EVALUACIÓN DE HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA LA. DISCRIMINACIÓN GENÉTICA DEL MEJILLÓN CHILENO Mytilus chilensis

Transcripción

1 EVALUACIÓN DE HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA LA DISCRIMINACIÓN GENÉTICA DEL MEJILLÓN CHILENO Mytilus chilensis (Hupé, 1854) DE OTRAS ESPECIES DE MITÍLIDOS. Tesis para optar al Título de Ingeniero en Acuicultura Profesor Patrocinante: Dra. Marcela Astorga Instituto de Acuicultura VALENTINA CONSUELO PRIDA GUZMÁN PUERTO MONTT CHILE 2014

2 1 AGRADECIMIENTOS A mis padres y a mi familia. A ellos por creer en mí y darme el apoyo necesario para haber alcanzado y superado esta etapa que considero la más importante de mi vida académica. Les estaré infinitamente agradecida. Esto es para ustedes. Agradezco a mi profesora patrocinante Dra. Marcela Astorga, por darme la oportunidad de desarrollar mi tesis en el área que siempre me ha gustado y por permitirme además formar parte de su equipo de trabajo. También debo agradecerle a Jaime, por su paciencia y buena disposición para enseñarme todo en el laboratorio, sin su ayuda este trabajo no habría sido posible, muchas gracias por la buena onda. Asimismo gracias a la profe Sandra y a Andrea por aceptar corregir y evaluar mi tesis. No puedo dejar de lado a mis grandes amigos, Iván y Cristian, con los que disfruté, reí y compartí excelentes momentos, son lo máximo y los estimo demasiado. Quiero también expresar gratitud a Juan Pablito. Gracias por el amor incondicional y aguantar todas las mañas. Ya cumplí mi parte y ahora te toca a ti cumplir la tuya, gradúate pronto. Esta tesis fue desarrollada dentro del proyecto FIC 2012 E-7274, Identificación de larvas de mejillón mediante técnicas moleculares: un nuevo servicio para la mitilicultura regional.

3 2 INDICE DE CONTENIDOS i. RESUMEN...8 ii. ABSTRACT INTRODUCCIÓN HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de Muestras Extracción de ADN PCR-RFLP Amplificación del gen COI de ADN mitocondrial Digestión con enzimas de restricción EcoRI Amplificación de la región ITS de ADN nuclear Digestión con enzimas de restricción EcoRI MseI MspI Genes Variables Glu Mac Me 15/ Análisis de Datos Eficiencia de los métodos seleccionados RESULTADOS Extracción de ADN PCR-RFLP Amplificación del gen COI de ADN mitocondrial Digestión con enzimas de restricción EcoRI Amplificación de la región ITS de ADN nuclear Digestión con enzimas de restricción EcoRI... 37

4 3 -MseI MspI Genes Variables Glu Mac Me 15/ Eficiencia de los métodos seleccionados Aptitud de los Marcadores Rapidez en la obtención de resultados DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS... 60

5 4 INDICE DE FIGURAS Figura 1: Ciclo de vida de los mitílidos Figura 2: Gel de agarosa al 1% bajo luz UV que muestra los resultados de la amplificación de COI por medio de PCR. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño...34 Figura 3: Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV que muestra los resultados de la amplificación de COI por medio de PCR. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño...35 Figura 4A: Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV donde se observan los resultados de la primera condición del PCR para la amplificación de ITS. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. 4B: Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV donde se observan los resultados de la sengunda condición del PCR para la amplificación de ITS. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Figura 5A: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se aprecia la digestión con EcoRI a la primera condición de amplificación. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. 5B: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se aprecia la digestión con EcoRI a la segunda condición de amplificación Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Figura 6: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se observan los patrones de corte luego de digerir con MseI. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). (líneas 7, 8, 9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Figura 7: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se observan los patrones de corte luego de digerir con MspI. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). PM marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño....39

6 5 Figura 8A: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los patrones obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la primera condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular 8B: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultados obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la segunda condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular Figura 9A: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los patrones obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la tercera condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso. 9B: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la cuarta condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso Figura 10A: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la primera condición de amplificación del marcador molecular Mac-1. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular. 10B: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la segunda condición de amplificación del marcador molecular Mac-1. Líneas PM corresponde al marcador de peso molecular Figura 11: Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la amplificación del marcador molecular Me. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular y control positivo respectivamente...43

7 6 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Resumen de especies, sexo, rótulos asignados y cantidad de individuos para realizar extracción de ADN Tabla 2. Materiales utilizados en la elaboración de geles de agarosa al 1% para la visualización de ADN

8 7 INDICE DE ANEXOS Anexo 1: Contenido de E.Z.N.A. Mollusc DNA Kit... 60

9 8 i. RESUMEN El chorito o mejillón chileno, Mytilus chilensis, es una especie de mitílido de importancia comercial en Chile, sus características lo hacen un producto muy apreciado en países extranjeros por lo que la mayoría de la producción es destinada a exportación. La base de esta industria está sentada en la captación de semillas desde el medio natural mediante la puesta de colectores para la fijación larval. En el plancton marino también existen larvas de otras especies de mitílidos pero con menor importancia económica, como la Cholga y el Choro zapato. Por tratarse de dos especies de menor valor, puede llegar a ser de gran importancia identificarlas y poder discriminar zonas de abundancia de larvas de Chorito, lo que puede llegar a ser útil para la industria mitícola, debido a que asegura una mejor producción en base a una mayor captación de semillas. Para establecer métodos de identificación entre estas especies, se analizó el ADN del manto de diez individuos de cada especie, y a través de la evaluación de dos diferentes métodos moleculares se estableció el más adecuado para la discriminación entre especies. El primero de estos a utilizar fue PCR-RFLP, lo cual se aplicó en los genes COI e ITS con tres enzimas de restricción (EcoRI, MseI y MspI). El segundo método de discriminación se evaluó utilizando amplificación por PCR de los genes variables Glu-5, Mac-1 y Me 15/16.

