1. INTRODUCCIÓN LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Los compuestos fenólicos en el vinagre de vino OBJETIVOS 6 3. MATERIAL Y MÉTODO 7

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3 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN EL VINAGRE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Los compuestos fenólicos en el vinagre de vino OBJETIVOS 6 3. MATERIAL Y MÉTODO Material Muestras Materia prima Proceso de elaboración de vinagres Codificación de las muestras Reactivos Instrumentación Métodos Índice de polifenoles totales Determinación de antocianos totales Determinación de compuestos fenólicos por cromatografía de líquidos Análisis sensorial Análisis estadístico 16

4 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Índice de polifenoles totales Identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos Tratamiento estadístico de los resultados Análisis cluster Análisis de la varianza 28 a) Influencia del grosor de la madera 28 b) Relación: Madera Compuestos fenólicos. 29 c) Relación: Proceso de acetificación Compuestos fenólicos Determinación de antocianos totales Análisis sensorial Prueba triangular Análisis descriptivo CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA ANEXO

5 Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1. EL VINAGRE La palabra vinagre procede etimológicamente del latín vinum acre de la que deriva la locución francesa vin aigre equivalente al vino agrio, pero en esta acepción su procedencia no queda relegada al vino, sino que cualquier sustrato amiláceo es susceptible de ser utilizado como materia prima. Según la FAO/OMS (1982), el vinagre es un líquido, apto para el consumo humano, que es producido exclusivamente a partir de materias primas de origen agrícola, que contengan almidones y/o azúcares, por un doble proceso de fermentación alcohólica y acética. Puede contener cantidades determinadas de ácido acético, y otros ingredientes opcionales (hierbas, especias, sal), lo que será regulado por la Comisión del Codex Alimentarius, según el tipo de ingrediente, al objeto de obtener un aroma peculiar y característico de cada tipo de vinagre. Según la Reglamentación Técnico Sanitaria correspondiente (Presidencia del Gobierno, 1993) con la denominación genérica de vinagre se designa: el líquido apto para el consumo humano resultante de la doble fermentación, alcohólica y acética de productos de origen agrario que contengan azúcares o sustancia amiláceas, con una riqueza mínima de 50 g/l de acético, excepto para el vinagre de vino, que será, al menos, de 60 g/l. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez total expresada en gramos de ácido acético por 100 ml, a 20ºC. El vinagre de vino es un producto muy apreciado en los países tradicionalmente productores de vino, en especial los de la cuenca mediterránea, siendo Italia el principal país productor de la Unión Europea, seguido de España y Francia. En Italia diversos autores han apuntado ya la necesidad de proteger y explotar el vinagre de vino como producto alimentario típico nacional. La defensa del mismo debe fundamentarse en criterios de calidad, y es recomendable que estos se basen en medidas objetivas de constituyentes de su composición química y en criterios sensoriales de aceptación por el consumidor. La calidad del vinagre viene determinada tanto por la materia prima de partida como por los métodos y operaciones tecnológicas empleados en su 1

6 Introducción elaboración. Hoy día, el vinagre de vino se obtiene mediante dos métodos de acetificación que dan lugar a productos muy diferentes desde el punto de vista químico y organoléptico. Podemos hablar así de dos tipos de vinagre: los artesanales o producidos mediante un proceso lento de acetificación, con cultivo superficial (el que nos ocupa en este trabajo); y los obtenidos por acetificación rápida en biorreactores específicos, con cultivo sumergido. Es sabido que la manera en la que el vinagre es producido da como resultado productos de muy diferente calidad (Tesfaye et al., 2002a). Estos productos difieren en su perfil fenólico, compuestos aromáticos y contenido en ácidos orgánicos (Morales et al., 2001; Natera et al., 2003), siendo los más apreciados aquellos productos elaborados mediante método tradicional debido a sus extraordinarias características sensoriales (González Viñas et al., 1996). Existe una variante intermedia entre los métodos anteriormente mencionados denominado método de Schützenbach. Este método emplea materia inerte (virutas de madera de haya) como medio de soporte para las bacterias acéticas. Las bacterias acéticas se encuentran adheridas al soporte de virutas y sumergidas en el líquido a acetificar, a su vez éste va recirculando hasta alcanzar el grado acético deseado. Se consigue así un aumento de la velocidad de acetificación LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, que están asociados con las características de flavor y color en los alimentos de origen vegetal (frutas, zumo, vino, etc ). Están presentes sobre todo en hojas, frutos, corteza e incluso madera de vegetales. Son un grupo muy amplio de compuestos químicos, mas de 8000, y se caracterizan por presentar todos ellos, el núcleo aromático de benceno, sustituido, como mínimo, con un grupo hidroxilo. Los compuestos fenólicos se localizan en las partes sólidas de la uva (hollejo, raspón y pepitas) y son responsables del color, astringencia y estructura de los vinos, por lo que tienen una considerable incidencia en sus características organolépticas, y han sido extensamente estudiados. La síntesis de los compuestos fenólicos en las plantas tiene lugar vía dos rutas metabólicas. La vía de los policétidos, minoritaria en plantas superiores, y la vía del ácido sikímico. Ambas vías pueden participar conjuntamente en la formación de fenoles complejos. 2

7 Introducción Podemos distinguir: - Los fenoles simples son aquellos compuestos que tienen un anillo aromático simple con uno o más grupos hidroxilo, un claro ejemplo de ellos es el ácido cafeico. - Los compuestos polifenólicos son aquellos cuya estructura está formada por múltiples núcleos aromáticos con sustituyentes hidroxilo, como ejemplo de ellos tenemos a la (+) catequina y al ácido elágico (Waterhouse, 2002). Entre los compuestos fenólicos existentes en los alimentos, se pueden distinguir dos grandes familias los no flavonoides (ácidos fenólicos, estilbenos y taninos hidrolizables) y los flavonoides (flavanoles, flavonoles y antocianos, entre otros) Los compuestos fenólicos en el vinagre de vino En el vinagre de vino encontramos estos compuestos debido a su contenido natural en la uva o como resultado del contacto con la madera durante el envejecimiento. El análisis de los compuestos fenólicos en los vinagres de vino ha sido objeto de estudio de varios autores. La cromatografía líquida con detector de diodos es la técnica analítica más utilizada para su identificación y cuantificación. Los pioneros en la determinación de compuestos fenólicos en vinagres de vino por cromatografía líquida fueron Barroso et al. (1992). Ellos aplicaron por primera vez la cromatografía líquida (CL) al análisis de vinagres utilizando una extracción en rotación continua con acetato de etilo para extraer los compuestos fenólicos. La separación se llevó a cabo en gradiente usando metanol/agua/ácido acético y la identificación utilizando detector de fotodiodos. García Parrilla et al. (1994) separaron e identificaron ácidos fenólicos en vinagres de vino blanco y de Jerez, también por CL. Las muestras se concentraron con rotavapor, la separación en régimen isocrático y utilizaron detector de longitud de onda múltiple fijada a 280 nm. Con este método consiguieron una buena separación de la mayoría de los ácidos fenólicos y aldehídos característicos de vinagres. Identificaron 11 compuestos fenólicos: (+) catequina, vainillina y los ácidos gálico, pirogálico, protocatéquico, gentísico, p hidroxibenzoico, vainíllico, cafeico, siríngico y p cumárico. Más tarde, utilizando la inyección directa de las muestras analizaron vinagres de Jerez por 3

