BIOMEJORAMIENTO DE LOS SUSTRATOS RADICULARES LABORATORIO DE INTERACCIONES MICROBIANAS PUCV

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1 BIOMEJORAMIENTO DE LOS SUSTRATOS RADICULARES LABORATORIO DE INTERACCIONES MICROBIANAS PUCV

2 Laboratorio de Interacciones Microbianas HIPOTESIS DE LA LINEA Los nemátodos bacterívoros pueden ser cultivados masivamente in vitro e incorporados al sustrato para potenciar la calidad del suelo. Se plantea que los nematodos son reservorios nativos, resistentes y autorrenovables que dispersan poblaciones microbianas naturales de importancia en los ciclos biogeoquímicos.

3 Atracción Ingestión TMP2/3 Reproducción Nemátodo Dispersión Aumento del NH 4+ en el suelo MUESTREO DE SUSTRATOS RADICULARES TRANQUE DE RELAVE

4 Acacia saligna Acacia melanoxylon Punica granatus Atriplex sp. RECUPERACION DE NEMATODOS

5 MUESTREO NEMATOLOGICO Area de Estudio Sector Experimental Muestra Nemátodos Relleno Sanitario Loma Los Colorados Parcela A Parcela B arbusto maleza arbusto maleza Parcela C arbusto maleza Tranque de Relave Planta Matta Tranque 1 (Sector Lamas) Sector Aledaño (Pie de talud) Prosopis chilensis Punica granatus Acacia saligna Acacia cavens Atriplex sp Tranque 2 arbusto - Tranque 3 arbusto - Tranque Ojancos Sector Lamas Shinus molle Acacia saligna Acacia sp DESARROLLO IN VITRO DE NEMATOFAUNA NATIVA COLONIZADORA EN BASE A POBLACIONES BACTERIANAS NATURALES ASOCIADAS

6 OBJETIVO GENERAL Seleccionar y reproducir in vitro nemátodos bacterívoros colonizadores usando bacterias naturales asociadas como fuente de alimento. Hembra con huevos en el centro de una colonia bacteriana Huella del desplazamiento de nemátodos en placa Reproducción n de nemátodos en una colonia bacteriana

7 FAMILIA RHABDITIDAE Extremo anterior del cuerpo de un rabdítido Extremo posterior del cuerpo de un rabdítido FAMILIA CEPHALOBIDAE Extremo anterior del cuerpo de un cefalóbido Extremo posterior del cuerpo de un cefalóbido Ejemplar de la familia Cephalobidae

8 CULTIVOS MONOXÉNICOS Cultivo puro de un nemátodo colonizador y su bacteria asociada Cultivo puro de un nemátodo colonizador y su bacteria asociada BACTERIAS NATURALES ASOCIADAS Bacilos Gram negativo Móviles Oxidasa positivo Metabolismo de la glucosa oxidativo Aislamiento de una bacteria natural asociada

9 ESTUDIO DE RELACIONES TRÓFICO- DISPERSIVAS ENTRE BACTERIAS Y NEMÁTODOS. OBJETIVO GENERAL Desarrollar un modelo in vitro para el estudio de la atracción, ingestión y dispersión de bacterias dieta por parte de nematodos.

10 POTENCIAL DE ATRACCION Sembrar en sector t3 la bacteria crecida en agua peptonada e incubar 24 hrs a 25ºC. Contabilizar número de nemátodos inoculados. mm= ((1*t1+2*t2+3*t3) (1*c1+2*c2+3*c3)/T)*10 Distancia (mm) recorrida por C. elagans KMP-3 KMP-4/2 TMP-2/3 TMP-2/1 KMP-8 TMP-1/2 EC OP50 KMP-1 KMP-5 TMV-3 SL Minutos

11 CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN NIVEL DE ATRACCIÓN Nivel de atracción Hiper atractante Bacterias TMP2/1; TMP2/3 Atractante media E.coliOP50; SL-1344;KMP-3 Atractante baja KMP-5; KMP-8; KMP4/2; KMP-1; TMV-3. ACTIVIDAD EN TORNO A LA BACTERIA Agar NG

