GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS FARMACOGNOSIA

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1 Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Laboratorio de Productos aturales GUÍA DE TRABAJS PRÁCTICS FARMACGSIA Docente coordinador asignatura: Dra. Carla Delporte V. Docentes encargados TPs: Dr (c). Marcelo Peña C. Dr (c). Gabriela Valenzuela B. 2014

2 Tabla de contenidos Tabla de contenidos Calendario de actividades prácticas... 3 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia... 4 I. Descripción de los heterósidos... 4 II. Cromatografía en capa fina Apunte 2: Aspectos reglamentarios de productos en base a plantas Seminario Seminario Antraquinonas Trabajo Práctico 1: Antraquinonas Flavonoides Trabajo práctico 2: Flavonoides Taninos y Saponinas Parte I: Taninos Trabajo práctico 3: Parte I Taninos Parte II: Saponinas Trabajo práctico 3: Parte II Saponinas Alcaloides Trabajo práctico 4: Alcaloides Resina y Esencias Parte I: Resina Trabajo práctico 5: Parte I Resina Parte II: Esencia Trabajo práctico 5: Parte II esencias Trabajo de investigación

3 Tabla de contenidos Calendario de actividades prácticas Las actividades en los Trabajos Prácticos (TP) de Farmacognosia constan de ocho sesiones, las cuales se han programado de la siguiente manera: Actividad Semana lectiva Tema Responsable Seminario 1 Semana 2 Aspectos regulatorios en productos naturales MP Seminario 2 Semana 4 Análisis de artículos científicos basados en productos naturales MP/GV TP1 Semana 5 Antraquinonas GV TP2 Semana 7 Flavonoides MP TP3 Semana 9 Taninos y saponinas GV TP4 Semana 12 Alcaloides MP TP5 Semana 13 Resinas y esencias GV TP6 Semana 14 Defensa del trabajo de investigación CDV/GV/MP Ayudantes CDV: Dra. Carla Delporte Vergara; GV: Dr (c). Gabriela Valenzuela B.; MP: Dr (c). Marcelo Peña C. Ayudantes alumnos: - Martes: QF Catalina Figueroa - Miércoles: QF Daniela Jara - Jueves: Italo Bugueño - Viernes: Dr (c). Jorge Arancibia 3

4 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia I. Descripción de los heterósidos Los heterósidos o glicósidos constituyen uno de los grupos más grandes de principios activos que se encuentran en el reino vegetal. Se forman por combinación del grupo reductor de una osa (glicón) con una sustancia no glucídica llamada aglicona o genina y con eliminación de una molécula de agua. La unión entre la genina y la sustancia glucídica puede ocurrir a través de distintas funciones: -heterósidos (figura 1). Entre la función reductora de una osa y el grupo hidroxilo (alcohol o fenol) de la aglicona 1 R R 2 R 1 R 2 osa genina Figura 1: Formación -heterósidos S-heterósidos Entre la función reductora de una osa y el grupo tiol (figura 2). 1 R S R 2 R 1 S R 2 osa genina Figura 2: Formación S-hetérosidos -heterósidos Entre la función reductora de una osa y el grupo amino de una aglicona (figura 3). 4

5 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia 1 R R 2 R 1 R 2 osa genina Figura 3: Formación -hetérosidos C-heterósidos Formados por la unión de una osa y una genina a través de los átomos de carbono (figura 4). Los C-heterósidos se caracterizan por ser sustancias difícilmente hidrolizables, a diferencia de los tres primeros que se pueden hidrolizar por calentamiento en medio ácido, el enlace C-C sólo se rompe después de una hidrólisis oxidativa. R 2 1 R C R 2 R 3 R 1 C R 3 osa genina Figura 4: Formación C-hetérosidos Ejemplos: -heterósidos 1. eterósidos de alcoholes simples eterósidos cianogenéticos: Son heterósidos de nitrilo alcoholes (figura 5). C C 2gl C C amigdalósido amigdalonitrilo Figura 5: eterósidos cianogenéticos 5

6 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia Rosaceae. Este heterósido "amigdalósido" se encuentra en las almendras amargas Prunus amigdalus 2. eterósidos de fenoles simples Este grupo se forma por la unión de ácidos fenólicos como el ácido gálico y un azúcar constituyendo un éster, la unión se hace por el grupo carboxilo del ácido y la función reductora del azúcar (figura 6). Este compuesto se encuentran en la nuez de agalla, droga constituida por una excrecencia provocada por la picadura de un insecto Cynips tinctoria sobre el árbol Quercus infectoria, Fagaceae. 5 C C C C C C glucosa ácido gálico penta--galoil-glucosa Figura 6: eterósidos de fenoles simples 3. eterósidos esteroídicos a) eterósidos cardiotónicos: son los heterósidos que se encuentran en la Digitalis purpurea, Escrofulariaceae. Uno de ellos es el glucósido purpúreo A (cardenólido), que está constituido por: digitoxigenina + 3 mol digitoxosa (desoxiazúcar en la cual un hidroxilo es reemplazado por un ) + 1 mol glucosa. b) Saponósidos: son heterósidos que se caracterizan por sus propiedades tensioactivas que se manifiestan como buenos emulsificantes. Las geninas pueden ser: esteroidales o triterpénicas. 4. eterósidos antraquinónicos Las hidroximetil antraquinonas son constituyentes de numerosos laxantes. También se encuentran en la naturaleza en las formas reducidas como antronas y antranoles que son inestables y al estado libre se transforman rápidamente en antraquinonas. 6

7 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia 5. eterósidos cuyas geninas tienen núcleo heterocíclico eterósidos flavónicos: son heterósidos muy abundantes en la naturaleza, responsables de la coloración en vegetales y poseen variada acción farmacológica. Son derivados de la fenil cromona (figura 7). γ-pirona cromona fenilcromona C C ramnoglucósido de quercetol o rutina Figura 7: eterósidos flavónicos S-heterósidos Se encuentran en la familia de las Cruciferae, dentro de las cuales tenemos: Brassica nigra o Sinapis nigra L., cuyo nombre vulgar es mostaza negra, con su glucósido el alil-sevenol o sinigrina (figura 8). K S S C C KS 4 CS 2 C C C 2 isotiocianato de alilo C 2 Figura 8: S-heterósidos -heterósidos Se encuentran en la levadura de cerveza, extracto de té, remolacha, hongos, páncreas, hígado, etc. Un buen ejemplo son los nucleósidos que son heterósidos de la ribosa con adenina (figura 9). 7