8 Introducción CL en fase reversa y detección de fotodiodos, identificando más de 20 compuestos algunos de los cuales no se habían descrito en vinagres de Jerez hasta entonces: HMF, furfural, tirosol, ácido caftárico, ácido p cumaroiltartárico e isoquercetina, entre otros (García Parrilla et al., 1996). La cromatografía líquida con detección por espectrofotometría de masas (CL EM) también se ha utilizado para determinar compuestos fenólicos en vinagres (Andlauer et al., 2000). Estos autores propusieron un nuevo método para la separación simultánea y cuantificación de ácidos fenólicos polares y flavonoides menos polares, en muestras de vinagre de vino producidos por cultivo sumergido. Identificaron y cuantificaron ácidos fenólicos (ácido protocatéquico y cafeico), flavanoles ((+) catequina y ( ) epicatequina), tanto en vinagres de vino blanco como tinto, y antocianos (delfinidina 3 glucosido, cianidina 3 glucosido, petunidina 3 glucosido, peonidina 3 glucosido, malvidina 3 glucosido, acetato de malvidina 3 glucosido y cumarato de malvidina 3 glucosido) en vinagres de vino tinto. En general, podemos decir que se conoce bien la composición fenólica de vinagres de vino blanco y de Jerez (García Parrilla et al., 1994, 1996, 1997, 1998; Tesfaye et al., 2002, 2004; Morales et al., 2001; Alonso et al., 2004), pero está poco explorada en los vinagres de vino tinto (Andalauer et al., 2000). La diversidad de los vinagres de vino en el mercado y el incremento de su demanda requiere su caracterización para establecer parámetros de control de calidad. Los compuestos fenólicos han demostrado ser buenos indicadores del origen y calidad de los vinagres. Los compuestos fenólicos de bajo peso molecular fueron útiles para diferenciar entre vinagres envejecidos y sin envejecer, así como entre vinagres de Jerez y aquellos que pertenecían a otras zonas de España (Gálvez et al., 1995). García Parrilla et al. (1997 y 1998) confirmaron que los compuestos fenólicos eran una herramienta útil para clasificar y predecir la pertenencia de las muestras de acuerdo con el método de elaboración utilizado o el origen geográfico del sustrato de partida. Basándose en su composición fenólica también fue posible diferenciar muestras de vinagres de Jerez con distinto periodo de envejecimiento (menos de 2 años, y más de 2 años) (García Parrilla et al., 1999). Tesfaye et al. (2002b) lograron discriminar muestras de vinagres de vino con distintos periodos de envejecimiento. Los vinagres se elaboraron en un fermentador de laboratorio (cultivo sumergido) utilizando vino de Jerez como sustrato de partida. Los vinagres obtenidos se sometieron a envejecimiento en barriles de madera de 16 L de capacidad. Consiguieron diferenciar muestras 4

9 Introducción que habían sido sometidas a envejecimiento de aquellas que no lo habían sido, poniendo de nuevo de manifiesto la utilidad de los compuestos fenólicos como indicadores de envejecimiento. El envejecimiento acelerado de vinagres de vino mediante chips de madera de roble resulta ser una buena práctica para disminuir el tiempo de envejecimiento (Tesfaye et al., 2004). A los 15 días de envejecimiento se observó un aumento de la concentración de ácido gálico y sobre todo de los aldehidos aromáticos (siringaldehido, sinapaldehido, coniferaldehido y vainillina). En cuanto a la influencia de determinadas técnicas como la filtración sobre el contenido fenólico, López et al. (2005) demostraron que la clarificación del vinagre por microfiltración tangencial no afecta en gran medida al contenido de compuestos fenólicos de los vinagres tratados. Las resinas de intercambio iónico por el contrario, presentan afinidad por los ácidos hidroxicinamicos, (+) catequina y ácido gálico (Achaerandio et al., 2006). 5

10 Objetivos 2. OBJETIVOS Este estudio se centra en los compuestos fenólicos de vinagres de vino tinto elaborados mediante cultivo superficial. El trabajo se encuadra dentro de las actividades programadas en el proyecto financiado por el VI programa Marco de la UE (Programa CRAFT) denominado WINEGAR, en el que participan 4 universidades y 4 pymes. En él se pretende estudiar la influencia del uso de otras maderas (además del roble) y del grosor de las mismas en la calidad de los vinagres y la eficacia de la acetificación. Las nuevas maderas propuestas en este trabajo son: cerezo, castaño y acacia; en grosores de 2,5, 2 y 1,5 cm. Se han elegido maderas más porosas que el roble y barricas de menor grosor que las generalmente utilizadas en la elaboración del vino. La elección de un tamaño de poro superior y un grosor de madera inferior se fundamenta en conseguir una mayor transferencia de oxígeno, y por tanto mayor eficacia en la velocidad de acetificación. Los objetivos del presente trabajo se centran en: - La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos presentes en muestras de vinagre de vino tinto. - Estudiar los cambios en la composición fenólica durante el proceso de acetificación en barricas de diferentes maderas. - Estudiar la relación: tipo de madera compuestos fenólicos para diferentes clases de maderas. 6

11 Material y Métodos 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. MATERIAL Muestras Materia Prima Se utilizaron dos sustratos de partida (vino tinto) diferentes: - Serie F: Procedencia Bannyuls (Francia), grado alcohólico 14,5 % v/v, acidez total 0,9 g de ácido tartárico/100 ml vino, concentración de glucosa+fructosa 20,9g/L+ 43,4g/L, ph 3,4, 100 % variedad Garnacha. - Serie T: Procedencia Priorat (Tarragona), grado alcohólico 13,6 % v/v, acidez total 0,9g de ácido tartárico/100 ml vino, concentración de glucosa+fructosa 0,36g/L + 0,78g/L, ph 3,3, variedad Garnacha mayoritariamente. Las dos series F y T se acetificaron en barricas de madera con cultivo superficial. Se emplearon 4 tipos de maderas para la elaboración de las diferentes barricas; Cerezo (C), Castaño (S), Acacia (A) y Roble (R) de 60 L de capacidad, fabricadas ex profeso con idéntico tratamiento por la Compañía Botería Torner S.L. De cada madera se prepararon tres grosores distintos (2,5, 2 y 1,5 cm). En este estudio se han tomado dos barricas iguales de cada grosor, en total 48 barriles para la serie F y T (Figura 3.1). 7