10 9 Mediante el método PCR-RFLP se logró observar patrones de bandas diferentes en cada especie con el marcador ITS digerido por MseI y MspI. A través de los genes variables se logró obtener resultados discriminantes entre especies para cada uno de los genes analizados, los cuales muestran patrones de bandas diferentes para cada una de las especies. Finalmente, a partir de la evaluación de estos dos métodos fue posible establecer una forma rápida y certera de diferenciación molecular entre especies.

11 10 ii. ABSTRACT The Chilean mussel, Mytilus chilensis, is a mitilid species with commercial value in Chile, its features makes it very appreciated in foreign countries, reason why most of the production is destined for exportation. The base of this industry lays in the seed collection from the environment through the implementation of collectors for larval attachment. In the marine plankton, there also exist larvae of other mussels with lower commercial value, like the Cholga and Choro Zapato. Due to their lower value, identifying areas with abundance of Mytilus chilensis larvae results of great importance and at the same time, useful to the mussel industry to ensure a better production based on a higher seed collection. To establish identification methods between this species, DNA of the mantle of ten mussels were analyzed, and through the evaluation of two different molecular techniques, the ones best suited for discrimination between species were defined. One of these methods was PCR-RFLP, with the genes COI and ITS digested by restriction enzymes (EcoRI, MseI and MspI). The second method of discrimination was evaluated using PCR amplification of the genes Glu5, Mac-1 and Me 15/16. Through PCR-RFLP it was able to observe different band patterns for each species only with the marker ITS digested by MseI and MspI. With the

12 11 variable genes method, obtaining discriminating results between species was possible for all of the analyzed genes, which shows different band pattern for the three species. Finally, from the evaluation of these two methods it was possible to establish a fast way of molecular differentiation between species.

13 12 INTRODUCCIÓN La acuicultura es la tercera actividad de importancia económica presente en Chile, un país que por su geografía y diversidad de ambientes ha permitido que esta actividad sea llevada a cabo con un incremento promedio anual del 18,4% a partir de El sector acuícola, dedicado en su mayoría a la exportación, genera sus ingresos a base de la salmonicultura y el cultivo de moluscos, principalmente chorito (Uriarte, 2008). Respecto al cultivo de moluscos en Chile, gran parte del porcentaje de moluscos cultivados proviene de la mitilicultura, que tiene como pronóstico ocupar el segundo lugar después de China (Sernapesca, 2008) en volúmenes de producción que superan las toneladas. En el sur de Chile, el cultivo de chorito es una actividad de importancia económica, que produjo un 12,1% de la producción mundial de mitílidos en 2009 (FAO, 2011). La mitilicultura se inició en la década de los 80 en Chile, con el cultivo del chorito Mytilus chilensis (Hupe, 1854), ya que su coloración gonadal y su similitud con el mejillón español Mytilus galloprovincialis, resultaron atractivos en el mercado. Esta especie se encuentra en la costa del Pacífico Sur, donde se distribuye desde Perú hasta el Estrecho de Magallanes (Osorio, 1979), sin embargo, en Chile sus bancos naturales se hacen abundantes desde Arauco al Sur (Toro, 2004; Astorga, 2012), encontrándose principalmente en zonas de

14 13 baja salinidad especialmente en sectores estuarinos-salobres, donde se mezcla el agua dulce con agua de mar. Este cultivo concentra casi el 100% de producción en las aguas interiores de Chiloé y se sustenta exclusivamente con captación de larvas pediveliger desde el medio natural, en redes colectoras instaladas en zonas de captación, por lo cual, la captación natural es considerada el segmento más importante de esta actividad (LeBlanc, 2003). El chorito M. chilensis es una especie gonocórica (Osorio, 1979), donde los machos exhiben una gónada de color crema amarillenta, mientras que en las hembras la gónada es de color crema-anaranjado (Clasing et al., 1998; Bahamondes-Rojas y Muñoz, 1998). La fecundación es externa (Chipperfield, 1953) con desarrollo larval del tipo planctotrófico, en el que se distinguen las primeras formas móviles 24 a 48 horas después de la fecundación procedente de la segmentación de los huevos conocida como larva trocófora, que mide alrededor de 70μm. Posteriormente, la larva trocófora se transforma en una larva veliger 2 a 10 días post-fecundación. En esta etapa aparece la concha formada por dos valvas que mide entre 90 y 116 μm (Bautista, 1989). Así, el periodo de desarrollo larval puede durar entre 3 a 5 semanas (Pechenik et al., 1990; Toro et al., 2004). La fijación tiene lugar cuando la larva, próxima a metamorfosearse y convertirse en juvenil, encuentra un sustrato adecuado para adherirse al fondo, pierde el velo, y se produce una re-estructuración general de todos los órganos (Gilbert, 1991). Una vez fijado al sustrato, la semilla se dedicará solamente a crecer hasta su talla comercial. El resumen del ciclo de

15 14 vida de los mitílidos, con los estadios larvales de las especies pasando de los reproductores hasta las larvas, y su metamorfosis al momento de fijarse en un sustrato adecuado, se puede observar en la Figura 1. Figura 1: Ciclo de vida de los mitílidos. La mitilicultura en Chile se basa principalmente en el cultivo del chorito aunque en menor cantidad también puede producir otras especies de mitílidos, pero de menor valor comercial y solo para mercado nacional, como son el choro zapato (Choromytilus chorus; Molina, 1782) y la cholga (Aulacomya atra; Molina, 1782) (Uriarte, 2008). El ciclo productivo de la mitilicultura se inicia con la captación de semillas desde el ambiente natural a través de un sistema de colectores de red, para ser llevadas a engorda y luego cosecha, por lo cual esta etapa de captación es la

