y técnicas CAPÍTULO 1.1 Obtención de los preparados

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1 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page 1 CAPÍTULO 1 Consideraciones En el diagnóstico de rutina actual, la diferenciación de los leucocitos se efectúa mediante el uso de contadores citológicos. Según la clase de equipo que se utilice, las células se diferencian en función de características tales como el tamaño, la dispersión óptica, la impedancia; en parte también mediante coloración citoquímica. Cuando se trata de la identificación de células patológicas, este tipo de diferenciación se limita a la expresión de señales de advertencia. En la práctica médica, la diferenciación de los leucocitos mediante sistemas de análisis de imágenes está poco difundida. Por lo tanto, la evaluación microscópica y morfológica de extendidos de sangre y de preparados de médula ósea constituye aún la base del diagnóstico hematológico, que se complementa con la determinación de enzimas características y otros componentes celulares mediante técnicas citoquímicas. No obstante, el significado práctico de la citoquímica ha disminuido significativamente por la existencia de métodos alternativos, y en muchos aspectos, sólo debe considerarse como referencia histórica. El segundo pilar del diagnóstico hematológico es la caracterización inmunológica de las células. En este punto, la citometría de flujo, que permite la detección de muchos antígenos en una célula, adquiere una importancia dominante. Las poblaciones celulares pueden caracterizarse exactamente mediante mediciones multiparamétricas. Otros métodos relevantes son la inmunocitología y la inmunohistología. En este caso, los antígenos presentes en las células de extendidos y cortes histológicos se marcan mediante el empleo de anticuerpos. La ventaja de estos procedimientos es que la expresión de determinados antígenos y proteínas se asigna a células individuales, manteniéndose las relaciones morfológicas. En la práctica, los estudios inmunocitológicos sobre extendidos son poco frecuentes y se realizan sólo ante situaciones especiales. En la histología, estas técnicas son de rutina. iniciales y técnicas La tercera columna sobre la que se fundamenta el diagnóstico de las enfermedades hematológicas es la citogenética y la biología molecular. En esta área, se produjeron importantes desarrollos metodológicos: para la rutina, están establecidas la hibridación fluorescente in situ (fluorescent in situ hybridisation, FISH) y la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Los métodos para la determinación de la ganancia o de la pérdida de material genético (comparative genomic hybridisation, CGH) y el análisis de la expresión génica mediante la tecnología Chip constituyen metodologías que aún no se utilizan en el diagnóstico de rutina, aunque están cerca de ello. Todos los métodos mencionados intervienen conjuntamente en la clasificación y el diagnóstico de las enfermedades hematológicas ( Cuadro 1.1). Este libro se centra en la morfología de las células de la sangre y de la médula ósea. Puesto que la inmunología, la biología molecular y la citogenética se han vuelto esenciales para el diagnóstico y la clasificación de algunas enfermedades, se ha buscado presentar adecuadamente la relación con estas metodologías. También se presenta la conexión con los parámetros clínicos en aquellos casos en que éstos resultan esenciales para el diagnóstico y el tratamiento de las patologías mencionadas. 1.1 Obtención de los preparados La preparación de extendidos de buen valor cualitativo es una condición indispensable para lograr un diagnóstico morfológico significativo. Esto es particularmente importante para la citología de médula ósea. Sólo una experiencia suficientemente larga aporta las habilidades técnicas requeridas. A continuación, se indican algunos consejos metodológicos. En la práctica, se utilizan generalmente portaobjetos