12 Material y Métodos SERIE F /SERIE T C A S R 2,5 cm 2 cm 1,5 cm C = Cerezo A = Acacia S = Castaño R = Roble 1 2 Figura 3.1. Esquema de las barricas empleadas Proceso de elaboración de vinagres Antes de comenzar el proceso de acetificación, el vino de partida de la serie F se diluyó hasta 11º alcohólico con agua. Posteriormente se le añadió el inóculo en proporción: 1/3 de inóculo + 2/3 de vino de partida, y se mezclaron bien. El vino de la serie T se mezcló directamente con el inóculo en la misma proporción que en la serie F. Seguidamente se llenaron todas las barricas con esa mezcla vino inóculo hasta un total de 40 Litros, siendo la relación superficie/volumen de 63 cm 2 /L. Las barricas habían sido envinadas previamente, y contenían un pequeño volumen residual. Inmediatamente después del llenado de las barricas se recogió una muestra de cada tipo de madera y grosor, y se las consideró como punto O. Estas muestras tenían 0,8º acéticos. Posteriormente, se recogieron muestras de cada una de las barricas al alcanzar distintos grados acéticos; 2º (punto I), 4º (punto H) y 6º (punto E). 8

13 Material y Métodos Este proceso fue idéntico para ambas series. La duración de los ciclos fue de uno a tres meses en los vinagres obtenidos de la serie F y de cinco a nueve meses en los de la serie T. Esta duración depende de la temperatura ambiente de la bodega, siendo mayor para temperaturas más altas, ya que la velocidad óptima de crecimiento de las bacterias acéticas es del orden de 30º C Codificación de las muestras Se han analizado 83 muestras de la serie F y 85 muestras de la serie T, todas ellas por duplicado. En total se analizaron 166 muestras por duplicado, que corresponden a los dos vinos de partida (serie F y T), muestras tomadas en fase de acetificación (2 y 4 º acéticos) así como vinagres acabados (6º acéticos). La codificación de las muestras fue; en primer lugar: vino(w) o vinagre (V), en segundo lugar el origen: Francia (F) o Tarragona (T), en tercer lugar el punto de acetificación: 0,8 º acético (O), 2º acético (I), 4º acético (H) y 6º acético (E), en cuarto lugar la madera: Acacia (A), Cerezo (C), Castaño (S) y Roble (R), en quinto lugar el grosor: 25 mm (25), 20 mm (20), 15 mm (15), y por último el número de réplica: primera (1) y segunda (2) Reactivos a) Reactivos empleados para la determinación de los polifenoles totales. - Ác. gálico (Fluka 48630) - Reactivo de Folin Ciocalteu (Merck UN3264) - Carbonato sódico (Panreac ) - Agua destilada b) Reactivos empleados en la determinación de antocianos totales. - Cloruro potásico 0,025 M, ph 1.0 (Panreac ) - Acetato sódico 0,4 M, ph 4,5 (Panreac ) - Cloruro sódico(panreac ) - Ác. clorhídrico (Panreac ) 9

14 Material y Métodos c) Eluyentes y reactivos (CL). - Acetonitrilo (Merck ) - Trifluoro acético (Panreac ) - Agua Milli Q d) Sustancias patrón Se han empleado un total de 30 patrones comerciales, correspondientes a los principales compuestos fenólicos del vino (Tabla 3.1). Compuestos fenólicos Proveedor Referencia Ác. gálico Fluka Ác. protocatéquico Sigma P 5630 Furfural Merck Ác. 4 hidroxibenzoico Fluka Tirosol Fluka Ác. 3 hidroxibenzoico Fluka Hidroximetilfurfural Merck Ác. caftárico Chromadex ASB Ác. vainíllico Sigma V 2250 Epigalocatequina Sigma E 3768 Ác. cafeico Fluka (+) Catequina Sigma C 1251 Aldehído vainíllico Merck Ác. siríngico Sigma S 6881 Ác. p cumárico Fluka Ác. benzoico Fluka Galato de etilo Fluka Siringaldehído Aldrich ( ) Epicatequina Fluka Ác. ferúlico Fluka Coniferaldehído Aldrich Ác. elágico Sigma 2250 Sinapaldehído Aldrich Rutina Sigma R 5143 Malvidina 3 O glucósido Fluka Ác. cinámico Fluka Resveratrol Merck Quercetina Fluka Tabla 3.1. Patrones de compuestos fenólicos. 10

15 Material y Métodos Instrumentación - Equipo cromatográfico Agilent serie 1100, formado por: Inyector automático Serie 1100 G1313A Bomba cuaternaria Serie 1100 G1311A Compartimento de columna termostatizada Serie G1316A Desgasificador en línea Serie 1100 G1379A Detector de haz de fotodiodos Serie 1100 G1315B - Columna Zorbax SB C18 en fase reversa, tamaño partícula 3,5 μm, 4,6 x 30 mm. - Precolumna Zorbax SB C18 4,6 x 12,5 mm. - Software ChemStation for LC 3D Rev. A [1757] Copyright Agilent Technologies ( ). - Espectrofotómetro Hitachi UV2800, termostatizado con un sistema Peltier a 25 ºC y con accesorio multicubetas. - Balanza Analítica Mettler con aproximación de 0,0001g. - Agitadores magnéticos Selecta P. - Baño Ultrasonido Selecta P con capacidad de 6L. - ph metro Crison GLP22. - Baño de agua termostatizado digital BUCHI. - Vortex IKA 230V, 50/60Hz. - Sistema de filtración de agua Milli Q Millipore. - Filtros con un tamaño de poro de 0,45 μm Millipore. - Micropipeta digital Nichipet EX Nichiryo de 10 a 100 μl. - Micropipeta digital Nichipet EX Nichiryo de 100 a 1000 μl. - Desecador de vidrio con gel de sílice. 11

16 Material y Métodos - Cubetas de vidrio de 10 mm de paso de luz. - Estufa de desecación P Selecta MÉTODOS Índice de polifenoles totales La determinación de la concentración de polifenoles totales se llevó a cabo según el método de Folin Ciocalteu micro método (Waterhouse et al., 2001) expresada en equivalentes de ácido gálico (EAG). Disolución patrón de ácido gálico: se disuelven 0,500 g de ácido gálico, previamente desecado, en 100 ml de agua. Curva de calibrado: Se toman 0, 1, 2, 3, 5 y 10 ml de la disolución patrón, se vierten en matraces aforados de 100 ml y se diluyen con agua hasta enrase. La concentración de fenol en estas disoluciones es de 0, 50, 100, 150, 250 y 500 mg/l, respectivamente. De cada una de estas disoluciones se toma 20 μl y se vierten en la correspondiente cubeta. Se añade a cada cubeta 1,58 ml de agua. Se agita, se añaden 100 μl de Folin Ciocalteu y se mezcla bien de nuevo. Después de 30 segundos y antes de 8 minutos, se añaden 300 μl de solución de carbonato sódico al 20% y se agita bien. Se deja reposar las disoluciones en un baño a 40ºC durante 30 min y se determina la absorbancia de cada disolución a 765 nm. Se representa la absorbancia frente a la concentración. En el caso de los vinagres, se diluyen 50 μl de muestra en 1 ml para que la medida de absorbancia esté entre los valores de mínimo error en espectrofotometría. Se toman 20 μl de esta disolución y se procede como antes, a partir de la adición de 1,58 ml de agua. Para la preparación del blanco se toman 20 μl de agua y a partir de aquí se procede de la misma manera que en los casos anteriores Determinación de antocianos totales La determinación de la concentración de antocianos totales se llevó a cabo según el método de antocianos monoméricos totales por diferencia de ph (Giusti et al., 2001). 12

