional Chimborazo: inenriobamba@inen.gob.ec URL:
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