MANUAL DE PRESTACIONES

Transcripción

1 ONCOINMUNOLOGICO LIMITADA LABORATORIO DE CONCEPCION MANUAL DE PRESTACIONES Versión 2.0

2 INTRODUCCION A continuación se detallan las diversas prestaciones efectuadas por el Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador de Concepción. En estas páginas se puede encontrar información específica sobre la técnica de citometría de flujo, cada prestación que efectúa el Laboratorio de Citometría de Flujo, en que consiste cada prestación y lo que el informe de la misma contempla, las condiciones de toma de las distintas muestras, su preservación y transporte, información científica, así como su codificación (Fonasa nivel 3). A fin de facilitar la solicitud de estas prestaciones, el Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador de Concepción dispone de formularios de solicitud de exámenes, los cuales incluyen detalladamente cada prestación así como sus respectivos códigos. Estos formularios están disponibles para descarga en nuestra página web Es pertinente destacar, que según ORD. 3H1E/N , De Dirección Regional Centro Sur de FONASA, del 15 de diciembre de 2003, estamos autorizados por esta entidad para operar en la modalidad de libre elección. T.M. MsC Juan Luis Castillo N. Director Técnico juanlcastillo@entelchile.net Fono: /

3 FUNDAMENTOS TEORICOS 1. Qué es la citometría de flujo? En palabras simples, es una tecnología que permite medir características físicas y químicas de células en suspensión. Es así como entrega información sobre el tamaño celular, la granularidad o complejidad interna, así como también de la intensidad de fluorescencia relativa que posean las células en estudio. 2. Como son evaluadas estas características celulares? El principio básico de la citometría de flujo, es la interacción de una fuente de luz, específicamente un rayo láser, con células en suspensión, las cuales son canalizadas e interrogadas individualmente por el rayo láser, recogiéndose la información obtenida de dicha interacción. Existen equipos que cuentan con uno, dos o más rayos lásers, dependiendo del modelo, siendo lo usual, la presencia de un rayo láser que emita a 488 nm (láser de argón) (Figura 1). 3

4 Figura 1: Desviación de la luz láser y producción de señal de fluorescencia en la cámara de lectura de un citómetro de flujo. La interacción de una célula con la luz del láser (ligth scatering), puede producir la desviación de ésta última, en un ángulo menor a 10 grados, lo que se conoce como dispersión frontal o FSC (forward scatter) y su vez la desviación de la luz del láser en más de 10 grados, pero en menos de 90 se conoce como dispersión lateral o SSC (side scatter). Es así como FSC y SSC son parámetros intrínsecos a la célula. Ahora, si a la suspensión celular se agrega un fluorocromo que tenga afinidad por algún componente celular y que además este fluorocromo sea excitable con el rayo láser en uso (longitud de onda), se podrá detectar un cambio en la longitud de onda de emisión del fluorocromo, lo anterior se traducirá en formación de rangos o canales de fluorescencia, la cual es posteriormente detectada. Por ejemplo, la fluoresceína, fluorocromo ampliamente usado tanto en microscopía de fluorescencia como en citometría de flujo, es excitable en el rango de 494 4

5 nm, siendo su espectro de emisión de 518 nm. En los citómetros de flujo actuales, con aplicación en clínica, es posible detectar simultáneamente desde 1 hasta 15 rangos o canales de fluorescencia, lógicamente usando fluorocromos que emitan en diferente longitud de onda (Figura 2). Figura 2: Esquema del sistema óptico de un citómetro de flujo. (Clin. Microbiol. Rev. 2000; 13: Uso de Anticuerpos Si además consideramos la posibilidad de que ciertos fluorocromos se pueden conjugar con proteínas, es decir unir a proteínas, es posible disponer anticuerpos 5