16 15 inicial para asegurar la sustentabilidad del proceso productivo de esta industria. No obstante, a la hora de la puesta de colectores en el mar para la captación de la semilla y su posterior engorda, aparece el problema de la fijación simultánea de las tres especies de mitílidos, de las cuales sólo el chorito presenta valor para la venta de las semillas presentes en los colectores. Las larvas de estas especies pueden estar todas presentes en el medio, sin embargo, la identificación de los estadios larvales para estas tres especies de mitílidos en base a caracteres morfológicos (Ramorino y Campos, 1983), ha llegado a ser de alta complejidad, resultando imprescindible solucionarlo para el buen manejo de aquellas especies que constituyen recursos económicos importantes, ya que permite la toma de decisiones al momento de la puesta correcta de colectores o de la identificación de lugares con abundancia de larvas de chorito, o aquellos con mayor concentración larval en etapa de metamorfosis, además de una evaluación temprana al momento de ser recolectadas, siendo ésta la etapa inicial y crucial de la cadena de valor de la mitilicultura. La identificación de larvas de bivalvos ha sido históricamente difícil, los caracteres morfológicos y medidas utilizadas tradicionalmente, tales como el largo, alto y grosor de la concha, largo de la línea charnelar, forma, color y textura de las valvas, no han sido suficientes (Lutz, 1982). Se han definido caracteres para la identificación a nivel microscópico (Ramorino y Campos,

17 ), sin embargo, el grado de dificultad y error puede llegar a ser alto. Esto sólo se puede verificar a través de técnicas de microscopia electrónica. El análisis microscópico de diferentes rasgos consideran la estructura del umbo, las estructuras denticuladas y la forma del sistema latraal del umbo, permitiendo así una identificación rigurosa de las larvas de bivalvos incluso en un nivel específico (Lutz, 1985). La evaluación de las larvas bajo el microscopio electrónico de barrido requiere de un trabajo bastante cuidadoso para la desarticulación, limpieza y montaje de las valvas (Hu, 1993), haciendo de éste un método impráctico y poco confiable que requiere de mayor tiempo para entregar una respuesta, y siendo la mitilicultura una actividad en constante crecimiento, resulta necesario el desarrollo de métodos alternativos que permitan aclarar esta situación para entregar una pronta respuesta que influirá en la toma de decisiones sobre la instalación de los colectores, considerando que estos deben ser instalados con anticipación al tiempo de fijación de la semilla (aproximadamente 20 días antes). Sin embargo, aun empleando las técnicas señaladas en el estudio de los caracteres morfológicos, la identificación de las larvas y postlarvas se dificulta al máximo cuando varias especies de una misma familia habitan la misma área o áreas vecinas; como es el caso de Mytilidae en Chile (Ramorino y Campos, 1983).

18 17 Actualmente, existen métodos moleculares para la identificación de larvas de bivalvos, los cuales son particularmente atractivos debido a su potencial de certeza (Powers, 1990). Considerando la llegada de las herramientas moleculares, se tiene la oportunidad de aplicar estas técnicas a cualquier estadio de moluscos, utilizando marcadores genéticos. Los métodos de identificación de especies basados en el uso de ADN pueden ser más costosos que las técnicas morfológicas tradicionales, sin embargo, éstas tienen la ventaja de ser fácilmente utilizadas entre las diferentes etapas de vida del individuo, debido a que la información genética no varía a lo largo de su desarrollo. Así, los marcadores de ADN han sido desarrollados y usados para discriminar entre los estadios de vida de diferentes especies de mitílidos (Wood, 2003; Toro, 2004). Este interés en la diferenciación ha llevado al reciente desarrollo de métodos como PCR-RFLP para la identificación de especies del mejillón Mytilus (Fernández-Tajes, 2011) u otros como el evaluado por Santaclara (2006), que trabajó con la técnica FINS (Secuenciación Nucleotídica con Información Forense) con la finalidad de autentificar especies del género Mytilus, Perna, Aulacomya, Semimytilus, Brachidontes, Choromytilus y Perumytilus bajo distintas presentaciones: frescos, congelado y enlatados. Otra de las herramientas que se tienen para resolver este problema, son las técnicas inmunológicas que resultan claramente atractivas debido a que

19 18 tienen algunas ventajas sobre las demás técnicas: especificidad y rapidez en los análisis de las muestras, el potencial para ser utilizada cuando el tamaño de la muestras es muy amplia y la posibilidad de estudiar larvas completas. Esta técnica tiene alrededor de tres décadas (Lorenzo-Abalde, 2003), y sin embargo, se ha estudiado poco sobre su aplicación para la identificación de larvas de bivalvos. No obstante, en la actualidad se ha evaluado este método a través de los anticuerpos monoclonales M22.8 y M36.5 obtenidos por Lorenzo-Abalde (2003), luego de inocular larvas en ratones. Este hallazgo se ha aplicado a la identificación de mitílidos del hemisferio norte, tales como M. galloprovincialis y M. edulis. Los estudios apuntan a una técnica con mayor especificidad y con la entrega de resultados en periodos de tiempo que no superarían una hora (Pérez, 2009). Además, su atractivo se incrementa al minimizar el manejo de las larvas (Ward, 1990). Sin embargo, algunos anticuerpos (tanto monoclonales como policlonales) han desarrollado reacciones cruzada o falta de especificidad (Feller & Gallagher, 1982) Por lo antes mencionado, los métodos a tratar en este trabajo, PCR- RFLP y Genes Variables, constan con antecedentes de haber sido ya probados para la identificación de especies dentro del género Mytilus. Inoue (1995) desarrolló un método basado en el largo variable de los productos amplificados por PCR, los cuales resultaron ser uniformes en cada especie y también diferentes interespecíficamente para Mytilus galloprovincialis, Mytilus trossulus, y Mytilus edulis. Luego en 1998, Toro estudió el estado taxonómico de Mytilus chilensis, utilizando el marcador ITS (digerido con HhaI) y Glu-5 de ADN de