8 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia 2 adenosina adenina ribosa 2 Figura 9: -heterósidos C-heterósido (figura 10). En este grupo se encuentra la aloína (heterósido antraquinónico) y C- heterósidos flavónicos aloína o barbaloína Figura 10: C-heterósidos Las geninas de todos los heterósidos pueden presentar estructuras muy variadas: alcoholes, nitriloalcoholes, fenoles, esteroles, lactonas, tioles, bases nitrogenadas, etc. Las osas que los constituyen pueden ser glucosa, fructosa, galactosa, manosa, ramnosa, etc. En los heterósidos cardiotónicos, existen los desoxiazúcares en los cuales el grupo hidroxilo es reemplazado por un átomo de, como la digitoxosa que es la 2-desoximetilpentosa. A la genina se pueden unir varios azúcares, ya sea en un mismo o en diferentes puntos, así tenemos biósidos, triósidos, etc., habiéndose encontrado heterósidos hasta con 7 moléculas de azúcar (saponósidos). Muchas veces la osa está constituida por un ácido urónico (glucurónico, galacturónico). 8

9 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia Los heterósidos pueden también sufrir, además de la hidrólisis ácida que es específica, hidrólisis enzimática. A menudo es necesaria la acción de varias enzimas en forma sucesiva para obtener la genina. En la mayor parte de los casos, el producto de hidrólisis es menos activo que el heterósido inicial, de ahí la necesidad de destruir las enzimas, es decir, estabilizar las drogas. o existen métodos de extracción generales, si no específicos para cada grupo. Para investigar los heterósidos se utilizan reacciones debidas a las osas y a las geninas, siendo estas últimas las más empleadas 9

10 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia II. Cromatografía en capa fina La cromatografía es un método de análisis en el cual una fase móvil pasa a través de una fase estacionaria de tal forma que una mezcla se separa en sus distintos componentes. El término cromatografía en capa fina (c.c.f.) implica que una mezcla se separa cromatográficamente a través de una fase estacionaria que consiste en una fina capa de un sustrato sólido. Factor de retardo (Retardation factor): R f Indica la posición de la zona de la sustancia (mancha) en una placa cromatográfica. Se define como el cociente obtenido dividiendo la distancia entre la mancha y la línea de origen con la distancia entre el frente de solvente y la línea de origen. Rf = Z! Z! Z! R f Z s Z f Z 0 : Factor de retardo : Distancia entre la zona de la sustancia y la línea de origen [mm] : Distancia entre la zona de frente del solvente y la línea de orígen [mm] : Distancia entre el nivel del solvente y la línea de origen [mm] El valor de Rf será siempre 1 el cual puede ser amplificado por 100, obteniendo como número entero lo que en literatura se puede encontrar como hr f para describir cualitativamente las placas de c.c.f (figura 11). Figura 11: btención del factor de retardo en c.c.f 10

11 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia Al contar con estándares y/o literatura de referencia, a través de c.c.f., se pueden realizar identificaciones preliminares confirmando la presencia de compuestos en la muestra o también observar que o cuantos compuestos existen. El gel de sílice es un ejemplo de fase estacionaria polar, por lo que al utilizarla para separar compuestos de una muestra, los polares presentarán mayor afinidad por ella y obtendrán Rfs de menor valor en comparación a los compuestos de naturaleza más apolar los cuales avanzarán de acuerdo a la afinidad que tengan por la fase móvil (figura 12). Apolar Polar Ácido Acético Alcohol Acetona Acetato de Etilo Diclorometano Cloroformo Benceno exano - Éter de petróleo Figura 12: Separación de los compuestos en c.c.f de acuerdo a la polaridad Dependiendo de los tipos de compuestos en estudio, las placas pueden ser reveladas con reactivos reveladores u observadas bajo luz ultravioleta (compuestos resonantes). Precauciones importantes: Siempre la atmósfera interna de la cámara donde se hará correr la fase móvil debe estar saturada del solvente. La línea de origen siempre debe estar por sobre el nivel del solvente. 11

12 Apunte 1: Introducción a la Farmacognosia Etapas de la c.c.f 1. Sembrar la muestra en la fase estacionaria (placa de gel de sílice F 454 ) a 1 cm de la base. 2. Colocar la placa en la cámara cromatográfica que contiene la fase móvil. 3. Una vez que la fase móvil (disolvente o mezcla de ellos) haya avanzado hasta quedar 1cm del tope de la placa, retirarla y marcar con lápiz grafito hasta donde avanzó el disolvente. Luego secar y revelar. 4. Medir las distancias recorridas por el soluto y por el solvente en la placa y calcular el Rf figura 13). ds dm Rf = dm / ds Figura 13: Pasos para la realización de una c.c.f Ejemplo: Figura 14: Identificación de teofilina, teobromina y cafeína (revelado en lámpara UV 254 nm) (a) Cromatografía en capa fina (sílica gel 60 F 254) (b) Cromatografía de fase reversa (RP-18) 1=teofilina 10 µg; 2= teobromina 10 µg; 3= cafeína µg y 4= mezcla de 10 µg de cada compuesto (teofilina, teobromina y cafeína). Referencia: Elke ahn-deinstrop,

13 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile Apunte 2. Clasificación de productos en base a plantas comercializados en Chile La Farmacognosia es el estudio de las materias primas de origen natural, principalmente plantas, destinadas en su mayoría, al descubrimiento de nuevas alternativas terapéuticas y la preparación de medicamentos. asta el día de hoy, se mantiene un alto uso medicinal de especies vegetales y algunas de estas han llegado incluso a ser aceptados por la MS como alternativa terapéutica de diversas enfermedades. Lamentablemente, los medicamentos creados en base a especies vegetales como los fitofármacos, son muchas veces considerados inocuos por la población. Debido a lo peligroso que puede resultar esta creencia, los profesionales Químicos Farmacéuticos son los responsables de educar a la población respecto a este tema. De esta manera cada droga vegetal debe ser estudiada científicamente, para obtener información sobre sus propiedades farmacológicas y su toxicidad. En base a esto, los productos naturales en Chile, deben cumplir con las exigencias establecidas en el Reglamento del sistema nacional de control de los productos farmacéuticos de uso humano (D.S. 3 del Ministerio de Salud, Subsecretaría de Salud Pública), cuyo cumplimiento será fiscalizado por el Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) quién otorga el registro sanitario, es decir la autorización para que estos sean comercializados. La reglamentación también establece la clasificación que cada producto obtiene antes de salir al mercado: a) Fitofármacos: Son fitofármacos, aquellas especialidades farmacéuticas cuyos ingredientes activos provienen de las partes aéreas o subterráneas de plantas u otro material vegetal y están debidamente estandarizados (Art 14 del D.S. 3). Esta estandarización se puede realizar valorando todos los componentes activos de la droga vegetal o utilizando un marcador vegetal, el cual consiste en un compuesto específico presente en la droga vegetal. Para la autoridad sanitaria, un fitofármaco es tratado de la misma manera que un medicamento sintético (fármaco), por lo que su registro debe cumplir con las mismas exigencias de estos. Sin embargo, de acuerdo al Art.40 del D.S. 3, se deben tomar en cuenta las siguientes precisiones: 1) La seguridad deberá ser avalada con la presentación de estudios pre-clínicos, toxicológicos en animales y clínicos fase I, mientras que la eficacia debe ser avalada con estudios clínicos fase II y III. 13