6 conjugados con diversos fluorocromos. Si a esto se le suma el explosivo desarrollo de la producción y comercialización de anticuerpos monoclonales, conjugados con diversos fluorocromos, las potencialidades son ilimitadas. Es así como hoy se dispone de anticuerpos contra una infinidad de moléculas biológicas, lo que se ha traducido en un gran desarrollo de los estudios de caracterización inmunofenotípica de diversos tipos celulares, muchos de ellos con una aplicación clínica concreta. 4. Presentación de datos y análisis Un citómetro de flujo, a pesar de tener un sistema de fluidos, un sistema óptico y un sistema electrónico, es un equipo controlado informáticamente, existiendo para ello, diversas plataformas (pc y macintosh principalmente), las cuales, mediante los programas adecuados permiten tanto la adquisición como análisis de los datos obtenidos. La acción de evaluar una suspensión de células, en un citómetro de flujo, se llama adquisión (se adquiere la información de un determinado número de células en un tiempo determinado). Una vez adquirida la información sobre una suspensión celular, esta se almacena como una fila o archivo, y éste es posible visualizarlo de diversas formas, dependiendo del programa de análisis que se use. Es así como los datos se pueden visualizar como gráficos de puntos, contorno, densidad, histogramas, tridimensional, etc., obteniéndose, en cada caso información numérica como por ejemplo coeficiente de variación, media de intensidad de fluorescencia, mediana, media geométrica, etc. (Figura 3). 6

7 Figura 3: Distintas formas de presentar los mismos datos: SSC (granularidad) y CD45 (antígeno leucocitario común). (A) Gráfico de puntos; (B) gráfico de densidad; (C) gráfico tridimensional; (D) gráfico de contorno; (E) histograma que representa sólo SSC. (Adaptado con autorización de: Hematología: Fisiopatología y Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J. Editorial Universidad de Talca). Un concepto fundamental al efectuar un análisis es la correcta selección de la región de interés a estudiar, lo que se conoce como gate o ventana de análisis. Por ejemplo, si se han analizado leucocitos, se tiene información de las diversas poblaciones leucocitarias presentes, pero es posible acotar aún más el análisis, al seleccionar, por ejemplo, la población de linfocitos, para lo cual se dibuja una ventana de análisis o gate. Posteriormente, se puede obtener información específica sólo de la región de linfocitos, 7

8 como es la expresión o ausencia de diversas moléculas y presencia de células normales y anormales (Figura 4). Es posible combinar una infinidad de regiones al momento de hacer un análisis, lo que se traduce en una gran capacidad y versatilidad en el manejo de la información. Figura 4: Concepto de gate o ventana de análisis en una muestra patológica de medula ósea. En (A) se identifican dos poblaciones celulares, correspondiendo la región 1 (R1) a blastos. R1 se representa en gráficos (C),(D) y (E). En gráfico (C), en cuadrante superior derecho, se puede observar la coexpresión de CD19 (linfocitos B) con CD10 (linfoide inmaduro). En (D) se destaca la expresión de CD34 (células progenitoras). En (E) destaca la expresión de TdT (linfoide inmaduro) con ausencia de mieloperoxidasa. Diagnóstico: Leucemia linfoblástica aguda de línea B. (Adaptado con autorización de: Hematología: Fisiopatología y Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J. Editorial Universidad de Talca). 8

9 En la Tabla 1 se describen algunas aplicaciones clínicas de la citometría de flujo. La utilización de estas prestaciones puede variar según el criterio de cada clínico, la protocolización de cada centro clínico y la orientación de este, así como de la factibilidad de acceder al servicio. Tabla 1: Aplicaciones clínicas de la citometría de flujo. Inmunofenotipificación Cáncer Transplantes Estudios funcionales Plaquetas Leucemias y linfomas Detección de enfermedad mínima residual. Subpoblaciones linfoides CD3, CD4, CD8, CD19 y NK (inmunodeficiencias primarias y secundarias) Razón linfocitos TCD4/CD8 (infección VIH- SIDA) Poblaciones linfoides T y B (clonalidad en mucosas y ganglios, linfomas) Macrófagos (enfermedad inflamatoria) Contenido de ADN (Ploidía de ADN) Fases del ciclo celular Proteínas del ciclo celular (ciclinas, kinasas, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, ki-67, etc.) Células progenitoras (CD34, CD117) Cross match Citocinas intracelulares Fagocitosis Estallido respiratorio ph intracelular Calcio intracelular Potencial de membrana Glicoproteínas (tromboastenia de Glanzmann) Fisiología plaquetaria Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas 9