12 Area cm2 AREA DE ACTIVIDAD TMP2/3 KMP4/2 KMP-1 OP50 Cepas Bacterianas Para determinar que efectivamente el nemátodo se encontraba libre de bacterias en su cutícula se lavó nemátodos alimentados con E.coli MT102, de la misma forma que nemátodos alimentados con TMP2/3 Los resultados demuestran que la bacteria se encuentra solamente en el interior del intestino del nematodo 1 2

13 Se recuperó la bacteria TMP2/3 en placas de agar NG 1 También crecieron en placas de agar L con antibióticos Esto sugiere que el lavado externo fue exitoso y efectivamente el nemátodo dispersa la bacteria por sus excretas. 2 3 Evaluación de la asociación bacteria nemátodo, en el aumento de NH+4 en la zona radicular y en el aumento del peso total de las plantas de Lycopersicon esculentum. Planta: Lycopersicum esculentum. Fotoperiódo do: : 15 h día-d 9 h noche. Tº: ºC. Suelo: : Franco arcilloso, estéril. Humedad: : 35% p/v. Nemátodos todos: Cephalobidae /Rhabditidae. Tiempo de ensayo: : 35 días. d Réplicas: 35 por tratamiento. Semilla estéril pre-germinada. Nemátodos nativos (10 nem/gr). Inóculo bacteriano (1*10 7 UFC/gr).

14 NIVELES DE NH+4 CON DISTINTOS TRATAMIENTOS ppm de NH4/ gr de suelo 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Control TMP2/3 TMP 2/3+Rhabditidae TMP2/3 + Cephalobidae Cephalobidae Rhabditidae Tratamientos DESARROLLO DE CULTIVOS LÍQUIDOS DE ASOCIACIONES NEMÁTODO-BACTERIA

15 LOS NEMATODOS CULTIVADOS Rhabditidae Cephalobidae 10X 20X Cultivo liquido nematodos y huevos Nematodos/ml Dias Rhabditidae Cephalobidae PORCENTAJE DE ECLOSIÓN DEL INÓCULO Rhabditidae 55% Cephalobidae 29%

16 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO DE NEMÁTODOS. Inóculo 10 3 nematodos/ml, es duplicada en 7 días. Inóculo 2x10 3 nematodos/ml, se triplica en 7 días. ENSAYOS DE CAMPO

17 INÓCULO Nemátodos: Rhabditidae y Cephalobidae (3:1) Bacteria: TMP2/3 PLANTAS INOCULADAS Tranque de relave: Relleno sanitario: Algarrobo y Aromo azul. Algarrobo y Colligüay. PREPARACIÓN PARA LA INOCULACIÓN NEMATODO - BACTERIA.

18 INOCULACIÓN DE LA ASOCIACIÓN NEMÁTODO BACTERIA EN LA ZONA RADICULAR DE PLANTAS. SEGUIMIENTO DE: ASENTAMIENTO DE NEMATODOS NIVELES DE AMONIO EN LA RIZOSFERA MUESTREO DE SUSTRATO RADICULAR DE PLANTAS INOCULADAS

19 Poblacion de NBC asentada y recuperada en sustrato radicular Nº nem /100g suelo Log (X+1) INOCULADOS CONTROL Tiempo MEDICION DE AMONIO

20 NIVELES DE AMONIO EN LA RIZÓSFERA DE AROMO Y ALGARROBO EN EL TRANQUE 1 PLANTA MATTA. ppm Nh4-N/ g suelo 0.8 Algarrobo tratamiento 0.7 Algarrobo control 0.6 Aromo tratamiento 0.5 Aromo control Atracción Ingestión Reproducción Dispersión AUMENTA EL NH 4 EN EL SUELO

21 PROYECCIÓN DE ASOCIACIONES NEMÁTODO-BACTERIA Estimulación radicular Protección frente a patógenos Formación de suelo Fertilización * Fijación de N2 * Degradación de materia orgánica * Solubilización de fosfatos Remediación Biológica Integrada (RBI) F O N D O D E F O M E N T O A L D E S A R R O L L O C I E N T I F I C O T E C N O L O G I C O P O N T I F I C I A U N I V E R S I D A D C A T O L I C A D E V A L P A R A I S O Metodología Integrada para Rehabilitar Rellenos Sanitarios y Tranques de Relave PAGINA WEB GRUPO DE GEOTECNIA