17 Material y Métodos Las muestras se filtraron previamente con papel de filtro Watmann nº 1. Se determinó el factor de dilución para el que la absorbancia de la muestra a la longitud de onda máxima (520 nm), se encuentra dentro del rango lineal del espectrofotómetro. El factor de dilución fue de 5. Se preparan dos disoluciones de cada muestra; una con tampón de cloruro potásico ph 1,0 y otra con tampón de acetato sódico ph 4,5. En ambos casos se toman 600 μl de muestra y se les añaden 2,4 ml de la disolución tampón correspondiente. Posteriormente, se mide la absorbancia de cada disolución a 520 y 700 nm, tomando como blanco agua destilada. La absorbancia de la muestra diluida (A) se calcula de la siguiente manera: A = (Aλ vis max A700)pH 1,0 (Aλ vis max A700)pH 4,5 La concentración de antocianos monoméricos en las muestras de vinagres se ha expresado en mg/l de glucósido de malvidina utilizando la siguiente fórmula: Antocianos monoméricos (mg/l) = (A x MW x DF x 1000)/ (ε x 1) Donde: A= Absorbancia de la muestra MV = Peso molecular (528,89) FD = Factor de dilución ε = Absortividad molar (20200 L cm 1 mol 1 ) Determinación de compuestos fenólicos por cromatografía de líquidos Las muestras se filtraron previamente con Filtros Millex LCR de 13mm. El volumen de inyección fue de 20 μl. El método utilizado fue el propuesto por Waterhouse et al. (2002). Su principal ventaja es la del corto tiempo de análisis de las muestras (18 min). La principal peculiaridad es la separación usando un alto flujo de 4 ml/min y la aplicación de un microespliter que limita el flujo al detector en 1 ml/min. La fase móvil estaba compuesta por dos eluyentes A (agua, ph 1,5) y B (acetonitrilo, ph 1,5), ambos ajustados su ph con trifluoro acético (0,2%). El gradiente se muestra en la Tabla

18 Material y Métodos Tiempo (min) Solvente A %(v/v) Solvente B % (v/v) Tabla 3.2. Gradiente empleado. Al final de las secuencias siempre se recalibraba con agua MilliQ (18 min). La identificación se llevó a cabo por superposición de los espectros, con los de los patrones correspondientes y cuantificación por calibrado externo (Tabla 3.3). Nombre del compuesto Rango de concentración (mg/l) Ecuación de la recta Coeficiente de regresión Tr (min) Ác. gálico y = 12,8X 9,1 0, ,5 280 Ác. protocatéquico 4 8 y = 6,3X + 2,0e 1 0, ,2 280 Furfural 3 30 y = 59,6X + 7,4 0, ,3 280 Ác. 4 hidroxibenzoico λ (nm) y = 8,4X 4,7 0, ,2 280 Tirosol 2,5 25 y = 3,5X 6,7e 3 0, ,6 280 Ác. 3 hidroxibenzoico 5 Hidroximetilfurfural y = 2,5X 6,1 0, , y = 40,8X 3,5 0, ,1 280 Ác. caftárico y = 1,5X 8,8e 1 0, , Ác. vainíllico 1 6 y = 8,3X 1,0e 1 0, ,5 280 Epigalocatequina y = 1,9X + 1,8 0, ,7 280 Ác. cafeico 2,5 25 y = 15,7X 8,9e 1 0, ,9 320 (+) Catequina 2,5 25 y = 3,2X 2,5e 1 0, ,9 280 Aldehído vainíllico y = 12,3X + 3,2 y = 14,7X 32,6 0, , ,7 280 Tabla 3.3. Calibrado externo. 14

19 Material y Métodos Nombre del compuesto Ác. siríngico Rango de concentración (mg/l) 0,5 5 2,5 25 Ecuación de la recta Coeficiente de regresión y = 158X 2,5e 1 0,99996 y = 31,5X 8,3e 1 0,99998 Tr (min) λ (nm) 4,8 280 Ác. p cumárico y = 26,8X 4,8 0, Ác. benzoico y = 1,8X 2,5 0, ,7 280 Galato de etilo 2,5 25 y = 12,7X 4,6e 1 0, ,5 280 Siringaldehído y = 11,4X 3,4e 2 y = 10,6X 13,5 0, , ,2 320 ( ) Epicatequina 2 6 y = 4,0X 3,0e 3 0, ,5 280 Ác. ferúlico y = 15,0X 12,6 0, ,2 320 Coniferaldehído y = 6,8X + 1,4 y = 8,8X 3,1 0, , ,5 320 Ác. elágico 3,2 50 y = 1,2X 3,4 0, ,9 280 Sinapaldehído 2 5 y = 3,3X + 6,1e 1 y = 5,1X 2,1 0, , ,0 320 Rutina y = 5,7X 5,3 0, ,5 365 Malvidina 3 Oglucósido y = 9,6X , ,3 520 Ác. cinámico y = 30,4X + 69,8 0, ,3 280 Resveratrol y = 31,8X 13,6 0, ,9 320 Quercetina 6 8 y = 7,8e 1 X + 6,6e 2 0, ,3 365 Tabla 3.4. Continuación Análisis sensorial a) Panel de cata El panel de cata estaba formado por 8 personas entrenadas adecuadamente en la cata de vinagres (Tesfaye, 2001); todas ellas habían realizado previamente varios cursos de cata y además contaban con experiencia en la cata de vinagres. Las edades de los miembros del panel de cata comprendían entre años. 15

20 Material y Métodos b) Prueba triangular La prueba triangular se llevó a cabo, siguiendo la norma UNE , para comprobar si las muestras elaboradas en barricas de distintas maderas eran diferenciadas por los miembros del panel de cata. c) Análisis descriptivo Además de la prueba triangular, se realizó un análisis descriptivo (UNE ) de las muestras que habían sido discriminadas por el panel de cata. Las muestras problema se describieron mediante fichas con escala hedónica no estructurada (UNE ). El panel de cata realizó varias sesiones para describir los nuevos aromas que se percibían en estas muestras de vinagre. Los miembros del panel escogieron los descriptores que más se ajustaban a los aromas de estos vinagres de manera independiente. Posteriormente se pusieron en común todos los descriptores y se redujo la lista por combinación de términos relativos. Por consenso entre los miembros del panel de cata se eligieron 10 atributos que describían a las muestras. El panel se sometió a entrenamiento de estos nuevos descriptores con referentes estándares. Las muestras que se sometieron a análisis sensorial son todas vinagres acabados (punto E). El análisis sensorial de todas las muestras de este trabajo se realizó siguiendo el protocolo de cata de vinagres que los miembros de este mismo grupo han elaborado (Tesfaye et al., enviado). Cada sesión de cata constaba de 4 muestras (análisis descriptivo) o 4 pruebas triangulares codificadas con 3 dígitos aleatorios. El orden de las muestras también era al azar. Las copas se llenaron con 15 ml de muestra y se cubrieron con vidrio de reloj. Las catas se realizaron en el área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia, en el laboratorio de prácticas a temperatura ambiente Análisis estadístico Los análisis de la varianza, discriminante y cluster se realizaron con el programa Statistica (Statsoft, 2001). 16