10 Estudios de resistencia a drogas Fenotipo MDR: glicoproteína p, bombas de eflujo. Cuantificación de moléculas Conteo absoluto de células CD38 en linfocitos TCD8 (infección VIH- SIDA) CD64 en granulocitos (infección) Inmunoglobulinas asociadas a plaquetas (púrpuras) Detección de citocinas solubles En base a partículas cubiertas con anticuerpos anti citocinas. 10

11 LABORATORIO DE CITOMETRÍA DE FLUJO Y SUS PRESTACIONES El Laboratorio de Citometría de flujo del Hospital del Trabajador Concepción, a fin de facilitar la solicitud de las diversas prestaciones por parte de los servicios clínicos, tiene establecidos diferentes formatos de solicitud de exámenes, cada uno con el detalle correspondiente, así como su codificación según Fonasa. Estos formatos se pueden descargar de la pagina web A continuación se detallan los formularios de solicitud de examen, información científica, así como cada prestación con sus condiciones de toma de muestra, transporte, información del paciente y su cuadro clínico, etc. 11

12 CENTRO DE DIAGNOSTICO ONCO - INMUNOLOGICO LIMITADA RUT: LABORATORIO DE CARDENIO AVELLO Nº 36 CONCEPCION TELEFONO (41) E- MAIL: labcitometria@entelchile.net Previsión: NOMBRE DEL PACIENTE: DIAGNOSTICO: TIPO DE MUESTRA: MEDICO SOLICITANTE: FICHA CLINICA: RUT: EDAD: FECHA DE SOLICITUD FECHA TOMA DE MUESTRA INMUNOLOGIA: SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS (FONASA NIVEL 3) PANEL 1 Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Células NK-T (CD3/CD16+CD56) PANEL Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) PANEL Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) PANEL 4 Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) A 7-B PANEL 5 Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Células NK-T (CD3/CD16+CD56) x PANEL 6 Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) ONCOHEMATOLOGIA (FONASA NIVEL 3) 8 Otros: Estallido respiratorio en granulocitos y monocitos x x 2 Expresión de HLA-DR en Monocitos de sangre periférica Inmunofenotipo de leucemias y linfomas en medula ósea, sangre periférica u otros (incluye linaje linfoide T y B, mieloide e inmadurez) Porcentaje de blastos: Recuento leucocitario : x Nº Total de exámenes solicitados: FIRMA MEDICO 12

13 INMUNOLOGIA : SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS Característica : Recepción programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra Transporte Entrega de resultados Resultados : 3 ml Sangre periférica, idealmente en ayunas, usando EDTA como anticoagulante (tubo lila). En lactantes basta con 1 ml. : Inmediato a 24 horas, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. : 4 a 6 horas en forma telefónica (de ser necesario) y en conversación con médico responsable. 6 a 24 horas, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente. : Incluye: Recuento de leucocitos totales Recuento de linfocitos absolutos Porcentaje de subpoblación linfoide solicitada Valor absoluto de subpoblación linfoide solicitada. Comentario clínico Paneles disponibles : Panel 1: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Células NK-T (CD3/CD16+CD56) Códigos Fonasa Nivel x

14 Panel 2: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Panel 3: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Panel 4: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Panel 5: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Células NK (CD16+CD56) Células NK-T (CD3/CD16+CD56) Panel 6: Linfocitos T totales (CD3/HLA-DR) Linfocitos T Helper (CD3/CD4/HLA-DR) Linfocitos T Cito.-sup. (CD3/CD8/HLA-DR) Códigos Fonasa Nivel x Otros (Deben estar anexados a uno de lo paneles anteriores. No son aplicables en forma aislada) CD CD

15 Linfocitos 20 a 30% de los leucocitos circulantes Se originan en médula ósea Se encuentran Sangre Linfa Ganglio linfático Timo Médula ósea Subpoblaciones Linfocitarias y sus funciones Linfocitos Linfocitos T Linfocitos B Células NK Células NK-T Producción de Anticuerpos Citoxicidad Directa. Destrucción de células tumorales y células infectadas por microorganismos Lisis de células Tumorales y células infectadas por virus. Regulación inmune Linfocitos T CD4 Helper Colaboran y Dirigen la Respuesta Inmune Linfocitos TCD8 Citotóxicos Supresores Citotoxicidad celular. Suprimen la respuesta inmune 15