2 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Consideraciones iniciales y técnicas Cuadro 1.1 Métodos de diagnóstico y clasificación de las enfermedades hematológicas Criterios clínicos Morfología Tinción panóptica (Pappenheim) Citoquímica (peroxidasa, tinción con azul de Prusia, entre otros) Inmunología y marcadores de superficie Citometría de flujo Inmunocitología Inmunohistología Citogenética y biología molecular Citogenética tumoral convencional Hibridación fluorescente in situ (FISH) Combinaciones de citogenética y FISH (p. ej., tinción cromosómica o chromosome painting) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cualitativa y cuantitativa Análisis de la expresión génica con tecnología Chip (micromatrices génicas) Hibridación genómica comparativa (CGH) con borde esmerilado para las inscripciones. La identificación inequívoca (apellido y nombre, fecha de nacimiento y fecha de obtención de la muestra o número de laboratorio con referencia a dichas indicaciones en el libro del laboratorio) debe estar garantizada Frotis sanguíneo Durante la preparación de los frotis o extendidos sanguíneos, debe tenerse en cuenta que sólo 2 / 3 a 3 / 4 del portaobjetos puede quedar cubierto por el preparado. Los cubreobjetos largos (24 50 mm) son los más adecuados para realizar el frotis ( Fig. 1.1). El grosor del extendido en el último tercio del preparado debe ser tal que permita que los eritrocitos se distribuyan parcialmente aislados entre sí y también juntos como pequeñas pilas de monedas. Los preparados muy gruesos hacen imposible el análisis de las estructuras celulares finas, dado que las células no se encuentran suficientemente extendidas. Fig. 1.1 Preparación de un frotis sanguíneo Concentrado de leucocitos En casos de leucopenia, la preparación de un concentrado de leucocitos puede resultar útil. De esta forma, puede presentarse también una pequeña cantidad de células patológicas para el análisis de su morfología o la realización de tinciones especiales. Procedimiento: 1 parte de gel (Plasmagel, Braun, Melsungen, Alemania), 4 partes de sangre. Incubar durante 15 min a 37 ºC en estufa, aproximadamente 7 minutos en posición inclinada (45º) y alrededor de 7 minutos en posición vertical ( Fig. 1.2 a). La fase superior es rica en leucocitos. Ésta se transfiere a un tubo nuevo ( Fig. 1.2 b) y se centrifuga suavemente a 1200 U/min (aproximadamente 500 G) durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante, se resuspende el sedimento y se preparan los extendidos. Atención: Prestar atención a la conservación de la esterilidad. Las bacterias presentes en el Plasmagel pueden ser fagocitadas por granulocitos o por monocitos durante el procedimiento de concentración a 37 ºC, lo que puede originar interpretaciones erróneas Citología de médula ósea Al igual que con la sangre, pueden prepararse extendidos a partir de punciones de médula ósea ( Fig. 1.4). También pueden realizarse preparados por presión de la médula ósea ( Fig. 1.6). Para la anticoagulación de la médula ósea, se recomienda utilizar jeringas de 20 ml pretratadas con 1-2 ml de EDTA (etilendiaminotetraacético) 2% en H 2 O para inyección. Después de la aspiración, se deja gotear la mezcla de aspirado de médula ósea y EDTA

3 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Obtención de los preparados 3 a b c d Fig. 1.2 Representación esquemática de la obtención de un preparado de leucocitos Portaobjetos Superficie rugosa para la identificación Fig. 1.5 Esquema de la morfología de un extendido de médula ósea Fig. 1.3 Para la recuperación de fragmentos de médula ósea, dejar correr el aspirado; los fragmentos son visibles sobre el portaobjetos Fig. 1.6 Obtención de un preparado de médula ósea por presión Fig. 1.4 Preparación de un extendido de médula ósea Fig. 1.7 Esquema de la morfología de un preparado de médula ósea por presión