14 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile En los casos en que exista información proveniente de literatura oficial de los diferentes organismos internacionales o extranjeros, tales como MS, FDA o EMEA; al momento de solicitar un registro sanitario, esta se aceptará como válida en reemplazo de lo solicitado en el párrafo anterior. 2) Las solicitudes de registro deberán ceñirse a los establecido en los requisitos generales del registro de medicamentos de uso humano, con las siguientes reglas especiales: a. o se requiere la presentación de estudios de bioequivalencia, los cuales si son obligatorios para los fármacos tradicionales. b. Se debe incluir la descripción del proceso de fabricación, el cual debe cumplir con las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM o GMP en inglés). c. Su denominación genérica corresponderá a la denominación taxonómica botánica del vegetal que aporta el o los ingredientes activos. d. La expresión de su fórmula cuali-cuantitativa deberá incluir: el tipo de preparación vegetal empleada, tales como extracto seco, extracto fluido, extracto blando, polvo u otro; seguido de la o las partes del material vegetal empleado, con su nombre científico, concentración y estandarización en base a un marcador vegetal, cuando corresponda. e. o se pueden incluir sustancias estupefacientes o psicotrópicas, ni mezclas con medicamentos alopáticos. f. La identidad y pureza de los componentes se establecerá de acuerdo con lo que dispongan las farmacopeas o las fuentes de información científica internacionales o extranjeras, debiendo presentarse la correspondiente validación de la metodología analítica propuesta. g. La metodología analítica para la evaluación del producto terminado así como sus materias primas, deberá aparecer en alguna de las farmacopeas oficialmente aceptadas en nuestro país (listado aparece en el Art. 33 del reglamento) o en fuentes de información científica extranjeras o se deberá presentar su correspondiente validación. Para los efectos de establecer la identidad, potencia, pureza, estabilidad y otros requisitos de calidad física, química, microbiológica y biofarmacéutica de los principios activos y de las formas farmacéuticas de los medicamentos cuyo registro se solicite, el Instituto se ceñirá a las normas pertinentes contenidas en las siguientes farmacopeas y sus suplementos: 14

15 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile i. Farmacopea Chilena. ii. Farmacopea Internacional. iii. Farmacopea Europea. iv. Farmacopea de Estados Unidos y The ational Formulary. v. Farmacopea Británica. vi. Farmacopea Francesa. vii. Farmacopea Alemana. viii. Farmacopea omeopática Alemana. ix. Farmacopea Wilmar Schwabe. x. Farmacopea omeopática de USA. xi. Farmacopea omeopática de México. xii. Farmacopea Japonesa. xiii. Farmacopea Española. xiv. Farmacopea de México. xv. Farmacopea Brasileña. h. Debe cumplir con las especificaciones de producto terminado de acuerdo a la forma farmacéutica en que ellos se presentes, exceptuando la valoración de los principios activos, en el cual se puede considerar un marcador vegetal específico. i. o se consideran fitofármacos los productos que contienen principios activos aislados o sintéticos, aunque provengan de una materia prima de origen vegetal. El producto terminado (figura 15) deberá cumplir las mismas especificaciones en el control de calidad que un medicamento normal, estas implican ensayos físicos (caracteres organolépticos, dimensiones, control de peso, dureza, friabilidad, ensayo de desintegración, p, humedad, etc.), ensayos químicos (identidad del principio activo, identidad del colorante, valoración del principio activo, sustancias relacionadas, uniformidad de dosis unitaria, ensayo de disolución, etc.) y por último, ensayos microbiológicos (ensayo de esterilidad, ensayo de limite microbiano, ensayo de pirógeno, potencia o actividad entre otros). Cada cápsula contiene: Extracto Seco Estandarizado de ypericum perforatum L. 300 mg (equivalente a no menos de 900 mcg de ipericina (marcador vegetal). Excipientes c.s. Figura 15: Fitofármaco 15

16 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile b) Fármacos: Corresponden a los componentes aislados y definidos químicamente, los cuales pueden provenir de una droga vegetal o no, y no constituyen bajo ningún caso una preparación vegetal o un fitofármaco. Ejemplos pueden ser la Atropina, como se observa en la figura 16 (alcaloide químicamente aislado de la Atropa belladona) o la Digoxina (cardiotónico de margen terapéutico estrecho, aislado desde la Digitalis lanata). Figura 16: Fármaco c) Medicamento erbario Tradicional: Se entenderá por medicamentos herbarios tradicionales, a aquellos constituidos por las plantas o partes de plantas, frescas o desecadas, enteras o trituradas, envasadas y etiquetadas artesanalmente y rotuladas con la denominación utilizada por la costumbre popular en el ámbito de las tradiciones culturales chilenas. Se entenderán registrados para los efectos de su libre venta y distribución, por el solo hecho que la SEREMI competente haya autorizado el establecimiento donde se almacenan, elaboran, fraccionan o envasan o se realizan otras actividades propias de su procesamiento, debiendo cumplir las siguientes condiciones: i) Deberán estar en un listado elaborado por el Ministerio de Salud, en el cual se presentan 103 especies medicinales, señalándose la denominación, propiedades terapéuticas y usos de cada una de ellas, debiendo ser empleadas como auxiliares sintomáticos. ii) Estar envasadas artesanalmente como especies vegetales aisladas, no mezcladas. iii) Consignar en sus rótulos sólo aquellas propiedades reconocidas en el decreto aludido precedentemente. Ejemplos pueden ser una bolsa con hojas de Ruda o de Menta. 16