20 19 origen nuclear para las especies M. chilensis, M. galloprovincialis, M. trossulus y M. edulis; evidenciando en sus resultados la similitud genética entre las primeras dos especies. Para ese mismo año, nuevamente Toro desarrolló un protocolo para la identificación de cinco especies de mejillón presentes en las costas chilenas usando las regiones ITS entre 18S y 28S de ADNr nuclear. Más tarde, Wood (2003), retomó y estudió el método propuesto por Inoue (1995) para establecer diferencias genéticas también en larvas a través del marcador Me 15/16 en cinco poblaciones naturales de Mytilus en Europa y América del Norte. Teniendo en cuenta estas referencias, el presente estudio busca evaluar una metodología molecular que permita servir como herramienta de identificación rápida y simultánea a nivel de especie entre los tres mitílidos comúnmente encontrados en las costas chilenas, la cual podría aplicarse a la identificación de las larvas de estas mismas especies, resultando determinante debido a que se asociaría a ello la presencia en la columna de agua para la obtención de semillas y su posterior cultivo. Teniendo en consideración todo esto, resolver la problemática de identificación en base a la presencia de larvas del chorito en el medio resulta muy conveniente a través de herramientas moleculares, las cuales presentan un nivel de certeza mayor que las técnicas de microscopía. Esto permitirá en un futuro generar una posible solución al problema que aqueja a la industria mitícola mediante el uso de estas técnicas que emplean el ADN de los individuos, las cuales en otras oportunidades han permitido llegar a solucionar

21 20 problemáticas como la caracterización de la variabilidad genética de una población, asignación de paternidad o parentesco, apoyar la trazabilidad, identificar loci asociados a caracteres cuantitativos, realizar selección asistida por marcadores e identificar especies y cepas, etc (Astorga, 2008). Finalmente, el siguiente trabajo evaluará la capacidad de discriminación de las técnicas moleculares PCR-RFLP y Genes Variables bajo diferentes condiciones en tres especies de mitílidos encontrados en las costas chilenas, de las cuales, una presenta un alto valor comercial.

22 21 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 2.1 Hipótesis De acuerdo a los antecedentes anteriormente mencionados, se plantea la siguiente hipótesis de trabajo: Dada que la información genética es una cualidad única y exclusiva para cada especie, la utilización de marcadores moleculares especie-específicas permitirá discriminar entre tres especies de mitílidos presentes en la columna de agua del sur de Chile. 2.2 Objetivos Para poner a prueba la hipótesis de trabajo se establece el siguiente objetivo general Objetivo general Evaluar diferentes marcadores moleculares que permitan discriminar genéticamente las especies de mitílidos: chorito (Mytilus chilensis), cholga (Aulacomya atra) y choro zapato (Choromytilus chorus) a través de la presencia de diferentes patrones de bandas especie-específicas de ADN.

23 Objetivos específicos Evaluar la digestión a través de las enzimas de restricción EcoRI, MseI y MspI sobre la amplificación por PCR de los genes COI e ITS para la identificación de las tres especies de mitílidos. Evaluar la amplificación por PCR de los genes variables seleccionados para la identificación de las tres especies de mitílidos. Comparar la eficiencia de identificación genética de ambas herramientas moleculares.

24 23 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Obtención de Muestras. Basado en que el ADN es el mismo en cualquier etapa del desarrollo de un individuo, se evaluaron las metodologías en individuos adultos y sólo hembras de cada especie, como se muestra en la Tabla 1, las cuales fueron obtenidas desde la extracción por pescadores para fines comerciales, desde la región de Los Lagos. Tabla 1. Resumen de especies, sexo, rótulos asignados y cantidad de individuos para realizar extracción de ADN. Especie Sexo Rótulo Cantidad Mytilus chilensis Hembras Ch 10 Aulacomya atra Hembras Cl 10 Choromytilus chorus Hembras Cz 10 A cada individuo se le estableció un código, seguido por la enumeración del 1 al 10. Una vez identificados se tomaron aproximadamente 10 mg de tejido de gónada y manto, los cuales se almacenaron en tubos eppendorf de 1,5 ml con adición de Etanol.

25 Extracción de ADN. La extracción se realizó sólo a las muestras de manto y según el protocolo entregado por E.Z.N.A. Mollusc DNA Kit D El contenido del Kit se indica en el Anexo 1. Su protocolo se basa en añadir 350μL de Buffer ML1 para proceder a macerar la muestra de tejido extraída, posterior a esto se agrega 25μl de Proteinasa K (previamente reconstituida con 1,5mL de Proteinase Storage Buffer), enzima que tiene por función romper la pared celular y degradar proteínas. Teniendo esta etapa lista, las muestras se deben incubar durante la noche a 37 C. Luego, a las muestras se les añade 350μL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), el cual separa la muestra en dos fases, la fase inferior es la que contiene proteínas y otros contaminantes, mientras que la fase acuosa superior es en la que se encuentra el ADN, la cual debe ser cuidadosamente transferida a un tubo eppendorf limpio evitando la interfaz lechosa constituida de polisacáridos. Una vez rescatada la fase que contiene el ADN, se añade un volumen idéntico de MBL Buffer y 2μL de ARNasa A, la cual elimina los restos de ARN presentes. Las muestras se mezclan e incuban a 70 C por 10 minutos. Luego se añaden 100μL de Equilibration Buffer a las mini columnas y se descarta lo