21 Resultados y Discusión 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. ÍNDICE DE POLIFENOLES TOTALES En las tablas 1 a 16 del Anexo se muestran los valores del Índice de Polifenoles Totales (IPT) de las muestras analizadas. Se utilizaron pruebas paramétricas de análisis de la varianza (ANOVA) para comprobar la existencia de diferencias significativas en el IPT durante el proceso de acetificación y para cada una de las maderas de ambas series (Tabla 4.1). Los valores máximos para este índice se encontraron en los vinagres elaborados en barricas de castaño en ambas series. En concreto en las muestras de castaño de la serie T el IPT aumenta significativamente un 21% a lo largo del proceso. En general el IPT no sufre variaciones importantes durante el proceso de acetificación. Se observa una disminución significativa del IPT en acacia (7%) y cerezo (13%) de la serie F, y cerezo (13%) de la serie T. MADERAS O I O H P level O E I H I E H E SERIE F SERIE T A 0,1261 0,0255 0,0451 0,3606 0,0790 0,2193 C 0,4385 0,4586 0,0130 0,9835 0,0284 0,0295 S 0,1461 0,1308 0,4708 0,5469 0,3412 0,2635 R 0,1880 0,0785 0,0585 0,6070 0,2785 0,3624 A 0,6781 0,4720 0,1997 0,7862 0,4369 0,5888 C 0,2354 0,6044 0,0214 0,8455 0,0275 0,0318 S 0,0169 0,0194 0,0079 0,2670 0,0429 0,7086 R 0,5724 0,4442 0,3670 1,0000 0,8964 0,8540 Tabla 4.1. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p valor< 0,05) en el IPT entre los distintos puntos del proceso de acetificación para cada madera. 17

22 Resultados y Discusión Estudios anteriores demuestran cómo el IPT no cambia a lo largo de la acetificación con cultivo sumergido para vinagres de vino blanco (Morales et al., 2001) y en el caso del tinto disminuye hasta un 13 % (Andlauer at a., 2000). Se analizó también, si existían diferencias significativas en el IPT entre las muestras de vinagre acabado (E) procedentes de cada una de las maderas (Tabla 4.2): - En la serie F se observó que sólo existían diferencias significativas entre los pares A C, C S, y S R. - En la serie T se observaron diferencias significativas entre todas las maderas excepto entre R A. A C A S P level A R C S C R S R Serie F 0,0041 0,0729 0,1075 0,0069 0,2058 0,0298 Serie T 0,0112 0,0231 0,0875 0,0045 0,0176 0,0026 Tabla 4.2. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p valor< 0,05) en el IPT de las muestras de vinagres acabados (E), comparación entre las distintas maderas. 18

23 Resultados y Discusión 4.2. IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS. En la Tabla 4.3 se muestran un total de 12 compuestos (ácidos fenólicos, flavanoles, estilbenos) identificados en las muestras. Número de pico Nombre del compuesto TR (min) λ (nm) 1 Ác. gálico 0, Ác. protocatéquico 1, Tirosol 2, Ác. caftárico 3, Ác. vainíllico 3, (+) Catequina 3, Ác. cafeico 3, Ác. siríngico 4, Galato de etilo 5, ( ) Epicatequina 6, Glucósido resveratrol 9, Ác. elágico Tabla 4.3. Compuestos identificados en los vinagres de la serie F y T. 19

24 Resultados y Discusión En las Figuras 4.1 y 4.2 se observan los cromatogramas de una muestra de vinagre acabado. mau 70 DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (VF D) min Figura 4.1. Cromatograma de una muestra de vinagre acabado (VFEC), 280 nm. mau DAD1 B, Sig=320,16 Ref=360,100 (VF D) min Figura 4.2. Cromatograma de una muestra de vinagre acabado (VFEC), 320 nm En las tablas 1 a 16 del anexo se muestran las concentraciones en mg/l de los compuestos identificados en todas las muestras analizadas. 20

25 Resultados y Discusión A modo de resumen en las Tablas 4.4 y 4.5 aparecen las concentraciones en mg/l de los compuestos fenólicos en los productos finales (punto E) de las distintas maderas de ambas series: - El ácido caftárico es el compuesto mayoritario, seguido del ácido gálico y tirosol. Estos datos coinciden con los observados por otros autores en vinagres de Jerez elaborados mediante cultivo sumergido (Morales et al, 2001). - El ácido gálico es el más abundante en las muestras producidas en madera de castaño para ambas series (serie F; 51,8 mg/l, serie T; 165,5 mg/l). - El glucósido de resveratrol sólo se detectó en las muestras de la serie F. Acacia Cerezo Compuestos VFEA VTEA VFEC VTEC Ác. gálico 28,5±0,20 32,7±0,06 28,6±0,15 29,5±0,04 Ác. protocatéquico 6,7±0,38 11,3±0,08 5,1±0,25 5,8±0,02 Tirosol 16,1±0,71 19,7±0,32 16,8±0,46 20,1±0,2 Ác. vainíllico 1,1±0,08 1,3±0,02 1,2±0,05 1,8±0,01 (+) Catequina 2,3±0,00 Ác. siríngico 3,0±0,26 2,7±0,04 4,5±0,19 4,3±0,01 Galato de etilo 12,9±0,06 7,8±0,53 ( ) Epicatequina Ác. elágico 2,8±0,28 5,3±0,6 1,5±0,10 4,1±0,03 Ác. caftárico 263,1±3,32 156,8±0,48 264,5±5,03 165,2±0,23 Ác. cafeico 52,7±0,00 5,4±0,15 6,0±0,01 Glucósido resveratrol 3,4±0,13 3,3±0,22 ( ); Compuestos no detectables. Tabla 4.4. Concentración en mg/l de los compuestos fenólicos en los distintos vinagres acabados. Media y desviación estándar. 21