17 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile d) Suplementos Alimenticios: Corresponden a productos elaborados o preparados para suplementar la dieta con fines saludables y de esta manera, contribuir a mantener o proteger los estados fisiológicos característicos tales como adolescencia, embarazo, lactancia, climaterio y vejez. Pueden corresponder a un nutriente, mezcla de nutrientes u otros componentes presentes naturalmente en los alimentos, como lo son las vitaminas, minerales, aminoácidos, lípidos, fibras dietéticas o sus fracciones. Los suplementos alimentarios son una clase particular de alimentos y, como tales, se encuentran regulados por las disposiciones del Reglamento Sanitario de los Alimentos, D.S. º 977 de 1996, del Ministerio de Salud, no siendo competencia del ISP. Las SEREMIS de Salud, a lo largo de todo el país, son los entes encargados de fiscalizar los alimentos. e) Alimentos para deportistas: Son aquellos productos formulados para satisfacer los requerimientos de individuos sanos, en especial de aquellos que realicen ejercicios físicos pesados y prolongados. Se encuentran constituidos por un ingrediente alimentario o una mezcla de éstos. Se podrán adicionar uno o más nutrientes, como hidratos de carbono, proteínas, vitaminas, minerales y otros componentes presentes naturalmente en los alimentos, tales como cafeína o aquellos expresamente autorizados en el reglamento. o se pueden adicionar, solos ni en asociación, hormonas o compuesto con efecto anabolizante, sustancias con acción a nivel de sistema nervioso, salvo aquellas expresamente autorizadas en el reglamento. En el caso de agregar cafeína, esta sólo podrá ser incorporada en forma pura o por adición de uno o más ingredientes alimenticios que la contengan, de los cuales sólo se podrán utilizar café (Coffea spp.), té verde o té negro (Camelia sinensis o Thea sinensis), cacao (Thepbroma cacao), yerba mate (Ilex brasilensis e Ilex paraguarienses), nuez de cola (Kola spp.) y guaraná (Paullinia cupana), como tales o en forma de extractos. La tabla 1 describe las especies que también pueden ser incorporadas, como tal o en su forma de extracto en las cantidades máximas por porción de consumo habitual que se establecen: 17

18 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile Tabla 1: Especies vegetales que pueden incorporarse en alimentos para deportistas Ingrediente alimenticio Raíz de Panax ginseng C.A. Meyer (Ginseng Coreano, Ginseng Asiático o Ginseng riental) Fruto de Schizandra chinesis (Turcz.) Baill. (Chisandra) Raíz y rizoma de Eleuterococcus senticosus Rupr. Et Maxim. (Ginseng Siberiano) Cantidad máxima por día 1,0 g de raíz 1,5 g de fruto 2,0 g de raíz y rizoma f) ierbas Aromáticas y Especias (condimentos): La legislación permite la comercialización de algunas hierbas aromáticas y especias como alimento. Las hierbas aromáticas comprenden ciertas plantas o partes de ellas (raíces, rizomas, bulbos, hojas, cortezas, flores, frutos y semillas) que contiene sustancias aromáticas y que por sus sabores característicos, se destinan a la preparación de infusiones de agrado. Las hierbas aromáticas pueden expenderse enteras o molidas, solas o en mezclas con otras especies del mismo listado (tabla 2). En el reglamento de alimentos se nombran especies consideradas aromáticas, aun cuando, muchas de las nombradas en la lista, tienen una acción farmacológica comprobada. Así entonces, algunos té de hierbas de plantas con efectos farmacológicos se comercializan con resolución de alimentos. Tabla 2: Listado de hierbas aromáticas MBRE VULGAR MBRE CIETÍFIC PARTE USADA Albahaca cimum bacilicum L. ojas y sumidades floridas Alcachofa Cynara scolymus L. ojas Altamiza, artemiza Artemisia vulgaris L. ojas, tallo sumidades floridas Anís estrella Illicium verum Fruto Anís verde Pimpinella anisum Fruto Bailahuen aploppapus baylahuen Remy ojas Boldo Peumus boldus oja Buchú, buco Barosma betulinia Bartl ojas, flor Caléndula, china Calendula officinalis L. ojas, flor Canela Cinnamomum verum Presl Corteza Cedrón Aloysia triphylla oja Cilantro Coriandrum sativum L. ojas, tallo Cola de caballo Equisetum bogotense.k. Ramas Eucalipto Eucaliptus globulus oja inojo Foeniculum vulgare Fruto 18

19 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile Lechuguilla Cichorium intybus L. ojas, raíz Limón Citrus limus burm. f ojas y frutos Llantén siete venas Plantago lanceolata L. ojas Llantén siete venas Plantago major L. ojas Manzanilla Chamomilla recutita Flor con 20% de tallo Matico Buddleja globosa oja Mastuerzo Capsella bursa-pastoris Medik Flores, hojas, frutos Melisa o Toronjil dulce Melisa officinalis Parte aérea Menta Mentha piperita oja con 5% de tallo Menta verde Mentha viridis oja con 5% de tallo Menta poleo Mentha pulegium oja Menta bergamota Mentha citrata oja aranjero dulce Citrus sinesis sbeck ojas, flor y fruto. aranjo Citrus aurantium L. spp. ojas y flores régano riganum majorana L. Partes aéreas régano riganum vulgare L. Partes aéreas Paico Chenopodium ambrosioides Parte aérea Radal Lomatia hirsuta Diels ojas y tallos Romero Rosmarinus officinalis Parte aérea Rosa mosqueta Rosa moschata B.canina Fruto Salvia Salvia officinalis oja Sauco Sambucus nigra Flor Tilo Tilia platyphyllos Flor y brácteas Tilo Tilia officinalis Flor y brácteas Tomillo Tymus vulgaris Parte aérea Toronjil cuyano Marrubium vulgare L. ojas y flores. Las especias comprenden a plantas o partes de ellas (raíces, rizomas, bulbos, hojas, cortezas, flores, frutos y semillas) que contienen sustancias aromáticas, sápidas o excitantes, o sus alimentos y bebidas (tabla 3). Tabla 3: Listado de especias Anís común o verde Frutos desecados de Pimpinela anisum L. Anís estrellado Frutos del Illicium verum. Azafrán Filamentos de color rojo-anaranjado provenientes de los estigmas desecados de la flor de Croccus sativus L. Corteza desecada y privada en su mayor parte de la capa epidérmica, Canela de Ceylán proveniente del Cinnanonum zeylanicum. Toda canela que no corresponda a las características micro y macroscópicas del Ceylan, debe denominarse Canela común. Cardamomo Semillas de Elettaria cardamomum L. Clavo de olor Botones florales secos de Caryophillus aromaticus L. o Eugenia caryphillata T. Comino Frutos de Cuminum cyminum L. Comino alemán o alcaravea Frutos del Carum carvi L. 19