26 25 filtrado para reutilizar los tubos de colección. A cada muestra se le agregó un volumen idéntico de Etanol al 100%, para luego ser mezclado por 15 segundos y centrifugados a 10,000 x g durante 1 minuto, se descartó lo filtrado y los tubos de colección. Se agregan 500μL de HB Buffer para centrifugar a 10,000 x g por 30 segundos, se añadieron 70μL de DNA Wash Buffer, el que debió estar previamente diluido en 60mL de Etanol al 100%. Por último, se centrifuga a 14,000 x g por 2 minutos para secar la membrana. Las mini columnas se traspasan a tubos eppendorf de 1.5 ml y se agregan 50μL de Elution Buffer precalentado a 70 C, se deja reposar y se centrifuga a 10,000 x g durante 1 minuto. Finalmente para verificar que el proceso de extracción haya resultado exitoso, se realizó electroforesis en un gel de agarosa al 1% (Tabla 2) a 75 V por 45 minutos y se visualizó a través del transiluminador UV DigiDoc-It DarkRoom. Por último, el ADN obtenido fue almacenado a -20 C. Tabla 2. Materiales utilizados en la elaboración de geles de agarosa al 1% para la visualización de ADN. Item Agarosa Buffer TAE 1x SYBR Cantidad 50 mg 50 ml 2,5μL

27 PCR-RFLP Amplificación del gen COI de ADN mitocondrial. Las muestras de ADN obtenidas desde cada especie fueron amplificadas mediante PCR del gen COI (Citocromo Oxidasa I) de ADN mitocondrial, para esto se utilizó los partidores COI-F (5 - GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3') y COI-R (5 - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ) (Folmer, 1994). El PCR se llevó a cabo en un Mix de PCR de 50μL de volumen final que contenía 1,5μL del ADN molde, 2μL de dntps, 2μL de MgCl2, 0,4μL de Taq Platinum, 5μL de Buffer PCR, 37,1μL de H2O libre de nucleasas y 1μL de cada partidor. La reacción se realizó en el termociclador programable Thermo Scientific TM Hybaid Px2. El protocolo de amplificación consistió en una denaturación inicial a 95 C por 9 min, luego de 35 ciclos de 94 C por 1 min, 48 C por 45 s, 72 C por 1 min, seguido de un paso de extensión final a 72 C por 5 min. El resultado del PCR se debió evaluar en un gel de agarosa al 1,5% con 2,6μL de SYBR, 1,5μL de 10x BlueJuice Gel Loader Buffer, 5μL del resultado de PCR y 0,5μL para el marcador de peso molecular Digestión con Enzimas de Restricción. - EcoRI La amplificación resultante del PCR fue digerida con la endonucleasa EcoRI (enzima que reconoce y corta en 5 -G AATTC-3 ), en un volumen total

28 27 de 15μL, contenido por 6,5μL de H2O libre de nucleasas, 3μL de buffer EcoRI, 5μL del producto de PCR y 0,5μL de la enzima EcoRI. El mix se incubó a 37 C por 3 horas en el termociclador Thermo Scientific TM Hybaid Px2. Posteriormente se observó el producto digerido a través de electroforesis a 95 V por 45 minutos y en un gel de agarosa al 3% Amplificación de la región ITS de ADN nuclear. Para la región ITS se probaron dos condiciones diferentes de PCR para las muestras de las tres especies, los partidores utilizados corresponden a ITS 28U (5 -CGTTACTGGGGGAATCCTGGT-3 ) e ITS 18D (5 - CACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTG-3') (Hillis, 1991). Para la primera condición se trabajó con 30μL de volumen final compuesto de 3μL de BPCR, 1,5μL de MgCl2, 3μL de dntps, 1μL de cada primer; 0,2μL de Taq Platinum, 18,3μL de H2O libre de nucleasas y 2μL del ADN Molde. La segunda condición, también constituído por 30μL de volumen final, contenía 3μL de BPCR, 2μL de dntps, 1μL de cada primer, 0,5μL de Taq Paq 5000, 21,5μL de H2O libre de nucleasas y 1μL de ADN. La amplificación se llevó a cabo en el termociclador Thermo Scientific TM Hybaid Px2 utilizando el protocolo con una denaturación inicial a 95 C por 5 min, seguido de 35 ciclos de 95 C por 1 min, 54 C por 1 min y 72 C por 1 min, finalizando con un paso de extensión final a 72 C por 5 min. Para evaluar los resultados de la amplificación, se realizó electroforesis en gel de agarosa al

29 28 1,5% y 2,6μL de SYBR, las muestras se prepararon con 1,5μL de 10x BlueJuice Gel Loader Buffer, 5μL del resultado de PCR y 0,5μL para el marcador de peso molecular para ser vistas bajo luz UV a través del transiluminador DigiDoc-IT DarkRoom Digestión con Enzimas de Restricción. -EcoRI Se tomaron 10μL del producto de PCR obtenido de ambas condiciones y se digirió con la endonucleasa EcoRI en un volumen total de 14μL, conteniendo además 1,8μL de H2O libre de nucleasas, 1,2μL de buffer EcoRI y 1μL de la enzima EcoRI. Se agregó un tubo con las mismas condiciones a excepción del ADN amplificado como control negativo. La reacción se debe incubar a 37 C por 3 horas. Para la observación de resultados se realizó electroforesis al producto digerido a 95 V por 45 minutos y se observó en un gel de agarosa al 3% con 8μL del resultado de la digestión. - MseI Se tomaron 10μL de ADN amplificado de ambas condiciones y se digirieron con la enzima MseI, que reconoce y corta en 5 -T TAA-3. El volumen utilizado fue de 14μL que contiene 1,8μL de H2O libre de nucleasas, 1,2μL del Buffer correspondiente a la enzima (T9) y por último 1μL de enzima. La digestión se llevó a cabo por 3 horas a 37 C en el termociclador Thermo Scientific TM Hybaid Px2 y los resultados se observaron bajo luz ultravioleta en