4 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Consideraciones iniciales y técnicas Cuadro 1.2 Comparación entre el valor diagnóstico de la citología y la histología de médula ósea en 300 casos (Evaluación histológica: Prof. Lennert, Kiel; Prof. Burkhardt, München). Diagnóstico Citología Anemias (general) Anemia aplásica Panmieolopatía Mielodisplasia Leucemia aguda Leucemia mieloide crónica (LMC) Policitemia vera Mielosis megacariocítica, / mielofibrosis Linfoma no Hodgkin (LNH): leucemia linfoide crónica (LLC) leucemia de células () pilosas Otras formas / Plasmocitoma Linfoma de Hodgkin () Metástasis de carcinomas Citoquímica: Fe Otras reacciones * F = Fuente de error Histología poco frecuente ()/(F?)* poco frecuente (F?) sobre un portaobjetos dispuesto dentro de una pequeña placa de Petri u otro recipiente similar. Los fragmentos de médula ósea se depositan ( Fig. 1.3). Se pueden juntar con un poco de sangre de la médula con un cubreobjetos para realizar los extendidos o los preparados por presión. Los extendidos de médula ósea se preparan de la misma manera que los frotis sanguíneos ( Fig. 1.4). Los fragmentos de médula ósea se disponen sobre el borde en pluma del extendido ( Fig. 1.5). Una de sus ventajas es que el riesgo de magullar a las células es menor. La desventaja es que al arrastrar a los fragmentos de médula ósea quedan pocas células nucleadas disponibles para su evaluación. (F) poco frecuente Los preparados por presión pueden obtenerse mediante distintos métodos. A fin de proteger a las células, los fragmentos de médula ósea deben presionarse con extremo cuidado. Se puede ejercer la presión con ayuda de un portaobjetos, que se arrastra sobre el primer portaobjetos en dirección longitudinal. De esta manera, el material de los fragmentos se extiende en una capa más fina. Una forma más preservadora pero más difícil es la realización de preparados por presión con un cubreobjetos grande. En este caso, el cubreobjetos se emplea como una espátula para extender los fragmentos de médula ósea sobre el portaobjetos ( Fig. 1.6). Debe tenerse en cuenta que en los extendidos derivados de punciones de médula ósea, existe un número suficiente de regiones finas que, gracias a la distribución homogénea de los elementos celulares que permanecen íntegros y en lo posible cercanos, permiten una evaluación correcta. Cuando la técnica se realiza de manera óptima, los preparados por presión tienen la ventaja de que existe una gran superficie con células nucleadas entre los fragmentos de médula ósea para su evaluación ( Fig. 1.7). La desventaja es el riesgo de la presencia de artefactos como consecuencia de la presión Citología frente a histología En la citología de médula ósea, es posible la evaluación morfológica de las células individuales ( Fig. 2.1 y Fig. 2.2). Por el contrario, la fortaleza de la histología radica en la representación de la estructura de la médula ósea, de la formación de fibras y en el reconocimiento de alteraciones locales, como por ejemplo, infiltrados de células tumorales o granulomas. La comparación de las observaciones citológicas e histológicas aporta los puntos centrales que se muestran en el cuadro de la izquierda ( Cuadro 1.2) para cada uno de los métodos de evaluación. Debe considerarse como regla general que, en todos los casos en los que la evaluación citológica e histológica resulte dudosa y en la punción seca, el diagnóstico que prevalece es el histológico. 1.2 Generalidades acerca de los métodos de tinción Para la evaluación morfológica de los preparados de

5 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Generalidades acerca de los métodos de tinción 5 Anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína Anticuerpo puente (de conejo) Complejo APAAP Anticuerpo primario (de ratón, monoclonal) Célula con el antígeno Célula con el antígeno Fig. 1.8 Principio de la inmunocitología con anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína Fig. 1.9 Principio de la inmunocitología con métodos inmunocitoquímicos (reacción APAAP) sangre y de médula ósea, se realiza una tinción panóptica según Pappenheim ( Cap. 1.7). Además de la tinción panóptica de Pappenheim, existen otras tinciones especiales y reacciones citoquímicas. Las tinciones especiales se fundamentan en la detección de sustancias particulares en las células (ejemplo: detección de hierro con la tinción de azul de Prusia). Las reacciones citoquímicas utilizan enzimas presentes en las células para transformar sustratos incoloros en productos coloreados (ejemplo: peroxidasa). Estas últimas reacciones dependen de que las enzimas correspondientes no se hayan degradado y, por lo tanto, puedan