20 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile Curcuma Rizoma del Curcuma longa L. Curry Mezclas de especies de sabor picante, constituida por diversas especies como pimientas, jengibre, cúrcuma y otros condimentos. Jengibre Rizoma lavado y disecado de Zingiber officinalis R. Macis Envoltura o arilo que recubre la semilla de la nuez moscada Myristica fragans. Mejorana ojas y partes aéreas floridas del riganum majorana L. Menta piperita ojas y partes aéreas floridas de la Mentha piperita L. Mostaza blanca Semillas de la Sinapsis alba. Mostaza negra Semillas de la Brassica nigra L. uez moscada Semilla desecada de Myristica fragans., desprovista totalmente de su envoltura (macis) Pimienta blanca Fruto maduro y seco, privado de la parte exterior de su pericarpio, proveniente del Piper nigrum L. Pimienta negra Fruto incompletamente maduro y seco, proveniente del Piper nigrum L. Pimienta de Jamaica Fruto de Pimienta officinalis B. o Allspice. Pimienta de Cayena Frutos especialmente picantes del Capsicum frutescens. Vainilla Fruto inmaduro, fermentado y desecado de Vainilla olanifolia A. g) Productos Cosméticos: Corresponde a cualquier preparado (a partir de algún extracto de plantas o no) que se destine para ser aplicado externamente al cuerpo humano con fines de embellecimiento, modificación de su aspecto físico o conservación de las condiciones físico químicas normales de la piel y su anexos, comprendiendo en ellos las uñas, sistema piloso, membranas mucosas de la cavidad oral, dientes y órganos genitales externos (figura 17). Todo producto cosmético debe encontrarse registrado en el ISP, el cual es encargado de autorizar y fiscalizar debidamente la producción de estos productos, además de ser el encargado de que se cumpla el control de calidad de estos, con el fin de cumplir el Reglamento del SISTEMA ACIAL DE CTRL DE CSMÉTICS. Figura 17: Cosmético 20

21 Apunte 2: Clasificación de Productos en base a plantas comercializados en Chile Referencias de fuentes legales y reglamentarias Código Sanitario, D.F.L. º 725/68 Reglamento del Sistema acional de Control de los Productos Farmacéuticos de Uso umano, D.S. 3/10. Modificado por D. 54/13. Reglamento Sanitario de los Alimentos, D.S. 977/96. Modificado por D.18/13. Resolución 522 del Ministerio de Salud: Aprueba el listado de medicamentos herbarios tradicionales. Publicado 31/08/2007. Resolución 190 Ex del Ministerio de Salud: Complementa la resolución º 522/07 que aprueba listado de medicamentos herbarios tradicionales. Publicado 15 abril

22 Seminario 1 Seminario 1 Introducción a la Farmacognosia. Parte I 1. Los alumnos deben formar grupos de 5 personas, a cada grupo se le entregará distintos productos de origen vegetal que sean comercializados en Chile. En base a sus conocimientos sobre reglamentación, analice completamente el producto. 2. Cada grupo dispondrá además, de información complementaria que le permitirá describir a la droga vegetal (o a su principio activo) y su actividad farmacológica, en base a esta información, comente cualquier anormalidad que pudiesen presentar los productos y los riesgos posibles de su uso por parte de la población. 3. Cada grupo deberá entregar un informe escrito (máximo 3 páginas) y además realizar una exposición corta de sus resultados al finalizar el práctico. 22

23 Seminario 2 Seminario 2 Introducción a la Farmacognosia. Parte II Los alumnos deben analizar y presentar ante el resto de los alumnos y una comisión conformada por los profesores de TPs y el ayudante de su grupo, un artículo científico que le será otorgado en el seminario 1. La presentación en PowerPoint debe incorporar los siguientes ítems: Introducción. ipótesis. bjetivos. Metodología. Resultados. Discusión. Conclusión. Tiempo máximo de exposición 15 minutos. Luego de la presentación, los alumnos recibirán una serie de preguntas por parte de la comisión con respecto al trabajo asignado. 23

24 Antraquinonas Antraquinonas Desde la antigüedad se utilizaban distintas especies vegetales, tales como: sen, cáscara sagrada, frángula, ruibarbo, áloe y caña fístula entre otras, las cuales se caracterizaban por presentan constituyentes con efecto laxante o purgante. Al investigar su composición química se estableció, en todas ellas, la presencia de heterósidos antracénicos (antracenósidos). Estos metabolitos secundarios, por lo general, se hidrolizan fácilmente. 1. Estructura de las geninas (figura 18): Las geninas de estos heterósidos, según su estructura química se pueden clasificar en a) Antraquinonas: Los derivados antraquinónicos presentes en las drogas purgantes pueden ser: Dihidroxifenoles como el crisofanol Trihidroxifenoles como la emodina A menudo se encuentran presentes otros grupos como el metilo en el crisofanol, el hidroximetilo en la aloemodina y el carboxilo en la reína. Cuando estas sustancias se encuentran en el estado de heterósidos, el azúcar puede estar unido a cualquier grupo hidroxilo originando -heterósidos, siendo más frecuentes las uniones a los grupos hidroxilos del C-3, 6 y 8. También existen los C-heterósidos, al unirse el C-1 de la glucosa al C-10 de la genina, como es el caso de la aloína en el áloe y los cascarósidos en la cáscara sagrada. Los C-heterósidos son fuertemente resistentes a la hidrólisis ácida normal, de este modo es necesario someter a los C-heterósidos a una hidrólisis oxidativa con tricloruro férrico. b) Antranoles y antronas: Existen tanto libres como combinados en estado de heterósidos. Se trata de derivados antraquinónicos reducidos. Existen en estado de isómeros y en solución pueden pasar de un estado a otro (equilibrio ceto-enólico). La antrona es un producto amarillo pálido no fluorescente, insoluble en álcali; su isómero antranol es amarillo parduzco y da lugar a una fuerte fluorescencia en solución alcalina. c) xantronas: Se trata de un producto intermedio entre las antraquinonas y los antranoles. Dan antraquinonas por oxidación con peróxido de hidrógeno y se han encontrado entre los constituyentes de la cáscara sagrada. 24

25 Antraquinonas d) Diantronas: Son compuestos derivados de dos moléculas de antrona, que pueden ser idénticas o diferentes entre sí. Son geninas importantes en especies del género Cassia, Rheum y Rhamnus. Unas de las más conocidas son los senósidos, derivado de dos moléculas de reínantrona unida a dos moléculas de glucosa. Figura 18: Derivados antracénicos 2. Estructura de las osas Dentro de los azúcares que frecuentemente se encuentran unidas a estas geninas, cabe destacar la glucosa (en la cáscara sagrada y en el sen), la ramnosa (en el áloe y en la frángula) y la apiosa, una pentosa ramificada (en la frángula). 3. Propiedades fisicoquímicas Son sólidos cristalizables, coloreados de amarillo, anaranjado o rojo. Con los álcalis se disuelven dando coloraciones que van desde el anaranjado al rojo vivo o violáceo, que sirve para caracterizarlos y además valorarlos. Las geninas son solubles en disolventes orgánicos apolares como por ejemplo éter, diclorometano, cloroformo, mientras que los heterósidos son medianamente solubles en agua y solubles en alcohol y mezclas hidroalcohólicas. 25