16 Subpoblaciones Linfocitarias y sus Marcadores de Superficie Linfocitos Linfocitos T Linfocitos B Células NK Células NK-T CD3(+) CD3(-)/CD19(+) CD3(-)/CD16(+)/CD56(+) CD3(+)/CD16(-)/CD56(+) Linfocitos T CD4 Helper CD3(+)/CD4(+)/CD8(-) Linfocitos TCD8 Citotóxicos Supresores CD3(+)/CD4(-)/CD8(+) HLA-DR Indicador de activación celular Expresado en: Linfocitos T activados Células NK activadas Células NK-T activadas células presentadoras de antígeno: Linfocitos B Monocitos y Macrófagos 16

17 Ejemplo de alteraciones del recuento de Subpoblaciones Linfocitarias Situación LT Totales LTCD4 LTCD8 LB NK NK-T LT HLA-DR(+) Inicio de respuesta inmune celular (ej.: infección) Establecimiento de respuesta inmune celular Supresión y control de la respuesta inmune celular N N N Inmunodepresión celular (infección VIH) N N N Inmunodepresión celular severa (SIDA) N Infección viral (herpes) N N Terapia Inmunosupresora : Aumentado : Disminuido N : Normal 17

18 INMUNOLOGIA (7-A) : ESTALLIDO RESPIRATORIO EN GRANULOCITOS Y MONOCITOS. Característica : Recepción programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra : 3 ml de sangre periférica, idealmente en ayunas, usando HEPARINA DE SODIO como anticoagulante (tubo VERDE). De ser necesario se proporcionará el tubo. Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 4 horas). Entrega de resultados : 4 a 6 horas en forma telefónica (de ser necesario) y en conversación con médico responsable. 6 a 24 horas, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente. Resultados : Incluye: Porcentaje de Granulocitos no estimulados. Porcentaje de Granulocitos estimulados. Porcentaje de Monocitos no estimulados. Porcentaje de Monocitos estimulados. Comentario clínico. Códigos Fonasa Nivel 3 Estallido respiratorio en granulocitos y monocitos x x 2 18

19 Granulocitos 50 a 75% de los leucocitos circulantes Función de fagocitosis y destrucción de microorganismos. Quimiotaxis Transmigración leucocitaria Poseen mecanismos microbicidas Monocitos 4-8% de los leucocitos circulantes Comparten características con Neutrófilos Realizan fagocitosis Son presentadores de antígenos 19

20 Estallido Respiratorio En la destrucción de microorganismos fagocitados se libera peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) La prueba de estallido respiratorio mide la producción de H 2 O 2 Permite determinar: El grado de activación celular La respuesta a la estimulación. Situación Normal Ejemplo de alteraciones del Estallido Respiratorio Granulocitos B E N N B-E >50 Monocitos B E N N B-E >50 E.G.C. <20 <20 Sepsis <20 <20 Infección Bacteriana leve a moderada N >25 <50 N >25 <50 Infección viral / Herpes / Aftas bucales / Estrés N >25 <50 N >25 <50 TTO antioxidantes / vitaminas / Zn / Se N N >40 <50 N N >40 <50 : Aumentado : Disminuido N : Normal B : Basal E : Estimulado B-E: Diferencia 20

21 INMUNOLOGIA (7-B) : HLA-DR EN MONOCITOS Característica : Recepción programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra : 3 ml Sangre periférica, idealmente en ayunas, usando EDTA como anticoagulante (tubo lila). En lactantes basta con 1 ml. Rotular la hora de la toma de muestra. Inmediatamente poner a 4ºC (refrigerador) Transporte : Inmediato, a 4ºC, protegido de la luz. No exponer a temperaturas ambiente. (Duración de la muestra 24 horas). Entrega de resultados : 4 a 6 horas en forma telefónica (de ser necesario) y en conversación con médico responsable. 6 a 24 horas, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente. Resultados : Incluye: Porcentaje de Monocitos. Porcentaje de expresión de HLA-DR en monocitos. Comentario clínico. Códigos Fonasa Nivel 3 HLA-DR en monocitos