30 29 un gel de agarosa al 3% corrido a 95 V por 30 minutos, con 8μL del producto digerido. - MspI La región de ADN amplificada fue digerida con la enzima MspI, que reconoce y corta las secciones 5 -C CGG-3, en un volumen total de 22μL, el cual se componía de 10μL del producto de PCR, 18μL de H2O libre de nucleasas, 2μL de 10x Tango Buffer y 2μL de la enzima. La digestión realizada durante 15 horas a 37 C se llevó a cabo en el termociclador Thermo Scientific TM Hybaid Px2. Los resultados debieron ser observados bajo luz ultravioleta en un gel de agarosa al 3% corrido a 95 V por 30 minutos, con 8μL del producto digerido. 3.4 Genes Variables Glu-5 Se amplificó mediante PCR el gen de ADN nuclear Glu-5 (Gen de la proteína del biso), con los partidores JH5 (5 -GTAGGAACAAAGCATGAACCA- 3') y JH54 (5 -GGGGGGATAAGTTTTCTTAGG-3 ) (Rawson, 1996) para muestras de cada especie analizada. El PCR se realizó con un Mix de 30μL de volumen final que contuvo 2μL del ADN molde, 3μL de dntps, 2μL de MgCl2, 0,4μL de Taq Platinum, 3μL de Buffer PCR, 15,6μL de H2O libre de nucleasas y 2μL de cada primer. Para este marcador se realizaron cuatro condiciones de amplificación para la obtención de resultados óptimos, estas condiciones se caracterizaron por variación en las condiciones de amplificación asociadas a

31 30 las temperaturas de alineamiento de los partidores, para lo cual se evaluó cuatro temperaturas: 48 C, 50 C, 52 C y 53 C. Las condiciones restantes de amplificación fueron una denaturación inicial a 94 C por 3 min, luego 30 ciclos de 94 C por 20 s, 48 C - 50 C - 52 C - 53 C por 20 s, 72 C por 45 s, seguido de una extensión final a 72 C por 3 min. Los resultados fueron observados bajo luz ultravioleta en un gel de agarosa al 3% que tuvo que ser corrido a 85 V por 40 minutos, con 5μL del producto digerido Mac-1 La amplificación de marcador nuclear Mac-1 (primer intrón del gen de la actina) a través de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 30μL, comprendido por 2μL de cada primer: Mac 1a (5 - CATATTGGAAGATCAAGTCG-3 ) y Mac 1b (5 - CATATTTTATTCTTTCAGATGG-3') (Ohresser, 1997; Daguin & Borsa, 1999), 3μL de BPCR, 2μL de MgCl2, 3μL de dntps, 0,3μL de Taq Platinum, 15,7μL de H2O libre de nucleasas y 2μL del ADN Molde. El protocolo para la amplificación se inició con una denaturación a 96 C por 3 min, seguido de 30 ciclos de 94 C por 90 s, 45 C por 1 min y 72 C por 30 s, terminando con una extensión final de 72 C por 3 min. Los resultados se vieron bajo luz UV en un gel de agarosa al 3% con 5μL del producto de amplificación.

32 Me 15/16 Las muestras de cada especie se amplificaron mediante PCR para la obtención del marcador nuclear Me 15/16, correspondiente al gen de la proteína adhesiva, los partidores utilizados corresponden a Me15 (5 - CCAGTATACAAACCTGTGAAGA-3 ) y Me16 (5 -TGTTGTCTTAATAGGTTTGTAAGA-3') (Inoue, 1995). El mix de PCR constó de un volumen final de 30μL compuesto de 3μL de BPCR, 2μL de MgCl2, 3μL de dntps, 1μL de cada primer; 0,2μL de Taq Platinum, 17,8μL de H2O libre de nucleasas y 2μL del ADN Molde. La amplificación se llevó a cabo en el termociclador Thermo Scientific TM Hybaid Px2 programado para iniciar la denaturación a 95 C por 1 min, seguido de 30 ciclos de 94 C por 30 s, 56 C por 30 s y 70 C por 90 s, finalizando con un paso de extensión final a 70 C por 1 min, por último para evaluar los resultados de la amplificación, se realizó una electroforesis simple en un gel de agarosa al 3% y 2,6μL de SYBR, las muestras se prepararon con 1,5μL de 10x BlueJuice Gel Loader Buffer, 5μL del resultado de PCR y 0,5μL para el marcador de peso molecular para ser vistas bajo luz UV. 3.5 Análisis de Datos. Se estimaron los patrones de bandeo de amplificación de cada una de las herramientas utilizadas en cada una de las especies. Para el análisis de datos se midió presencia o ausencia de bandas y patrones de bandas en los

33 32 productos resultantes para las tres especies tratadas con las diferentes técnicas en estudio tras haber sido visualizadas bajo UV. 3.6 Eficiencia de los métodos seleccionados. Para registrar la eficiencia de los dos métodos que permitieron la identificación y diferenciación genética de las tres especies en estudio, se realizó una comparación de éstos tomando en cuenta la aptitud de los marcadores y la rapidez de obtención de los resultados basándose en el tratamiento (amplificación) del material genético ya adquirido.