26 Resultados y Discusión Castaño Roble Compuestos VFES VTES VFER VTER Ác. gálico 77,9±0,99 162,7±0,07 30,2±0,10 34,0±0,06 Ác. protocatéquico 6,5±0,82 7,9±0,07 5,8±0,13 5,8±0,01 Tirosol 16,5±0,32 14,2±0,17 16,1±0,07 13,3±0,16 Ác. vainíllico 1,3±0,04 1,6±0,04 1,4±0,05 1,7±0,05 (+) Catequina 2,8±0,23 1,7±0,02 7,6±0,12 2,0±0,07 Ác. siríngico 4,4±0,59 4,1±0,01 4,9±0,10 4,2±0,01 Galato de etilo 10,7±1,07 17,9±0,11 9,3±0,51 ( ) Epicatequina 3,5±0,07 Ác. elágico 3,9±0,20 3,7±0,58 4,4±0,11±0,1 1 4,1±0,00 Ác. cafeiltartárico 268,8±0,58 186,2±0,11 273,5±2,22 176,6±0,24 Ác. cafeico 5,8±0,09 5,8±0,03 6,1±0,06 5,7±0,02 Glucósido resveratrol 3,4±0,13 3,7±0,06 ( ); Compuestos no detectables. Tabla 4.5. Continuación Tratamiento estadístico de los resultados Se ha empleado la estadística multivariante para analizar los resultados. En primer lugar se aplicó el análisis cluster para observar similitudes y agrupaciones que pudieran presentar las muestras sin que se determine previamente la pertenencia a un grupo. Posteriormente se comprobó si existían o no diferencias significativas en los compuestos fenólicos de vinagres elaborados en distintas maderas mediante análisis de la varianza. Finalmente se empleó el análisis discriminante para comprobar si existe una función que clasifique los vinagres en categorías correspondientes al tipo de madera. 22

27 Resultados y Discusión Análisis cluster Se ha empleado el método de Ward s, incluyendo como variables los 12 compuestos polifenólicos determinados (Figuras 4.3 y 4.4). Un primer subcluster agrupa la casi totalidad de las muestras de castaño (48 % serie F y 86 % serie T) (se amplían en las Figuras 4.5 y 4.6). VFOA25 VFOC25 VFOR15 VFOS25 VFOS20 VFOS15 VFOA20 VFOA15 VFOR25 VFOR20 VFIR20-1 VFIR25-1 VFIS25-1 VFIS25-2 VFIS20-1 VFIS20-2 VFIS15-1 VFIS15-2 VFIA25-1 VFIC15-2 VFHR15-2 VFER15-2 VFIC25-2 VFIC20-1 VFHC20-1 VFER20-1 VFER25-1 VFHR15-1 VFHR20-1 VFOC20 VFIR15-1 VFIC20-2 VFEC20-2 VFIR25-2 VFIR15-2 VFER15-1 VFHR25-1 VFER25-2 VFHA25-1 VFEA25-1 VFEA25-2 VFIA25-2 VFIA15-2 VFHA20-2 VFIA15-1 VFHA15-2 VFOC15 VFHR25-2 VFIR20-2 VFHC25-1 VFEC15-1 VFIC15-1 VFHC15-2 VFEC25-1 VFEC25-2 VFIC25-1 VFHC25-2 VFHC20-2 VFHC15-1 VFHR20-2 VFER20-2 VFHA25-2 VFHA20-1 VFEA20-1 VFEA20-2 VFHA15-1 VFEC20-1 VFIA20-1 VFEA15-1 VFEA15-2 VFIA20-2 VFEC15-2 VFHS25-1 VFHS20-1 VFHS15-1 VFES25-1 VFHS25-2 VFHS15-2 VFHS20-2 VFES25-2 VFES20-1 VFES Linkage Distance Figura 4.3. Análisis cluster serie F. 23

28 Resultados y Discusión VTOA25 VTOA20 VTOS15 VTIC25-1 VTER25-2 VTIR25-2 VTHR25-1 VTHR25-2 VTIR20-2 VTOR20 VTHR20-1 VTHR20-2 VTIR15-1 VTIR15-2 VTHR15-2 VTHR15-1 VTHC25-1 VTOR25 VTIR25-1 VTIR20-1 VTEC25-2 VTIA25-1 VTIA20-1 VTIA20-2 VTHA20-1 VTEA20-1 VTHA25-1 VTIA15-2 VTIA25-2 VTHA25-2 VTHA15-2 VTOA15 VTEC25-1 VTEC20-2 VTEC20-1 VTEC15-1 VTOC25 VTOR15 VTOS25 VTOS20 VTER20-1 VTER15-1 VTER15-3 VTER25-1 VTER20-2 VTIC25-2 VTHC20-2 VTHC15-2 VTIC20-2 VTIC15-1 VTIC15-2 VTHC15-1 VTHC25-2 VTHC20-1 VTOC20 VTOC15 VTIC20-1 VTEA20-2 VTIA15-1 VTEC15-2 VTEA15-2 VTHA15-1 VTEA15-1 VTEA25-1 VTEA25-2 VTHA20-2 VTIS25-1 VTIS15-1 VTIS15-2 VTHS25-1 VTHS25-2 VTHS15-1 VTHS15-2 VTIS25-2 VTIS20-1 VTIS20-2 VTES25-1 VTES25-2 VTHS20-1 VTHS20-2 VTES15-1 VTES20-1 VTES20-2 VTES Linkage Distance Figura 4.4. Análisis cluster serie T. 24

29 Resultados y Discusión VFIA20-2 VFEC15-2 VFHS25-1 VFHS20-1 VFHS15-1 VFES25-1 VFHS25-2 VFHS15-2 VFHS20-2 VFES25-2 VFES20-1 VFES Linkage Distance Figura 4.5. Análisis cluster serie F. Primer subcluster. VTIS25-1 VTIS15-1 VTIS15-2 VTHS25-1 VTHS25-2 VTHS15-1 VTHS15-2 VTIS25-2 VTIS20-1 VTIS20-2 VTES25-1 VTES25-2 VTHS20-1 VTHS20-2 VTES15-1 VTES20-1 VTES20-2 VTES Linkage Distance Figura 4.6. Análisis cluster serie T. Primer Subcluster. 25

30 Resultados y Discusión Un segundo subcluster en la serie F agrupa el 83% de las muestras correspondientes al punto cero y el 33% correspondientes al punto inicial de la acetificación (Figura 4.7). Esto significa que, efectivamente, a partir de un mismo sustrato y en las primeras fases de la acetificación las muestras son muy similares entre unas maderas y otras, diferenciándose con el tiempo. En la serie T aparece un segundo subcluster en el que se agrupan el 71% de las muestras de roble (Figura 4.8). Finalmente, un tercer subcluster muestras finales (Figuras 4.9 y 4.10). agrupa a la casi totalidad de las VFOA25 VFOC25 VFOR15 VFOS25 VFOS20 VFOS15 VFOA20 VFOA15 VFOR25 VFOR20 VFIR20-1 VFIR25-1 VFIS25-1 VFIS25-2 VFIS20-1 VFIS20-2 VFIS15-1 VFIS Linkage Distance Figura 4.7. Análisis cluster serie F. Segundo subcluster. 26