22 Procesamiento y Presentación de Antígenos Ag Molécula MHC ( HLA-DR) Procesamiento Ag CPA Presentación Ag Procesamiento y Presentación de Antígenos Ag Molécula MHC (HLA-DR) Procesamiento Ag CPA (monocito) Presentación Ag Linfocito T Respuesta Inmune TCR/CD3 22

23 Expresión de HLA-DR en Monocitos Predicting organ failure in patients with acute pancreatitis (Values in parentheses are 95% CI) Cut-off point Sensitivity (%) Specificity (%) HLA-DR(+) monocytes 78 % 83 (64 94) 72 (67-77) APACHE II score 7 % 76 (56 90) 74 (68 79) The Biochemical Society: Clinical Science 2003; 105: HLA-DR (% Expression) Survivors Non survivors Changes in HLA-DR expression on monocytes in patients with septic shock after admittance to the intensive care unit. Clinical Chemistry 2002; 48: days 5 days Expresión de HLA-DR en Monocitos Rango (%) Menor a 24 Interpretación niños y adultos(**) Normal Inmunodepresión leve. Cuadro infeccioso leve. Inmunodepresión. Presencia de cuadro infeccioso moderado a severo. Inmunodepresión severa. Presencia de inflamación sistémica, sepsis. Inmunodepresión severa, sepsis, compromiso vital de alto riesgo. 23

24 ONCOHEMATOLOGIA : INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS Y LINFOMAS Característica : Recepción programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra : 3 ml de sangre periférica, usando EDTA como anticoagulante (tubo lila). Al menos 1 ml de medula ósea, usando EDTA como anticoagulante (tubo lila). 3 ml de líquido cefalorraquídeo, en un frasco estéril. Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 24 horas). Entrega de resultados : 8 a 24 horas en forma telefónica y en conversación con médico responsable. 24 a 48 horas, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente. Resultados : Incluye: Porcentaje de poblaciones celulares identificadas, incluyendo blastos y células normales. Porcentaje de expresión de marcadores celulares en población celular analizada: Línea Linfoide B (CD19, CD20, kappa, lambda). Línea Linfoide T (CD3m, CD3c, CD4, CD7, CD8). NK. Linfoide inmaduro (TdT y CD10) Células progenitoras (CD34) Activación celular (HLA-DR) Línea mieloide (CD13, CD14, 24

25 CD33, mieloperoxidasa) Línea megacarocítica (CD41, CD61) Evaluación morfológica general. Comentario técnico. Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). Disponibilidad telefónica de profesional que efectúa examen (fono ). Códigos Fonasa Nivel 3 Inmunofenotipo de leucemias y linfomas (sangre periférica, medula ósea u otros) Puede incluir: CD3, CD3 membrana, CD3 citoplasma, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD14, CD16,CD19, CD20, CD33, CD34, CD41,,CD56, CD61, HLA-DR, TdT, Mieloperoxidasa, Zeta-CD3, kappa, lambda, etc x

26 Inmunofenotipificación de Leucemias Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica Hematopoiesis PLURIPOTENT STEM CELL MIXED PROGENITOR CELL COMMITTED PROGENITOR CELL RECOGNIZABLE BONE MARROW PRECURSOR CELL MATURE BLOOD CELL BFU-E/CFU-E pronormoblast red cell CFU-GM myeloblast monoblast neutrophil monocyte CFU-Eos eosinophil myeloid progenitor cell CFU-Baso CFU-Meg megakaryocyte basophil platelet pluripotent stem cell pre-t lymphoblast T-cell lymphoid progenitor cell pre-b lymphoblast B-cell & plasma cell 26

27 Hematopoiesis PLURIPOTENT STEM CELL MIXED PROGENITOR CELL COMMITTED PROGENITOR CELL RECOGNIZABLE BONE MARROW PRECURSOR CELL MATURE BLOOD CELL BFU-E/CFU-E CFU-GM pronormoblast myeloblast monoblast red cell neutrophil monocyte CFU-Eos eosinophil pluripotent stem cell myeloid progenitor cell CFU-Baso CFU-Meg pre-t megakaryocyte lymphoblast basophil platelet T-cell lymphoid progenitor cell pre-b lymphoblast B-cell & plasma cell Retención de Antígenos Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados CD19 CD19 Transformación Maligna CELULA PRE-B NORMAL CELULA LEUCEMICA 27