26 Antraquinonas 4. Reacción de identificación a) Reacción de Bornträger: se utiliza frecuentemente para investigar la presencia de principios antraquinónicos en vegetales. Esta reacción consiste en agregar un reactivo alcalino como amoníaco, solución de hidróxido de sodio o de potasio directamente a la droga en polvo o a un extracto y se basa en la coloración roja que dan los derivados antraquinónicos en medio alcalino, la aparición de esta coloración indicará la presencia de agliconas libres oxidadas y la intensidad del color será proporcional a la concentración de principios activos. 5. Valoración de drogas antracénicas En general, la valoración de las drogas antraquinónicas puede estar orientada a conocer el contenido total de estos compuestos o algún grupo de ellos en particular, como geninas oxidadas, geninas reducidas, -heterósidos o C-heterósidos. La valoración de drogas antracénicas puede realizarse mediante espectrofotometría basándose en la reacción de Bornträger. Para ello se realiza una extracción de las antraquinonas libres con un disolvente adecuado, por ejemplo diclorometano, cloroformo o éter, posteriormente se elimina el disolvente, se resuspende el residuo en una solución de álcali y se determina su absorbancia. En el caso de las drogas que contienen heterósidos, es necesario realizar previamente una hidrólisis ácida (generalmente se emplea Cl o 2 S 4 ) en condiciones oxidativas para transformar los derivados antraquinónicos en antraquinonas libres. Los valores de absorbancia obtenidos se comparan con una curva de calibración realizada con cantidades conocidas de 1,8-dihidroxiantraquinona o con emodol (figura 19). R 1 R 2 R 1 = R 2 = C 3 : crisofanol C 2 : aloe- emodol C : reína R 1 = R 2 = C 3 : emodol Figura 19: Estructura de antraquinonas que se pueden emplear para realizar curvas de calibración en las valoraciones de derivados antraquinónicos 26

27 Antraquinonas 6. Especies vegetales que poseen antraquinonas 6.1. Sen: Sen, Sen de la India (sen de Tinnevelly), Cassia angustifolia Vahl. Sen, Sen de Kartum (sen de Alejandría), Cassia acutifolia Del. = Cassia senna L. Figura 20: Derivados antraquinónicos presentes en el sen 6.2. Aloe: Aloe ferox Mill., Aloe vera L., Liliaceae, n.v. aloe, acíbar Formas libres aloe-emodol C 2 aloe-emodol Figura 21: Estructura aloe-emodol, genina libre presente en el aloe vera. 27

28 Antraquinonas eterósidos: C-heterósidos glucosa aloína o barbaloína C 2 glucosa aloinósido A ramnosa C 3 glucosa aloinósido B ramnosa C 3 Figura 22: C-heterósidos presentes en el aloe vera. 28

29 Antraquinonas 6.3. Cascara sagrada Rhamnus purshiana D.C., Rhamnaceae; n.v. cascara sagrada Formas libres eterósidos -terósidos: heterósidos de las formas libres. C-eterósidos glucosa aloína o barbaloína C 2 C 3 crisaloínas A y B (10 β y 10 α resp.) glucosa C 2 glucosa cascarósidos A y B (10 β y 10 α resp.) Figura 23: heterósidos presentes en la cascara sagrada 29

30 Trabajo práctico 1: Antraquinonas Trabajo Práctico 1: Antraquinonas 1. Extracción de heterósidos antracénicos Se realizará con foliolos de sen, corteza de cáscara sagrada y corteza de frángula. Coloque 0,3 g de cada una de las drogas vegetales en un vaso de precipitado. Agregue ml de metanol a cada vaso, macere a temperatura ambiente y filtre a través de papel filtro. 2.- Reacción colorimétrica de antraquinonas libres y oxidadas. Se realizará con foliolos de sen o corteza de cáscara sagrada. Coloque 0,5 g de cáscara sagrada o sen en un vaso precipitado de 50 ml. Agregue 10 ml de agua destilada y agite durante 3 minutos. Filtre con papel filtro y traspase a un tubo de ensayo. Deje tubo en una gradilla y agregue 1 ml de 2 S 4 al 50% (no tome el tubo con la mano). Caliente en un baño termoregulado durante 15 minutos y luego deje enfriar. Traspase a un embudo de decantación y agregue 10 ml de diclorometano. Agite cuidadosamente la solución bifásica contenida en el embudo para extraer los compuestos de interés desde la fase acuosa hacia la fase orgánica. Separe la fase orgánica recibiéndola en un tubo de ensayo. Retire 1 ml de esta fase orgánica y guárdela para realizar el análisis cromatográfico del punto 5. A la fase orgánica restante agregue 2 ml de una solución de a al 5% en 3 al 2%. Agite durante 1 minuto y luego de transcurrido 5 minutos observe una coloración rojo-cereza en la fase acuosa. 3. Extracción de compuestos antraquinónicos oxidados totales provenientes de heterósidos. idrólisis ácida y extracción con disolvente orgánico. Se realizará con corteza de cáscara sagrada. Coloque 0,3 g de cáscara sagrada en un balón de fondo redondo de 250 ml. Agregue 30 ml de 2 S 4 al 20%. Caliente a reflujo durante 30 minutos. 30

