Ingrid Tatiana Erazo, Lina Marcela Gallego, Zuray Fernanda Corredor y Guillermo Barreto.
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- Trinidad Alcaraz Benítez
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1 PREVALENCIA DE MICRODELECIONES EN EL CROMOSOMA Y EN UNA POBLACION DE PACIENTES CON INFERTILIDAD MASCULINA PREVALENCE OF Y-CHROMOSOME MICRODELETIONS IN A PATIENT POPULATION WITH MALE INFERTILITY Ingrid Tatiana Erazo, Lina Marcela Gallego, Zuray Fernanda Corredor y Guillermo Barreto. Laboratorio de Genética Molecular Humana, Sección Genética, Departamento de Biología, Universidad del Valle. RESUMEN Aproximadamente el 15% de los casos de infertilidad masculina son debidas a alteraciones genéticas, incluidas entre ellas, las microdeleciones en la región AZF del brazo largo del cromosoma Y. Pérdidas nucleotídicas en está región causan defectos en espermatogénesis que derivan en insuficiencia en la producción de espermatozoides. El objetivo de este estudio fue evaluar la frecuencia de microdeleciones en el cromosoma Y en una población de pacientes con infertilidad masculina por recuento espermático bajo, usando técnicas de genética molecular. Se estudiaron un total de 50 pacientes (21 azoospérmicos y 29 oligoastenozoospérmicos severos) empleando como metodologías de extracción de ADN la de desalamiento para leucocitos periféricos y la de resinas de intercambio iónico para muestras de líquido seminal. La amplificación de las regiones genómicas fue efectuada por medio de monoplex-pcr de nueve STS's para las tres regionesazf. En el 4% de la muestra fue observada la microdeleción tipo b2/b4 en la región AZFc. La frecuencia de microdeleciones obtenidas resultó cercana a las reportadas para otros países. Este trabajo resalta la importancia de las deleciones en la región AZF como causa de infertilidad masculina y la necesidad de realizar en estos pacientes un diagnóstico molecular. Fecha de recepción: Agosto 31 de 2007 Fecha de aceptación: Mayo 2 de 2008 Correspondencia: barretog@univalle.edu.co Departamento de Biología. A.A Universidad del Valle - Cauca Colombia. 164 Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ; 2008
2 MICRODELECIONES EN EL CROMOSOMA Y Palabras claves: Infertilidad masculina, Cromosoma Y, Región AZF, Microdeleción,Azoospermia, Oligozoospermia. ABSTRACT In approximately 15% of the infertile men, genetic alterations could be attributable, among them the microdeletions in the AZF region in the long arm of the Y chromosome. Genetic losses in this region, cause defects in spermatogenesis that derive in inadequacy in the sperm production. The goal of this study was to evaluate the frequency of Y chromosome microdeletions in a population of patient with male infertility by reduced sperm count, using molecular genetics techniques. A total of 50 patients were studied (21 azoospermics and 29 severe oligoastenozoospermics) using two methodologies of DNA extraction, of Salting Out for leukocyte peripherals and ionic exchange resins for samples of seminal liquid. The amplification of the genomic regions was made by means of monoplex-pcr of nine STS's for the threeazf regions. In 4% of the sample the microdeletion type b2/b4 was found in theazfc region. The obtained frequency was close to those reported for other countries. This work establish the importance AZF s genetic alterations as cause of male infertility. Also indicate the necesity for molecular diagnostic from this problem. Key words: Male infertility, Y chromosome, AZF Region, Microdeletion, Azoospermy, oligozospermy. Introducción Los eventos de infertilidad entre parejas se presentan con una frecuencia del 10-15%, y en aproximadamente el 30% de estos casos la deficiencia es de origen masculino, en gran medida asociada a fallas en la producción continuada de un número adecuado de gametos m a s c u l i n o s f u n c i o n a l m e n t e competentes (1). Se considera adicionalmente que en al menos el 15% de los pacientes infértiles, anormalidades genéticas pueden estar presentes, incluyéndose dentro de estas aberraciones cromosómicas, microdeleciones en el cromosoma Y o mutaciones en genes específicos (2). En el fragmento MSY (región específica para masculinidad) del cromosoma Y existe la Región AZF (Factor de Azoospermia), subdivida e n t r e s l o c i d i s c r e t o s ( n o superpuestos), AZFa, AZFb y AZFc, cada uno con grupos de genes identificados, USP9Y, RBMY y el clúster génico DAZ, que se caracterizan por tener expresión específica en células germinales masculinas y encontrarse Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ;