28 Inmunofenotipificación de Leucemias Aplicaciones : Subtipificar inmunológicamente leucemias agudas. Evaluación de linfocitosis de etiología no determinada. Identificar desordenes linfoproliferativos crónicos de células T y B. Diferenciar entre leucemia linfoblástica y leucemia mieloide. Cytometry (CCC)34:39-42 (1998) Clasificación inmunofenotípica (LA) LLA-B : LLA-T : LMA : -BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19. -BII Común : CD10. -BIII Pre B: clg. -BIV Madura : slg -TI-proT: CD7 -TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8 -TIII-Cortical: CD1a -IIV-Madura: CD1a y CD3mb -LMA-M6 : glicoforina A -LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b -LMA-M3 : HLA-DR(-) -LMA-M4 : HLA-DR(+) 28

29 CENTRO DE DIAGNOSTICO ONCO - INMUNOLOGICO LIMITADA RUT: LABORATORIO DE CARDENIO AVELLO Nº 36 CONCEPCION TELEFONO (41) E- MAIL: labcitometria@entelchile.net SOLICITUD DE EXAMENES DE RC 62SSGT.2 Previsión: NOMBRE: PROCEDENCIA: DIAGNOSTICO: FECHA DE SOLICITUD: EDAD: FICHA CLINICA RUT FECHA TOMA DE MUESTRA: GASTROENTEROLOGIA Y ONCOINMUNOPATOLOGIA (FONASA NIVEL 3) Poblaciones línfoides en mucosas (observación Linfoma), incluye: Leucocitos (CD45), Linfocitos T (CD3/HLA-DR), Linfocitos B (CD19/HLA-DR), kappa/lambda x 2 Macrófagos Intestinales en Enfermedad Inflamatoria Intestinal (incluye CD33, CD16 y HLA-DR) Macrófagos Intestinales en Enfermedad Inflamatoria Intestinal (incluye CD33, CD16 y HLA-DR), Ciclo celular, plodía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Fase GOG1, Fase G2M, Fase S, Fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA) Ciclo celular, plodía de ADN en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Fase GOG1, Fase G2M, Fase S, Fracción proliferativa, índice de ADN) x Ciclo celular, plodía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Fase GOG1, Fase G2M, Fase S, Fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA) x 7 MUESTRA N 1: MUESTRA N 2: MUESTRA N 3: MEDICO : RUT: FIRMA 29

30 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Poblaciones linfoides en mucosas en tejido fresco (observación linfoma) Característica : Recepción NO programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. (Necesidad surge durante procedimiento endoscópico) Toma de muestra : Biopsia endoscópica (2x2x2 mm) de zona representativa de lesión, idealmente biopsia en biopsia. Introducir en suero Fisiológico estéril Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 3 horas). Entrega de resultados : 3 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Porcentaje de poblaciones celulares linfoides identificadas. Porcentaje de expresión de marcadores celulares en población celular analizada: Leucocitos (CD45). Línea Linfoide B (CD19, kappa, lambda). Línea Linfoide T (CD3m,). Activación celular (HLA-DR) Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). 30

31 Códigos Fonasa Nivel 3 Poblaciones linfoides en mucosas en tejido fresco (observación linfoma): Leucocitos (CD45) Linfocitos T (CD3/HLA-DR) Linfocitos B (CD19/HLA-DR) Kappa/lambda x

32 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Macrófagos intestinales en Enfermedad inflamatoria intestinal en tejido fresco (incluye CD33, CD16 y HLA-DR) Característica : Recepción NO programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. (Necesidad surge durante procedimiento endoscópico) Toma de muestra : Biopsia endoscópica (2x2x2 mm) de zona representativa de lesión. Introducir en suero Fisiológico estéril Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 3 horas). Entrega de resultados : 3 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Porcentaje de Macrófagos intestinales identificados. Porcentaje de expresión de marcadores celulares en población celular analizada: Activación celular (HLA-DR) Actividad (CD16) Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). Códigos Fonasa Nivel 3 Macrófagos intestinales en Enfermedad inflamatoria intestinal en tejido fresco (incluye CD33, CD16 y HLA- DR)