31 Resultados y Discusión VTOA25 VTOA20 VTOS15 VTIC25-1 VTER25-2 VTIR25-2 VTHR25-1 VTHR25-2 VTIR20-2 VTOR20 VTHR20-1 VTHR20-2 VTIR15-1 VTIR15-2 VTHR15-2 VTHR15-1 VTHC25-1 VTOR25 VTIR25-1 VTIR20-1 VTEC Linkage Distance Figura 4.8. Análisis cluster serie T. Segundo subcluster. VFIA25-1 VFIC15-2 VFHR15-2 VFER15-2 VFIC25-2 VFIC20-1 VFHC20-1 VFER20-1 VFER25-1 VFHR15-1 VFHR20-1 VFOC20 VFIR15-1 VFIC20-2 VFEC20-2 VFIR25-2 VFIR15-2 VFER15-1 VFHR25-1 VFER25-2 VFHA25-1 VFEA25-1 VFEA25-2 VFIA25-2 VFIA15-2 VFHA20-2 VFIA15-1 VFHA15-2 VFOC15 VFHR25-2 VFIR20-2 VFHC25-1 VFEC15-1 VFIC15-1 VFHC15-2 VFEC25-1 VFEC25-2 VFIC25-1 VFHC25-2 VFHC20-2 VFHC15-1 VFHR20-2 VFER20-2 VFHA25-2 VFHA20-1 VFEA20-1 VFEA20-2 VFHA15-1 VFEC20-1 VFIA20-1 VFEA15-1 VFEA Linkage Distance Figura 4.9. Análisis cluster serie F. Tercer subcluster. 27

32 Resultados y Discusión VTIA25-1 VTIA20-1 VTIA20-2 VTHA20-1 VTEA20-1 VTHA25-1 VTIA15-2 VTIA25-2 VTHA25-2 VTHA15-2 VTOA15 VTEC25-1 VTEC20-2 VTEC20-1 VTEC15-1 VTOC25 VTOR15 VTOS25 VTOS20 VTER20-1 VTER15-1 VTER15-3 VTER25-1 VTER20-2 VTIC25-2 VTHC20-2 VTHC15-2 VTIC20-2 VTIC15-1 VTIC15-2 VTHC15-1 VTHC25-2 VTHC20-1 VTOC20 VTOC15 VTIC20-1 VTEA20-2 VTIA15-1 VTEC15-2 VTEA15-2 VTHA15-1 VTEA15-1 VTEA25-1 VTEA25-2 VTHA Linkage Distance Figura Análisis cluster serie T. Tercer subcluster Análisis de la varianza a) Influencia del grosor de la madera En primer lugar se observó que no existían diferencias significativas en la composición fenólica de las muestras procedentes del mismo sustrato, madera y distinto grosor. Ya se había comprobado que el grosor de la madera no tenía ninguna influencia en la eficacia de la acetificación, así pues a partir de este momento se consideran replicados de una misma muestra y así se han incluido en el estudio estadístico. 28

33 Resultados y Discusión b) Relación: Madera Compuestos fenólicos Para comprobar si existían diferencias significativas en la composición fenólica de las muestras en función de la madera se utilizaron pruebas paramétricas de análisis de la varianza (ANOVA). Se observó que la concentración de la mayoría de los compuestos, sobre todo de los ácidos fenólicos, presentaba diferencias significativas en relación al tipo de madera (Tabla 4.6). COMPUESTOS A C A S P level A R C S C R S R Ác. Gálico Ác. Protocatéquico Tirosol Ác. Vainíllico (+) Catequina Ác. Siríngico Galato de Etilo Ác. Caftárico Tabla 4.6. Análisis de la varianza (ANOVA) de las muestras de la serie F. Diferencias significativas (p valor < 0,05) entre las distintas maderas. COMPUESTOS A C A S P level A R C S C R S R Ác. Gálico Ác. Protocatéquico Tirosol Ác. Vainíllico (+) Catequina 0, , , , , ,08724 Ác. Siríngico Galato de Etilo Ác. Caftárico Tabla 4.7. Análisis de la varianza (ANOVA) de las muestras de la serie T. Diferencias significativas (p valor < 0,05) entre las distintas maderas. 29

34 Resultados y Discusión Se realizó un análisis discriminante al objeto de clasificar las muestras por tipo de madera. Sólo se incluyeron muestras en proceso de acetificación y vinagres acabados, es decir, que habían tenido contacto con la madera. La función se construyó con el método estándar y las variables anteriormente citadas (Tablas 4.6 y 4.7). La función de clasificación obtenida presenta los coeficientes recogidos en las Tablas 4.8 y 4.9, para las series F y T respectivamente. Con estas funciones las muestras se clasifican con un 98,6% de aciertos en la serie F y un 100% en la serie T (Tablas 4.10 y 4.11). La muestra mal clasificada de la serie F correspondía al punto I (2º acéticos). COMPUESTOS A C S R Ác. Gálico 84,28 78,88 78,12 85,99 Ác. Protocatéquico 8,97 14,08 14,41 10,41 Tirosol 22,72 19,90 20,04 19,75 Ác. Vainíllico 4,26 4,30 3,84 3,56 (+) Catequina 17,34 31,65 33,88 33,77 Ác. Siríngico 4,93 3,44 3,05 3,53 Galato de Etilo 17,55 16,81 16,63 17,49 Ác. Caftárico 2599, , , ,33 Constante 84,28 78,88 78,12 85,99 Tabla 4.8. Función de clasificación de las muestras de la serie F. COMPUESTOS A C S R Ác. Gálico 0,348 0,429 0,947 0,176 Ác. Protocatéquico 14,750 11,788 12,048 11,627 Tirosol 2,199 1,567 0,356 1,891 Ác. Vainíllico 17,243 21,269 9,462 21,608 (+) Catequina 5,655 3,828 8,468 15,482 Ác. siringico 17,311 24,960 37,110 24,532 Galato de Etilo 0,763 2,576 17,397 0,800 Ác. Cafeiltartárico 3,133 3,171 3,527 3,311 Constante 381, , , ,075 Tabla 4.9. Función de clasificación de las muestras de la serie T. 30

35 Resultados y Discusión MADERAS Porcentaje A C S R A 94, C 100, S 100, R 100, Total 98, Tabla Matriz de clasificación de las muestras de la serie F. MADERAS Porcentaje A C S R A 100, C 100, S 100, R 100, Total 100, Tabla Matriz de clasificación de las muestras de la serie T. Al representar las raíces de las funciones en el espacio (Figuras 4.11 y 4.12) existe cierto grado de agrupación en función del tipo de madera. Como se puede observar para la serie T (Figura 4.12), son las muestras elaboradas en castaño las que aparecen más separadas del resto, coincidiendo con los resultados obtenidos en el análisis cluster (Figura 4.6). Por el contrario las pertenecientes a maderas de acacia y cerezo son las más difíciles de diferenciar. Los coeficientes normalizados de las funciones discriminantes se muestran en las Tablas 4.12 y