ser utilizadas sólo durante un tiempo limitado sobre preparados conservados a temperatura ambiente. Debido a las técnicas alternativas, como por ejemplo, la citometría de flujo, las tinciones citoquímicas tienen actualmente escasa relevancia: se utilizan principalmente la reacción de la peroxidasa para la identificación de leucemias mieloides y la tinción de azul de Prusia sobre el hierro en los síndromes mielodisplásicos. Los métodos inmunocitológicos permiten la detección de antígenos de superficie, antígenos citoplasmáticos y antígenos nucleares. Estos métodos fueron creados gracias al desarrollo de los anticuerpos monoclonales. La gran cantidad de anticuerpos monoclonales producidos que reconocen células hematopoyéticas y linfoides ha hecho necesaria la creación de una nomenclatura internacional única, que fue desarrollada durante los International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens y que actualmente continúa con la denominación de Human Cell Differentiation Molecules. Los anticuerpos monoclonales que presentan reactividad serológica similar, que reconocen el mismo antígeno, aunque no necesariamente el mismo epítopo de un antígeno, fueron asignados a un así llamado grupo de diferenciación (cluster of differentiation, CD) y numerados consecutivamente. La lista detallada con numerosas referencias puede encontrarse en Internet ( La reacción de los anticuerpos monoclonales específicos (anticuerpos primarios) puede visualizarse o detectarse de diversas maneras: los anticuerpos primarios pueden conjugarse directamente con cromóforos fluorescentes ( Fig. 1.8) y el resultado de la reacción puede visualizarse mediante un microscopio de fluorescencia. La desventaja de este método es que sólo puede evaluarse la morfología mediante contraste de fase. Además, los preparados pierden rápidamente la fluorescencia (decaen) y, por lo tanto, no pueden ser archivados. Otro método para la visualización de la reacción de los anticuerpos primarios es la reacción APAAP (alkaline-phosphatase and mouse monoclonal antialkaline-phosphatase). En ella, el primer anticuerpo se acopla a un anticuerpo anti-ig de ratón (anticuerpo puente), que, a su vez, es reconocido por un anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con fosfatasa alcalina. Esta enzima puede transformar un sustrato en una sustancia de color rojo brillante ( Fig. 1.9). La realización de las evaluaciones inmunocitológicas requiere que las estructuras superficiales de las

6 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Consideraciones iniciales y técnicas células estén intactas. Por consiguiente, los preparados que deben evaluarse mediante técnicas inmunocitológicas deben procesarse o congelarse en un plazo no mayor de 24 horas. Para el congelamiento, los preparados deben envolverse en papel de aluminio. Antes de la realización de las técnicas inmunocitológicas, los preparados se descongelan dentro del envoltorio. 1.3 Observación microscópica Frotis de sangre periférica La observación microscópica de un extendido sanguíneo se realiza en primera instancia con los objetivos 10 y 40 con un ocular 10, a fin de obtener rápidamente un panorama general respecto de la cantidad y la calidad de las células presentes en el preparado y, dado el caso, también de sucesos poco frecuentes. La verdadera diferenciación del frotis sanguíneo se realiza con ayuda de la inmersión en aceite con objetivos 60 a 100. Se recorre el último tercio del extendido en patrón de guarda griega, sin prestar atención a las prolongaciones terminales, dado que en esta zona pueden acumularse artificialmente algunos glóbulos blancos parcialmente dañados, lo que puede originar falsos recuentos. Por otro lado, en esta porción del preparado, al igual que en los laterales, pueden buscarse intencionalmente células patológicas. Las sombras nucleares o las células alteradas artificialmente no se incluyen en la diferenciación (existe una posible excepción en la LLC: en este caso, se considera que deben incluirse las sombras nucleares en la diferenciación). Durante la evaluación de la morfología de los eritrocitos, debe tenerse en cuenta que su forma se modifica