33 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Espectro de presentación. Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal Inflamación persistente y/o recurrente Congestión ulcerativa Granulomatosa Cáncer ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Estudios celulares de mucosa intestinal: Células epiteliales Macrófagos Linfocitos: TCD4 Presentadoras de antígenos. Moduladores Perpetuación Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation FALK Symposium 104, Amsterdam,

34 Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales) Mucosa HLA-DR CD16 CD54 CD25 CD68 CD80, CD86 CD11b Normal 20-30% Ausente 7% Ausente Ausente Ausente 5% EII Presente Presente C.U. 70% Crohn 46% C.U. Presente Crohn ausente Presente Presente Presente Mahida YR et al. Gut.1989;30: Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.: Ejemplo de alteraciones del Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales Situación HLA-DR CD16 Normalidad < 30 % < 5 % Inflamación Aguda < 30 % > 5 % Inflamación crónica con escasa actividad Inflamación crónica activa > 30 % > 30 % < 5 % > 5 % 34

35 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Macrófagos intestinales en Enfermedad inflamatoria intestinal (incluye CD33, CD16 y HLA-DR), Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA) Característica : Recepción NO programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. (Necesidad surge durante procedimiento endoscópico) Toma de muestra : Biopsia endoscópica (2x2x2 mm) de zona representativa de lesión. Introducir en suero Fisiológico estéril Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 3 horas). Entrega de resultados : 3 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Porcentaje de Macrófagos intestinales identificados. Porcentaje de expresión de marcadores celulares en población celular analizada: Activación celular (HLA-DR) Actividad (CD16) Índice de ADN. Ciclo celular: Fase G0G1. Fase G2M. Fase S. Fracción proliferativa. 35

36 p53. PCNA. Comentario técnico Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). Códigos Fonasa Nivel 3 Macrófagos intestinales en Enfermedad inflamatoria intestinal (incluye CD33, CD16 y HLA-DR), Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA)

37 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA) Característica : Recepción NO programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. (Necesidad surge durante procedimiento endoscópico) Toma de muestra : Biopsia endoscópica (2x2x2 mm) de zona representativa de lesión. Introducir en suero Fisiológico estéril Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 3 horas). Entrega de resultados : 3 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Índice de ADN. Ciclo celular: Fase G0G1. Fase G2M. Fase S. Fracción proliferativa. p53. PCNA. Comentario técnico Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). 37

38 Códigos Fonasa Nivel 3 Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA) x

39 Células cancerosas difieren de las normales 1. Pérdida de funciones diferenciadas. 2. Expresión de neo antígenos no típicos del estado diferenciado. 3. Capacidad de invadir tejidos no nativos. 4. Metabolismo diferente. 5. Inestabilidad genética elevada. 6. Morfología anormal. 7. Progresión hacia malignidad. Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica. Se obtiene una estimación de las fases del ciclo celular. Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt). Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov

40 Ciclo Celular Ciclo de vida promedio de una célula (24hrs.) Mitosis M 1 hr G2(4n) 4 hr Post Síntesis DNA G0 (2n) Síntesis ADN 10 hrs Fase S 9 hr G1 (2n) Pre-síntesis ADN Cantidad de ADN v/s Tiempo CONTENIDO ADN 4n 2n G1 S G2 M G1 FASES CICLO CELULAR 40

41 Histograma de ADN teórico NUMERO DE CELULAS FASES G0G1 FASE S FASES G2+M 2n 4n CONTENIDO DE ADN Histograma de ADN Observado NUMERO DE CELULAS FASES G0G1 FASE S FASES G2+M 2n 4n CONTENIDO DE ADN 41

42 Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN. Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control. ID = Contenido ADN Células G0G1 Muestra Contenido ADN Células G0G1 Control Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN. PLOIDIA INDICE ADN ADN Diploide ADN Aneuploide ADN Hiperdiploide ADN Hipodiploide = 1 = 1 > 1 < 1 Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov

43 Estudio de Polidía de ADN y Ciclo Celular Aplicaciones: Estudio del comportamiento biológico de poblaciones celulares dentro de un tumor. Determinación de Fracción proliferativa (Fases S + G2M) de una población celular. Determinación de triploidía en lesiones prenoeplásicas. Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de cáncer. Estudios de viabilidad. Apoptosis. Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov Muestras Usadas para Análisis de Ploidía de ADN y Ciclo Celular por Citometría de Flujo I II III Suspensiones Celulares: Líneas Celulares. Sangre Periférica Médula Osea Fluidos con alta celularidad (Liq. ascítico, peritoneal, etc.) Tumores Sólidos: Tejido sólido Aspirado Celular Tejidos Embebidos en Parafina 43