36 Resultados y Discusión Raíz Raíz 1 A C S R Figura Coordenadas de las muestras de la serie F en el espacio discriminante Raíz Raíz 1 A C S R Figura Coordenadas de las muestras de la serie T en el espacio discriminante. 32

37 Resultados y Discusión COMPUESTOS Raíz 1 Raíz 2 Ác. gálico 0, , Ác. protocatéquico 0, , Tirosol 0, , Ác. vainíllico 0, , (+) Catequina 0, , Ác. siríngico 0, , Galato de etilo 0, , Ác. caftárico 0, , Autovalor 9, , Acumul. % 0, , Tabla Coeficientes normalizados de las variables canónicas de las muestras de la serie F. COMPUESTOS Raíz 1 Raíz 2 Ác. gálico 0, ,86989 Ác. protocatéquico 0, ,49817 Tirosol 0, ,00339 Ác. vainíllico 0, ,07275 (+) Catequina 0, ,86578 Ác. siríngico 1, ,74598 Galato de etilo 2, ,81353 Ác. caftárico 0, ,15985 Autovalor 45, ,75267 Acumul. % 0, ,94915 Tabla Coeficientes normalizados de las variables canónicas de las muestras de la serie T. c) Relación: Proceso de acetificación Compuestos fenólicos Los ácidos fenólicos tanto benzoicos como hidroxicinámicos no modifican su concentración a lo largo del proceso en concordancia con estudios previos de acetificación de vinos de Jerez en cultivo sumergido (Morales et al., 2001). 33

38 Resultados y Discusión Las concentraciones de (+) catequina y glucósido de resveratrol disminuyen significativamente a medida que avanza el proceso (Figuras 4.13 y 4.14). No se puede asegurar si la pérdida se produce por polimerización (Escribano Bailón et al., 1996, Saucier et al., 1997), precipitación o por oxidación (+)-Catequina O I H E PROCESO Figura Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Disminución de la concentración de (+) Catequina a medida que avanza el proceso de acetificación. 4,4 4,3 4,2 4,1 Glucósido de resveratrol 4,0 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 O I H E PROCESO Figura Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Disminución de la concentración del glucósido de resveratrol a medida que avanza el proceso de acetificación. 34

39 Resultados y Discusión El ácido gálico y el galato de etilo aumentan su concentración a lo largo del proceso de acetificación en las muestras producidas en madera de castaño para ambas series (Figuras 4.15 y 4.16). Esta tendencia sólo se observa para esta madera. Todas las muestras pertenecientes al punto O de las diferentes maderas parten de una concentración similar de ácido gálico (29 30 mg/l). Sin embargo, en las muestras de castaño se produce un aumento significativo a medida que avanza el proceso (serie F: 30 77,9 mg/l; serie T: ,7 mg/l), mientras que en el resto de las maderas permanecen prácticamente invariables. Esto coincide con los resultados presentados por Salatgoity Auguste et al. (1986). Ellos observaron que en medio ácido (ph 2) los extractos de taninos hidrolizables procedentes de la madera de castaño contenían mayor proporción de ácido gálico que aquellos que procedían de la madera de roble. El ácido gálico procede de la hidrólisis de los galotaninos de la madera. Por tanto, el aumento de este compuesto durante el proceso de acetificación se produce por la cesión de la madera en el medio ácido del vinagre. Como consecuencia de una alta concentración de ácido gálico y etanol en el medio se favorece la formación del galato de etilo Ácido galico O I H E PROCESO Figura Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Aumento del ácido gálico en las muestras acetificadas en madera de castaño durante el proceso de acetificación. 35

40 Resultados y Discusión Acido galico O I H E PROCESO Figura Análisis de la varianza (ANOVA) serie T. Aumento del ácido gálico en las muestras acetificadas en madera de castaño durante el proceso de acetificación. La madera contiene elagitaninos, galotaninos y lignina que se pueden extraer al medio de contacto. Estos compuestos tienen una cinética de extracción diferente. Los elagitaninos se extraen fácilmente de la madera (Peng et al., 1991) y simultáneamente van sufriendo un proceso de degradación a ácido elágico. La solubilización de los fragmentos de lignina requieren de rotura de enlaces covalentes y en comparación con el proceso anterior, éste es más lento (Haslam, 1998). Como consecuencia de la oxidación de estos fragmentos de lignina se forman vainillina y siringaldehído. En experiencias previas (Tesfaye at al., 2002b) se han detectado aldehído vainíllico (0,01 9,5 mg/l), siringaldehído (0,43 15,1) y coniferaldehído (0,41 26,8 mg/l), y ausencia de ácido elágico, en vinagres envejecidos en botas de roble. En este trabajo las barricas que se usaron eran reutilizadas, por lo que probablemente estaban ya en la segunda fase de extracción. Además, estas barricas tenían una relación superficie/volumen de 252 cm 2 /L y sufrieron pérdidas por evaporación, lo que supuso la concentración de estos compuestos y una mayor facilidad para su detección. Sin embargo, en nuestro trabajo las barricas eran nuevas y fabricadas exclusivamente para este proyecto, no habían sufrido aún ningún proceso de degradación. La relación superficie/volumen de las barricas era de 63 cm 2 /L, 4 veces menor que la del estudio anterior. Teniendo 36

41 Resultados y Discusión en cuenta todo esto y que el tiempo de contacto con la madera fue de tan sólo 1,5 meses en la mayoría de las muestras, la presencia de ácido elágico y la ausencia de aldehídos podrían explicar que nos encontramos en la primera fase de degradación de los compuestos de la madera, donde los compuestos que se extraen con mayor facilidad son los elagitaninos DETERMINACIÓN DE ANTOCIANOS TOTALES En las tablas 1 a 16 del Anexo se muestran las concentraciones, expresadas en mg/l de 3glucósido de malvidina (antociano mayoritario), de los antocianos monoméricos de las muestras analizadas. Los valores de antocianos totales determinados para los vinos de partida varían entre 1,20 mg/l en la serie F y 0,47 mg/l en la serie T. Estos datos contrastan con los obtenidos por otros autores, donde los valores de antocianos totales en vinos tinto estimados por el método de diferencia de ph, variaban entre 50 y 170 mg/l (Sánchez Moreno et al., 2003). Así pues podemos asumir que se tratan de vinos atípicos con una concentración de antocianos muy baja, probablemente debido a un alto grado de evolución y calentamiento. Tras aplicar el análisis estadístico de la varianza (ANOVA) se observaron, en ambas series, diferencias significativas en la concentración de antocianos monoméricos a lo largo del proceso de acetificación para cada una de las maderas (Tabla 4.14). Existe una disminución significativa de la concentración de antocianos monoméricos a medida que avanza el proceso de acetificación. En el caso de la serie F se produce una disminución media del 56% (Figura 4.17), y en la Serie T del 51,6% (Figura 4.18). Estos datos coinciden con los obtenidos por Andlauer et al. (2000) donde los antocianos disminuyen un 50% en vinagres de vino tinto obtenidos por cultivo sumergido. 37