34 33 4. RESULTADOS 4.1 Extracción de ADN La extracción realizada a las 30 muestras de manto pertenecientes a las 3 especies de mitílidos analizadas, resultó satisfactoria. Para M. chilensis y Ch. chorus se observó ADN y prácticamente sin rastro de degradación. Para A. atra se distinguió ADN tenue, sin embargo, tampoco presentó degradación. 4.2 PCR-RFLP Amplificación del gen COI de ADN mitocondrial El gen mitocondrial COI sólo fue amplificado para las especies M. chilensis, Chorito y Ch. chorus, Choro zapato; para A. atra, Cholga no se observó amplificación positiva. En las especies que se obtuvo bandas, estas presentaron una alta amplificación y con un patrón de tamaño del gen dentro del rango de bp (Fig. 2). No se observan patrones diferentes entre las dos especies en las cuales se amplificó el gen, sino más bien presentan una alta similitud de tamaño del gen.

35 34 Figura 2. Gel de agarosa al 1% bajo luz UV que muestra los resultados de la amplificación de COI por medio de PCR. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Digestión con Enzimas de Restricción. -EcoRI Tras haber realizado la digestión bajo las condiciones señaladas, no se reconoció ningún corte o patrón en la banda de ADN, la enzima no actuó sobre el producto de PCR, y se observó en el gel lo mismo que se aprecia en la amplificación; bandas muy marcadas a la altura de 600 bp para M. chilensis y Ch. chorus (Fig. 3).

36 35 Figura 3. Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV que muestra los resultados de la amplificación de COI por medio de PCR. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Amplificación de la región ITS de ADN nuclear Tras probar con dos condiciones para la amplificación de ITS, se obtuvieron resultados diferentes para cada una de ellas. La primera amplificó para todas las muestras de las tres especies y entregó bandas notoriamente más marcadas (Fig. 4A) que la segunda condición, donde de las nueve muestras, sólo ocho presentan resultados tenues y poco visibles (Fig. 4B). Sin embargo, las líneas 7 y 9, correspondientes a la especie Aulacomya atra, son las más notorias y las únicas que muestran amplificación. Respecto al tamaño de los fragmentos de ADN medidos en pares de bases (bp) no se logra distinguir con exactitud, pero podrían encontrarse sobre los 1000 bp para las dos primeras especies, para la tercera especie, se observa alrededor de los 900 a 1000 bp.

37 36 Figura 4A. Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV donde se observan los resultados de la primera condición del PCR para la amplificación de ITS. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. 4B. Gel de agarosa al 1,5% bajo luz UV donde se observan los resultados de la sengunda condición del PCR para la amplificación de ITS. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño Digestión con Enzimas de Restricción. -EcoRI Se realizó para las dos condiciones de amplificación de ITS. De la digestión con la enzima EcoRI no se obtuvieron patrones de corte. Las bandas obtenidas concuerdan con las observadas en el PCR, por lo que la enzima de restricción no reconoció ninguna sección de la secuencia de ADN de las muestras y por tanto, no cortó el fragmento de ADN amplificado. Nuevamente la primera condición muestra resultados claramente marcados (Fig. 5A), en igualdad para las tres especies, las bandas para M. chilensis y para Ch. chorus se observan sobre los 1000 bp, y las bandas de A.

38 37 atra se ven entre los 900 y 1000 bp. Para la digestión de la segunda condición, si bien no son del todo visibles, se aprecian tenuemente una banda a la altura de las 950 bp en las muestras de A. atra (Fig. 5B). Figura 5A. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se aprecia la digestión con EcoRI a la primera condición de amplificación. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. 5B. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se aprecia la digestión con EcoRI a la segunda condición de amplificación Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. -MseI Para la digestión con MseI, sólo se utilizó la primera condición de amplificación de la región de ITS, que fue la que mejores resultados entregaba en relación a la visibilidad e intensidad de las bandas, tanto en PCR como en digestión con EcoRI. Para esta enzima se encontraron patrones de bandas diferentes para cada especie. En Mytilus chilensis se observan cuatro bandas: la primera de aproximadamente 140 bp, la siguiente a los 200 bp, la tercera cercana a los

39 bp y la última con alrededor de 480 bp. En Choromytilus chorus se ven muy marcadas dos bandas, una a la altura de los 480 bp y la otra pasando los 600 bp. Para Aulacomya atra, se ve un patrón similar a Mytilus, sin embargo, sólo presenta tres bandas, la primera por los 190 bp, la segunda cercana a los 230 bp y la tercera con 380 bp (Fig. 6). Figura 6. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se observan los patrones de corte luego de digerir con MseI. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). La línea PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. -MspI Para el producto digerido con MspI, se observaron buenos resultados de corte, encontrando patrones de bandas diferentes para cada especie. En Mytilus chilensis se distinguieron dos bandas: la primera de aproximadamente 280 bp y una segunda cercana a los 480 bp. Para Choromytilus chorus se diferencian 2 bandas, la primera a una altura de 350 bp y la segunda de 500 bp. En el caso de Aulacomya atra, se observaron 4 bandas, la primera de

40 39 aproximadamente 190 bp, la segunda cercana a los 300 bp, la tercera con 530 bp y una cuarta de 600 bp (Fig. 7). Figura 7. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV donde se observan los patrones de corte luego de digerir con MspI. Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) Aulacomya atra (líneas 7-9). PM corresponde al marcador de peso molecular de 100 bp de tamaño. 4.3 Genes Variables Glu-5 Para la primera condición se aprecian bandas para todas las especies en estudio, sin embargo no se logra distinguir con claridad los patrones para A. atra y C. chorus. Las bandas correspondientes a Mytilus se encuentran aproximadamente a los 300 bp la primera y a los 450 bp la segunda. (Fig. 8A) En la segunda condición, sólo se observa un patrón de bandas en Mytilus, las otras dos especies no presentan resultados claros respecto a sus