3 Erazo et al involucrados en diferentes fases de la espermatogénesis (3). La frecuencia de microdeleciones en la región AZF en la población masculina infértil a causa de oligozoospermia o azoospermia idiopática es del 5-15% (4). La región AZFc se presenta como la más frecuentemente suprimida (60% de los casos de microdeleción), seguida por deleciones en AZFb, AZFb+ c y AZFa+b+c (30%), mientras que las deleciones en la región AZFa son escasas (5%) (5). El objetivo de este trabajo fue establecer la prevalencia de microdeleciones en la Región AZF en u n a p o b l a c i ó n i n f é r t i l p o r oligozoospermia o azoospermia idiopática a través métodos moleculares. La información obtenida permitió comparar las frecuencias del presente estudio con las registradas para otros países, principalmente de Europa y Asia, reforzando la teoría sobre la relación causal existente entre las alteraciones génicas y cambios de í n d o l e c u a n t i t a t i v o e n l a espermatogénesis, que pueden detectarse a partir del Recuento Espermático Total (RET). MATERIALESYMETODOS consentimiento informado sobre la participación en este estudio. Para ello se tomaron muestras de sangre periférica (5 ml) y de semen (2 ml). El ADN genómico fue obtenido a través del método de desalamiento ( Salting Out ) para leucocitos periféricos (6) y del método de resinas de intercambio iónico Chelex-100 para muestras de líquido seminal (7). Amplificación por PCR de la Región AZF I n i c i a l m e n t e, r e a c c i o n e s d e monoplex-pcr fueron utilizadas para la detección de microdeleciones en el cromosoma Y, utilizando cebadores específicos para los siguientes STS (Sequence-Tagged Sites) de la región AZF: sy84, sy86 y sy87 (AZFa); sy117, sy127 y sy143 (AZFb); sy158, sy255 y sy254 (AZFc) (8). Con el fin de evitar falsos negativos, en caso de detectar una deleción, se llevó a cabo la confirmación del resultado a través de triplex-pcr, analizando el STS involucrado, en adición con los loci SRY y ZFX/ZFY como controles internos de la PCR. (Figura 1). Estos positivos verifican en primera instancia la presencia del cromosoma Y, además de garantizar la calidad de la amplificación en la triplex-pcr. Se analizaron 50 pacientes con recuento espermático total (RET) 6 menor o igual a 5 x 10 sptz/ml y 20 hombres fértiles, como controles p o s i t i v o s, p r e v i a f i r m a d e 166 Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ; 2008
4 MICRODELECIONES EN EL CROMOSOMA Y Figura 1. Localización de los 9 STS analizados en este estudio (parte inferior de la región eucromática Yq). Los controles internos de la PCR (SRY y ZFX/ZFY) se encuentran en la región Yp. La PCR se realizó en un de volumen de 25l reacción, conteniendo ADN genómico (50ng), Taq polimerasa (1.5 U/l), deoxiribonucleótidos dntp's (0.2 mm), cebadores (1 mol cada uno), MgCl2 (1.5 mm), y una concentración final de Buffer 1X de reacción en PCR. Para todos los cebadores las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un paso inicial de denaturación de 5 min a 95 C, seguido por 35 ciclos de 1 min de denaturación a 95, 1 min de anidación a 55 C y 1 min de extensión a 72 C, completado con un paso final de elongación a 72 C por 7 min y enfríado a 4 C. Una muestra sin ADN, junto con una muestra de ADN genómico femenino fueron utilizados como controles negativos para cada reacción de PCR. Resultados y Discusión Se encontró una frecuencia de 4% de microdeleciones en la Región AZF del cromosoma Y en la población de pacientes con infertilidad masculina e s t u d i a d a. E s t a f r e c u e n c i a corresponde a la detección de pérdida de la región AZFc en dos pacientes. Uno de ellos azoospérmico presentó ausencia de los tres STS's evaluados para dicha subregión mientras que en el segundo, con oligozoospermia 6 severa (3 x10 spt/ml), se observó una deleción de los STS sy254 y sy255, que por su distribución implica la ausencia total de la subregión AZFc, que comprende una longitud de 3.5 Mb (Figura 2). Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ;