31 Trabajo práctico 1: Antraquinonas Deje enfriar y filtre a través de lana de vidrio a un embudo de decantación, lavando con 3 porciones de 10 ml (30 ml) de C 2 Cl 2. Agite cuidadosamente la solución bifásica contenida en el embudo para extraer los compuestos de interés desde la fase acuosa hacia la fase orgánica. Separe la fase orgánica recibiéndola en un vaso de precipitado. 4. Extracción de derivados de diantrona y residuos procedentes de -heterósidos. idrólisis ácida oxidativa y extracción con disolvente orgánico. Se realizará con foliolos de sen. Coloque 0,3 g de foliolos y/o frutos de sen en un balón de fondo redondo de 250 ml y agregue 30 ml de agua. Agite enérgicamente. Agregue 20 ml de cloruro férrico al 10% (FeCl 3 ) y 10 ml de solución de Cl al 10%. Agite y caliente a reflujo por 20 minutos. Enfríe y filtre a través de lana de vidrio a un embudo de decantación, lavando con 3 porciones de 10 ml (30 ml) de C 2 Cl 2. Agite cuidadosamente la solución bifásica contenida en el embudo para extraer los compuestos de interés desde la fase acuosa hacia la fase orgánica. Separe la fase orgánica recibiéndola en un vaso de precipitado. 5. Análisis cromatográfico. Realice una c.c.f. utilizando como fase estacionaria gel de sílice y como fase móvil acetato de etilo:metanol:agua en proporciones de 100:13,5:10 respectivamente. Siembre los extractos globales obtenidos en la etapa 1 y los extractos hidrolizados resultantes de las etapas 2, 3 y 4. bserve a la luz UV y revele con K al 10% en etanol. Marque con lápiz grafito las manchas correspondientes a derivados antraquinónicos. Calcule los Rf. bservación: anote las coloraciones observadas antes y después de revelar. v Con K las antraquinonas presentan coloración roja al visible y al UV-365 nm. Las antronas y antranoles presentan coloración amarilla al visible y amarillo brillante al UV-365 nm. Las diantronas no reaccionan. 31

32 Trabajo práctico 1: Antraquinonas 6. Valoración de antraquinonas libres y oxidadas Se realizará con corteza de frángula. Coloque 1,25 g de droga vegetal en un vaso precipitado de 50 ml. Agregue 20 ml de C 2 Cl 2 y agite durante 5 minutos. Filtre con lana de vidrio a un matraz aforado de 25 ml y afore (solución A). Tome 1 ml de la solución A y viértala sobre una cápsula de porcelana. Lleve a sequedad la cápsula de porcelana en un baño termoregulado. Disuelva el contenido de la cápsula de porcelana con K al 10%. Filtre la solución con papel filtro en un matraz aforado de 10 ml y afore. Leer en un espectrofotómetro a 500 nm frente a un blanco de K al 10%. Interpole la absorbancia obtenida en una curva de calibración de 1,8- dihidroxiantraquinona o de emodol (será entregada en el trabajo práctico). Realice los cálculos del contenido de antraquinonas libres y oxidadas de la frángula. Considere el factor de dilución en sus cálculos. 32

33 Flavonoides Flavonoides Los flavonoides son sustancias de naturaleza fenólica muy difundidos en el reino vegetal, que contribuyen a dar color a los frutos, flores y hojas. Poseen un esqueleto de quince átomos de carbono, repartidos según la frecuencia C 6 -C 3 - C 6, en la cual los anillos bencénicos A y B están unidos por un elemento de tres átomos de carbono (figura 24). C C C 7 6 A C 3 4 C 2' 3' 1' B 4' 6' 5' Figura 24: Secuencia de flavonoides C 6-C 3-C 6 (2 anillos bencénicos unidos por elemento de 3 C) 1. Estructura de las geninas Las geninas de los heterósidos flavónicos derivan del núcleo fenilcromona sobre el cual se fijan varios grupos hidroxilo fenólicos. Si el grupo fenilo se fija en el C-2 de la cromona tenemos las flavonas y si se encuentra fijo en el C-3 da origen a las isoflavonas. Las flavonas que poseen un grupo en el C-3 constituyen los flavonoles y aquellas geninas con la ausencia del doble enlace en 2,3 se denominan flavanonas (figura 25). 3' 8 1 2' 1' 4' 5' 7 2 6' Fenilcromona 4 Flavonas Flavonoles Isoflavonas Flavanonas Figura 25: Clasificación flavonoides 33

34 Flavonoides 2. Estructura de las osas La parte osídica puede ser muy sencilla, reducida a una osa común como la glucosa, ramnosa, xilosa, o a un oligosacárido como un disacárido en el caso de la rutina (α-l-ramnosil(1->6)β- D-glucosa). Los -heterósidos son los más frecuentes, donde la unión entre la genina y la parte osídica se realiza preferentemente por intermedio del hidroxilo unido al C-7 en las flavonas y por el hidroxilo unido al C-3 en los flavonoles, lo que no excluye otras posibilidades. La mayor diversidad estructural de los heterósidos, se presenta en los flavonoles, exitiendo más de cien heterósidos cuya genina es el quercetol, y lo mismo ocurre para el canferol. También se pueden encontrar C- heterósidos en los que la unión se establece entre el carbono anomérico de la osa y el carbono 8 o 6 de la genina, siendo esta la mayoría de las veces una flavona. 3. Propiedades físico-químicas: Si bien, por regla general, los heterósidos son hidrosolubles y solubles en los alcoholes, hay algunos que tiene una solubilidad poco marcada en agua. Las geninas en cambio son solubles en solventes orgánicos medianamente polares. Los flavonoides, por presentar grupos cromóforos en su molécula, pueden absorber la energía luminosa emitida por la luz ultravioleta (UV λ= nm), presentando una fluorescencia característica que puede cambiar de coloración después de la exposición a vapores de amoníaco o a otros reactivos tales como AlCl 3, K, etc. 4. Análisis cualitatitivo y cuantitativo de flavonoides 4.1. Reconocimiento La Reacción de Shivata o Reacción de la Cianidina permite el reconocimiento de flavonoides. Esta reacción se fundamenta en que, al poner en contacto ácido clorhídrico con magnesio metálico se genera hidrógeno, este último reduce al flavonoide desarrollando coloraciones que van del rojo anaranjado al violeta (figura 26). En el caso de los flavonoles, el color obtenido es rojo cereza. Flavonoide (rutina) Cloruro de cianidina Figura 26: Reacción de shivata 34

35 Trabajo práctico 2: Flavonoides Trabajo práctico 2: Flavonoides 1. Preparación de un extracto de ruda estabilizado y purificado Ruta graveolens (ruda) es un arbusto pequeño, de hojas carnosas y de flores amarillas en cimas terminales. Tiene un intenso olor desagradable, sabor amargo y acre. Las hojas poseen glándulas que contienen una esencia irritante y la manipulación de ellas estando frescas producen ampollas en la piel. Las hojas contienen: 1 % de aceite esencial: metil nonil cetona, metil heptil cetona, metil octil cetona 2 % de rutósido = rutina (ramnoglucósido del quercetol) La ruda se usa como antiespasmódico por su contenido de aceite esencial. Se ha observado que a concentraciones mayores (0,05 0,10 g) es emenagoga. Se conoce además, desde hace mucho tiempo como abortiva. La toxicidad se le atribuye a la metil nonil cetona. La rutina o rutósido es muy poco tóxica. Este flavonoide también se encuentra en: cáscara de naranjas, trigo sarraceno (hojas), grosellas negras y otras, y en la Sophora japonica. Para la preparación del extracto, las hojas frescas son estabilizadas por la acción del metanol hirviente que solubiliza al mismo tiempo los heterósidos. El extracto concentrado es disuelto en agua, esta purificación permite eliminar la clorofila, cuya intensa coloración enmascara ciertas reacciones de caracterización. El extracto de ruda estabilizado que Ud. recibirá en su trabajo práctico fue preparado de la siguiente manera: Pese aproximadamente 30 g de hojas de ruda y tritúrelas en un mortero. Agregue aproximadamente 100 ml de metanol hirviente sobre las hojas trituradas. Caliente a reflujo durante 30 min. Filtre a través de lana de vidrio y transfiera a un balón. Concentre el extracto en un evaporador rotatorio. Disuelva el residuo seco en 20 ml de agua y filtre a través de filtro mojado para eliminar la clorofila. 35