41 40 patrones. Las bandas de Mytilus se encuentran entre las 200 bp la primera y 400 bp la segunda. (Fig. 8B) Figura 8A. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los patrones obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la primera condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular 8B. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultados obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la segunda condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular. La tercera condición muestra resultados más marcados para las tres especies, sin embargo sólo se encuentra un patrón definido para Mytilus, que presentó 3 bandas a la altura de las 200, 300 y 500 bp. (Fig. 9A). Para la cuarta condición sólo se obtiene un patrón de una sola banda para M. chilensis, no se observan resultados en las otras dos especies. La banda encontrada para chorito se encuentra en el rango bajo 100 bp. (Fig. 9B)

42 41 Figura 9A. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los patrones obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la tercera condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso. 9B. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la cuarta condición de amplificación del marcador molecular Glu-5. Línea PM corresponde al marcador de peso Mac-1 La primera condición muestra una sola banda para Mytilus a la altura de las 450 bp aproximadamente. Para el caso de A. atra también se observa sólo una banda, de mayor tamaño en el rango de las 550 bp. En C. chorus se puede visualizar un patrón de dos bandas, la primera cercana a las 280 bp y la segunda de 700 bp. (Fig. 10A) Bajo la segunda condición de amplificación, se observan bandas en las tres especies pero sin embargo no se trataría de un patrón claro salvo en C. chorus, donde se aprecian tres bandas con grandes diferencias en tamaño, la primera cercana a las 200 bp, la segunda bajo las 450 bp y la última a las 900 bp (Fig. 10B).

43 42 Figura 10A. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) usando la primera condición de amplificación del marcador molecular Mac-1. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular. 10B. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3), Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la segunda condición de amplificación del marcador molecular Mac-1. Líneas PM corresponde al marcador de peso molecular Me 15/16 Las dos condiciones probadas para este marcador no presentaron diferencias, en ambos casos sólo se observa la presencia de una sola banda para Mytilus. Para A. atra y C. chorus no hay resultados. La banda obtenida en Mytilus se encuentra aproximadamente a las 120 bp. (Fig. 11)

44 43 Figura 11. Gel de agarosa al 3% bajo luz UV, donde se observan los resultado obtenidos para Mytilus chilensis (líneas 1-3); Choromytilus chorus (líneas 4-6) y Aulacomya atra (líneas 7-9) luego de la amplificación del marcador molecular Me. Línea PM corresponde al marcador de peso molecular y control positivo respectivamente. 4.4 Eficiencia de los métodos seleccionados. - Aptitud de los marcadores Para el método de PCR-RFLP, la única enzima de restricción (EcoRI) utilizada para tratar la amplificación a través del gen COI no entregó resultados para la diferenciación entre las especies; comparable a lo observado con la misma enzima para el producto amplificado con el gen ITS. Sin embargo, bajo iguales condiciones, las enzimas MseI y MspI, sí entregaron patrones diferentes para cada especie, por lo que se consideraron aptas para la finalidad del estudio, la cual es la diferenciación genética de las tres especies. El segundo método, Genes Variables, donde se consideraron los marcadores Glu-5, Mac-1 y Me 15/16; resultaron en su totalidad efectivos tras

45 44 la estandarización de sus protocolos. Si bien para el marcador Me 15/16 sólo se observó amplificación y una única banda para Mytilus chilensis, se considera como un tratamiento positivo ya que permite la identificación de M. chilensis de las otras dos especies. - Rapidez en la obtención de resultados. Eximiendo del proceso completo la etapa de extracción de ADN, queda claro que la aplicación de la técnica PCR-RFLP conlleva a una obtención de resultados más lenta que Genes Variables, debido a que primero se deberá realizar la amplificación del gen seleccionado, lo cual tardará alrededor de 3 horas para luego continuar con la digestión, que en algunos casos puede ser desde 3 horas (EcoRI y MseI) hasta una incubación durante toda la noche por aproximadamente 15 horas (MspI). No es así en el caso de la segunda técnica, Genes Variables, donde los marcadores moleculares amplificados no necesitan de una posterior digestión, ya que tienen la capacidad de cortar el ADN de forma específica entregando patrones de banda de forma directa. Los protocolos de amplificación de estos marcadores no sobrepasan las 3 horas.

46 45 5. DISCUSIÓN A través de PCR-RFLP, los resultados luego de la digestión para el gen COI con la enzima EcoRI mostraron un patrón idéntico para las tres especies, ubicándolas a la misma altura con una banda alrededor de 1000 bp, lo cual no hace que esta combinación (COI-EcoRI) sea un buen discriminador entre las especies, descartando su uso. SI bien hay autores, como Toro (1998), que describió análisis de restricción haciendo referencia a la obtención de patrones de bandas para Mytilus chilensis a través de digestión con la endonucleasa EcoRI para el marcador mitocondrial COIII. Utilizando ese antecedente como base, este trabajo aplicó el protocolo señalado por el autor para la digestión del gen COI con aquella misma enzima, sin embargo, los resultados que se obtuvieron difieren a los descritos por Toro, que señala la visualización de dos bandas a la altura de las 540 bp y 320 bp para M. chilensis. Cuando la misma enzima (EcoRI) se aplicó para digerir el producto amplificado de la región ITS, vuelve a ocurrir lo mismo, se manifiesta sin resaltar diferencias ni patrones para las especies en estudio. Para las enzimas MseI y MspI, los productos resultantes sí mostraron patrones de corte diferentes en cada una de las tres especies, lo que en primera instancia comprobaría la hipótesis planteada, y por otra parte considera a estas enzimas eficaces para análisis de estas especies.