5 Erazo et al MP A B Figura 2. Microdeleción de la Región AZFc A. Amplificados de los nueve STS's para todas las subregiones AZF (individuo normal). B. Deleción de los STS's: sy254, línea 8 y sy255, línea 9 (individuo infértil). Marcador de peso molecular de 50pb, MP. A pesar de que cualquier estadio de espermatogénesis o fase del desarrollo embrionario es susceptible a que ocurran este tipo de mutaciones, se ha establecido que en general resultan de errores durante el progreso de mitosis en embriogénesis temprana y que debido a la prematura separación entre ectodermo, mesodermo y endodermo, es posible encontrar divergencia entre los linajes de células germinales y somáticas (9), (10). 168 Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ; 2008
6 MICRODELECIONES EN EL CROMOSOMA Y El modelo de deleción que presentan los pacientes corresponde al evento de recombinación intracromosomal de los amplicones b2 y b4, ubicados entre el palíndromo P3 y la región distal del P1 enyq11 (Figura 3). Este rearreglo ocasiona la remoción de 21 copias de genes y unidades de transcipción, afectando en particular la expresión del clúster génico DAZ (DAZ1/DAZ2 y DAZ3/DAZ4) (11), que se encuentra limitado a la línea celular germinal, involucrado principalmente en metabolismo del RNA en espermátides tardías y con función estructural aparente, por formar parte del flagelo de espermatozoos maduros (12, 13). Figura 3. Modelo de deleción mediante evento de recombinación intracromosomal b2/b4 en la regiónazfc del cromosoma Y(ver texto). Cuando comparada la frecuencia de deleciones AZF de la literatura con las encontradas en el presente estudio (Tabla 1) no se observan diferencias significativas. Los resultados de esta tabla reafirman el papel causal de las alteraciones genéticas del cromosoma Y sobre la infertilidad masculina. A su vez muestra su ocurrencia en diferentes regiones geográficas (14). Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ;
7 Erazo et al Tabla 1. Frecuencia de microdeleciones en diferentes poblaciones Autor País Número de pacientes Frecuencia de deleciones (%)* Habermann et al (13) Alemania Nap et al (15) Países Bajos y Bélgica Friel et al (16) Irlanda Peterlin et al (17) Eslovenia Lucena et al (18) Colombia Presente estudio Colombia *Diferencias no significativas (0.01). Como conclusión, este trabajo enfatiza la importancia de las deleciones en la región AZF como causa de infertilidad masculina r e s a l t a n d o l a n e c e s i d a d d e implementar métodos de diagnóstico molecular para el estudio de estos pacientes. Agradecimientos A l a U n i d a d d e M e d i c i n a Reproductiva del Centro Médico Imbanaco, a la Clínica la Esperanza de la ciudad de Cali y al Centro de Biomedicina Reproductiva del Valle Fecundar, quienes aportaron las muestras de los pacientes que fueron analizados en este estudio. Bibliografía 1. Raicu F, Popa l, Apóstol P, Cimponeiriu D, Dan l, Ilinca E, luana l, Marinesco B, Gavrila l. Screening for m i c r o d e l e t i o n s i n h u m a n y chromosome AZF candidate genes and male infertility. J Cell Mol Med 2003; 7 (1): Ferlin A, Arredi B, Foresta C. Genetic causes of male infertility. Reprod Toxicol 2006; 22: Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S, Henegariu O, Hirschmann P, Kiesewetter F. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in yq11. Hum Mol Genet 1996; 5: Krausz C, Quintana-murci l, Mcelreavey K. Prognostic value of Y deletions analysis. What is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysis?. Hum Reprod 2000; 15: Krausz C, Forti G, McElreavey K. 170 Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 20: ; 2008
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