44 Teoría de la aneuplodía Hipodiploidía Indice de ADN Límite para viabilidad Hiperdiploidía Indice de ADN mayor a = triplodía 2.0 = tetraploidía Cytometry 22: (1995) Biochem J. 340: (1999) Teoría de la aneuplodía La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometría de flujo. Normal Tetraploide Aneuploide Número de células Diploide < 6% > 6% 2N 4N 2N 4N 2N DNA/Célula 44

45 ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS ANEUPLOIDIA Grado de malignidad Pronóstico Invasión Metástasis Evolución natural Respuesta a tratamiento PROLIFERACION CELULAR Tiempo libre de enfermedad. Sobrevida. Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov Fases del Ciclo Celular en epitelios (tejido fresco) Parámetro Rango Referencia (*) Fase G0G1 Fase G2M Fase S (**) Fase S + Fase G2M Índice de ADN % % % % (*) Análisis modelando fase S con modelo trapezoidal y tres compartimentos. 45

46 Ejemplo de alteraciones de plodía y ciclo celular Mujer, 64 años. Pólipo colon Yamada II a 25 cm. Biopsia: Adenoma con atipía moderada a severa. 46

47 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Ciclo celular, ploidía de ADN en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN) Característica : Recepción NO programable entre servicio clínico y Laboratorio de Citometría de flujo. (Necesidad surge durante procedimiento endoscópico) Toma de muestra : Biopsia endoscópica (2x2x2 mm) de zona representativa de lesión. Introducir en suero Fisiológico estéril Transporte : Inmediato, a temperatura ambiente, protegido de la luz. No exponer a temperaturas elevadas. (Duración de la muestra 3 horas). Entrega de resultados : 3 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Indice de ADN. Ciclo celular: Fase G0G1. Fase G2M. Fase S. Fracción proliferativa. Comentario técnico Conclusión clínica. Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). 47

48 Códigos Fonasa Nivel 3 Ciclo celular, ploidía de ADN en lesiones neoplásicas y preneoplásicas en tejido fresco (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN) x 5 48

49 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA). Tejido en parafina 2 muestras. Característica : Recepción programable entre servicio clínico, unidad de anatomía patológica y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra : 4 a 5 Cortes de tejido en parafina de un grosor de 50 micrones, de zona representativa del tumor. Transporte : A temperatura ambiente. No exponer a temperaturas elevadas. Entrega de resultados : 5 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Índice de ADN. Ciclo celular: Fase G0G1. Fase G2M. Fase S. Fracción proliferativa. p53 PCNA Comentario técnico Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). 49

50 Códigos Fonasa Nivel 3 Ciclo celular, ploidía de ADN y oncogenes en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN, p53 y PCNA). Tejido en parafina 2 muestras x x 2 50

51 GASTROENTEROLOGIA ONCOINMUNOPATOLOGIA Y : Ciclo celular, ploidía de ADN en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN). Tejido en parafina 2 muestras. Característica : Recepción programable entre servicio clínico, unidad de anatomía patológica y Laboratorio de Citometría de flujo. Toma de muestra : 4 a 5 Cortes de tejido en parafina de un grosor de 50 micrones, de zona representativa del tumor. Transporte : A temperatura ambiente. No exponer a temperaturas elevadas. Entrega de resultados : 5 días, mediante fax, correo electrónico o entrega personal en servicio correspondiente o al paciente. Resultados : Incluye: Indice de ADN. Ciclo celular: Fase G0G1. Fase G2M. Fase S. Fracción proliferativa. Comentario técnico Visita y conversación personal con médico tratante (de ser necesario). 51

52 Códigos Fonasa Nivel 3 Ciclo celular, ploidía de ADN en lesiones neoplásicas y preneoplásicas (incluye: Identificación celular, Fase G0G1, fase G2M, Fase S, fracción proliferativa, índice de ADN). Tejido en parafina 2 muestras x 10 52