36 Trabajo práctico 2: Flavonoides 2. Preparación de un extracto alcohólico de cáscara de naranja Los citrus (Rutaceae) son árboles de origen oriental cuyas numerosas especies, variedades e híbridos se cultivan por sus frutos con endocarpio comestible. Muy utilizados por sus aceites esenciales, son también fuente de pectinas y flavonoides. Estos últimos, muy abundantes en el pericarpio, son sobre todo heterósidos de flavanonas (hesperidósido, neohesperidósido, naringósido (naringina), eriodictiósido, etc. Estructuralmente, estos heterósidos implican a dos ramnósidos que se diferencian por su forma de unión a geninas trisustituidas (naringenina, isosacuranetina) o tetrasustituidas (hesperetol) con las cuales se unen por medio de su hidroxilo en C 7. Para la preparación de un extracto alcohólico de cáscara de naranja, se deben seguir los siguientes pasos: Coloque aprox. 5 g de cascara de naranja en un balón de fondo redondo (no olvide agregar perlas de ebullición) y agregue 30 ml de Me. Conecte el equipo y caliente a reflujo durante 15 min. Deje enfriar y filtre el contenido en papel Whatman Reconocimiento de flavonoides 3.1. bservación a la luz UV y revelado con AlCl 3 y vapores de amoníaco Siembre el extracto de ruda y el de cáscara de naranja en un papel Whatman º 1, junto con patrones de rutina, quercetina y naringenina. ágalo en triplicado: -Papel 1: observe la fluorescencia a la luz U.V. a 254 y 366 nm. -Papel 2: revele con vapores de amoníaco, observe la coloración al visible y cambios de fluorescencia a la luz UV, compare con los patrones. Los álcalis colorean de amarillo vivo a la mayor parte de los flavonoides. bservar la coloración amarilla viva de la muestra y compararla con la de un testigo no tratado. -Papel 3: revele con AlCl 3 al 3%. Después de pulverizar, observe la coloración al visible y la fluorescencia a la luz U.V. ota: En presencia de AlCl 3, los flavonoles presentan bajo la luz UV 366 nm una intensa fluorescencia verde, oponiéndose al color café del testigo no tratado. 36

37 Trabajo práctico 2: Flavonoides 3.2. Reacción de Shivata o Reacción de la cianidina. Coloque en distintos tubos de ensayos, 1 ml de cada extracto preparado en los puntos anteriores y en otros tubos de ensayo, 1 ml de los patrones de rutina, quercetina y naringenina. A cada tubo de ensayo, agregue 1 ml de alcohol-clorhídrico (etanol: Cl = 50:50) y un trozo de aprox. 20 mg de cinta de magnesio (realizar bajo campana). bserve la coloración anaranjada-rojiza que se desarrolla lentamente. bserve la coloración desarrollada por los extractos y compárela con la reacción desarrolladas por los patrones Reacción de coloración con FeCl 3 al 1% La naturaleza polifenólica de los flavonoides permite la formación de aductos con el FeCl 3, otorgando una coloración variada, que depende de la estructura del polifenol. Coloque en cada tubo de ensayo, 1 ml de los extractos preparados y de los patrones de rutina, quercetina y naringenina. Agregue gota a gota FeCl 3 al 1%. bserve la coloración desarrollada Extracción de antocianósidos de los frutos de arándano El arándano es un sub-arbusto muy conocido por sus frutos, que destacan por su agradable sabor y aroma, los que además son utilizados por la industria farmacéutica para la extracción de antocianósidos. Los frutos de arándano son ricos en agua (hasta un 90%), azúcares (3-7%) y ácidos orgánicos. Se han identificado ácidos fenólicos, flavonoides (hiperósido, quercitrósido), proantocianidoles (procianidoles B 1 -B 4 ) y flavan-3-oles. El contenido en antocianósidos de los frutos frescos es de aproximadamente un 0,5%, de los cuales, la mayoría corresponden a - glucósidos, -galactósidos y -arabinósidos en C 3. El comportamiento de los antocianósidos en solución, deriva de las propiedades del catión 2-fenil-benzopirilio, obteniéndose distintas coloraciones según el p en el que se encuentren los compuestos, de esta manera, en un medio ácido fuerte (p < 3) se obtienen coloraciones rojas y en medios básicos (p > 10), la solución se torna hacia el azul, razón por la cual a las antocianinas en general, se les denomina como un marcador de p natural (figura 27). 37

38 Trabajo práctico 2: Flavonoides Figura 27: Variación de coloración de los antocianósidos de acuerdo al p. Para realizar la extracción de antocianinas: Tome 1 fruto de arándano y tritúrelo con ayuda de un mortero. En el mismo mortero, agregue 10 ml de metanol ácido (Me:Cl = 80:20) y espere 10 min. Filtre el contenido directamente a un tubo de ensayo, observe la coloración del filtrado. Agregue lentamente gota a gota, una solución de a al 30%, observe como va cambiando la coloración Análisis cromatográfico Realice dos cromatografías en placa fina utilizando como fase estacionaria gel de sílice y como fase móvil una mezcla de acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético glacial: agua = 100:11:11:27 (4A). Siembre en las placas: Placa 1: Extracto de ruda, además de los patrones de rutina y quercetina. Placa 2: Extracto de cáscara de naranja y patrón de naringenina. bserve a la luz UV y revele con reactivo P/PEG (natural product/polietilenglicol). Marque con un lápiz grafito las manchas correspondientes a la muestra y a los patrones. Precaución: el reactivo P/PEG produce gran irritación de las mucosas, rocíe la placa bajo campana. Calcule los Rf de la muestra y los patrones. De acuerdo a los resultados de los puntos 3.2 y 3.3 indique la presencia de flavonoides en la muestra, e identifique rutina, quercetina y naringenina si es que las observa. 38