artificialmente en las zonas muy finas o muy gruesas del extendido. Es importante realizar la observación esquemáticamente, casi como si se siguiera una lista, para no olvidar nada: Eritrocitos: Tinción? Tamaño en relación a los linfocitos? Morfología? (p. ej., esferocitos, inclusiones malaria, fragmentocitos, etc.) Plaquetas: Número en relación a los eritrocitos? Agregados? Tamaño normal? Megaplaquetas? Etc. Células nucleadas: Cantidad? Composición? Signos de displasia de los neutrófilos? Modificaciones reactivas de los linfocitos? Células patológicas? Precursores nucleados de la serie roja? Durante la evaluación de la composición cuantitativa de leucocitos, debe tenerse presente la elevada variación estadística que conlleva el recuento habitual de 100 células. El intervalo de confianza de 95% para un valor de 5% sobre 100 células evaluadas es de entre 0,64 y 9,36% Preparados de médula ósea Al igual que con los frotis sanguíneos, los preparados de médula ósea deben visualizarse inicialmente con bajo aumento, a fin de obtener una visión general del cuadro celular y evitar la falta de detección de modificaciones localizadas (nidos de células tumorales, granulomas). En todos los casos, los hallazgos más llamativos se esclarecen mediante inmersión en aceite, con aumento de 60 a 100 veces. Su utilización se ubica en segundo lugar después del examen médico. Sólo este tipo de análisis combinado de la punción medular requiere integridad de las células. El recorrido inicial del preparado con poco aumento facilita también el reconocimiento de aquellas zonas en las cuales las células pueden evaluarse adecuadamente. Las zonas ideales y más representativas son las cercanas a los fragmentos de médula ósea, en las cuales las células se encuentran bien distribuidas y teñidas, sin artefactos producidos por la presión. Las células no intactas (sombras nucleares, células magulladas o que demuestren otros artefactos) no se incluyen en la evaluación. Sin embargo, la presencia de una proporción elevada de dichos artefactos debería constar en el informe, puesto que limita la capacidad de evaluación del preparado. En el informe de una evaluación de médula ósea también es importante completar sistemáticamente los distintos ítems y documentarlos como corresponde: Panorama general: Celularidad? Artefactos? Nidos de células tumorales? Otras particularidades? Megacariocitos: análisis cualitativo y cuantitativo Eritropoyesis: proporción y estado de maduración de las células nucleadas, modificaciones displásicas, alteraciones de la maduración? Granulopoyesis: Diferenciación normal? Multi-

7 b qxd 5/18/11 12:41 PM Page Preparados de médula ósea 7 plicación de blastos, desviación a la izquierda? Signos de displasia o alteraciones de la maduración? Particularidades: Eosinofilia? Mastocitos? Plasmocitos? Linfocitos? Células patológicas? La producción periódica de análisis cuantitativos de médula ósea se realiza en una minoría de laboratorios. Para el número de células por analizar que se emplea de rutina (entre 200 y 500), la significancia es moderada debido a la variación estadística. En consecuencia, para una proporción de 5% de un total de 500 células analizadas, el intervalo de confianza de 95% se ubica entre 3,05 y 6,95%. Sin embargo, durante la evaluación de la remisión o en el diagnóstico de una leucemia aguda, se incluye una proporción de células correspondiente a los blastos. Naturalmente, en este caso, se debe procurar contar los blastos en relación con una cantidad de células relativamente grande. Por último, debe mencionarse que, para todo aquel interesado en la hematología, resulta extremadamente valioso construir una colección de preparados de muestra. Otras posibilidades surgen a partir de la documentación fotográfica obtenida por técnicas digitales, que en la actualidad se encuentra fácilmente disponible Conceptos clave del diagnóstico hematológico microscópico CONCEPTOS CLAVE El diagnóstico no es posible sin frotis óptimos; el recorrido inicial de los preparados a escaso aumento; la evaluación sistemática de todas las series celulares; el resumen de la evaluación de los preparados de sangre y médula ósea.