k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: 2 106 033 51 kint. Cl. 6 : C12N 15/12 C12N 1/19, C12N 1/21 C12N 5/10, C12N 15/63 C12P 21/02, C07K 7/06 C07K 7/08, C07K 14/705 C07K 17/00, A61K 39/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: 90908809.8 86 k Fecha de presentación : 18.05.90 87 knúmero de publicación de la solicitud: 0 474 727 87 k Fecha de publicación de la solicitud: 18.03.92 k 54 Título: Dominio extracelular de HER2. 30 kprioridad: 19.05.89 US 354319 73 k Titular/es: Genentech, INC. 460 Point San Bruno Boulevard South San Francisco California 94080, US k 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 01.11.97 k 72 Inventor/es: Hudziak, Robert, Michael; Shepard, H., Michael y Ullrich, Axel ES 2 106 033 T3 k 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: 01.11.97 Aviso: k 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
1 ES 2 106 033 T3 2 DESCRIPCION Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere en términos generales al dominio extracelular de la p185 HER2, una proteína semejante a un receptor que está codificada por el homólogo humano al oncogen neu de la rata. Más específicamente, la presente invención se refiere a la utilización de una forma del dominio extracelular, que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático, para la inmunoterapia específica activa. Descripción de los antecedentes y estado de la técnica. El receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2, también conocido como NGL y c-erbb-2 humano, o ERBB2), es el homólogo humano del proto-oncogen neu de la rata. El HER2 codifica para una glucoproteína semejante al receptor de la tirosina quinasa de 1.255 aminoácidos con homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Aunque todavía no se ha aislado ningún ligando que se una a este probable receptor del factor de crecimiento, el producto del gen HER2, p185 HER2, tiene las propiedades estructurales y funcionales de los receptores de factores de crecimiento de la subclase I (Yarden ycol., Ann. Rev. Biochem., 57:443-478 (1988); Yarden ycol., Biochem., 27:3113-3119 (1988). El receptor de las tirosinas quinasas presentan todos el mismo motivo estructural general; un dominio extracelular que se une al ligando, y un dominio de tirosina quinasa intracelular que es necesario para la transducción de la señal, o en los casos anormales, para la transformación. Estos 2 dominios están conectados por una simple secuencia de aproximadamente 20 aminoácidos mayoritariamente hidrofóbicos, denominada la secuencia transmembrana. Se piensa que esta secuencia desempaña un papel en la transferencia de la señal generada por la unión del ligando desde el exterior de la célula al interior. Se ha sugerido también que desempeña un papel en el posicionamiento correcto del receptor en la membrana plasmática. De acuerdo con esta estructura general, la glucoproteína p185 HER2, que se localiza en la superficie celular, puede dividirse en tres porciones principales: un dominio extracelular, o ECD (también conocido como XCD); una secuencia que se extiende a través de la membrana (secuencia transmembrana); y un dominio de tirosina quinasa intracelular citoplasmático. Mientras se presume que el dominio extracelular es un receptor del ligando, como se indicó anteriormente el ligando correspondiente no ha sido todavía identificado. El gen HER2 es de particular interés ya que su amplificación se ha correlacionado con ciertos tipos de cáncer. La amplificación del gen HER2 se ha hallado en las líneas celulares derivadas de tumores de la glándula salivar y gástricos, los adenocarcinomas gástricos y de colon y los adenocarcinomas de las glándulas mamarias. Semba ycol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497-6501 (1985); Yokota ycol., Oncogene, 2:283-287 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 (1988); Zhou ycol., Cancer Res., 47:6123-6125 (1987); King ycol., Science, 229:974-976 (1985); Kraus y col., EMBO J., 6:605-610 (1987); van de Vijver ycol., Mol. Cell. Biol., 7:2019-2023 (1987); Yamamoto y col., Nature, 319:230-234 (1986). Los experimentos de transferencia de genes han mostrado que la sobrexpresión de HER2 transforma las células NIH 3T3 y puede también causar un incremento en la resistencia al factor de necrosis tumoral, citocina de macrófagos tóxica. Hudziak ycol., Amplified Expression of the HER2/ERBB2 Oncogene Induces Resistance to Tumor Necrosis Factor Alpha in NIH 3T3 Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5102-5106 (1988). Ya que la amplificación del gen HER2 produce que ciertas porciones de la p185 HER2 que residen en las superficies de las células afectadas estén muy incrementadas, puede ser que exista exista una interrelación entre las cantidades aumentadas del dominio extracelular de la p185 HER2 en las superficies de las células afectadas y la resistencia de estas células al tratamiento. Por ello sería muy deseable el poder ser capaz de manipular el dominio extracelular de la p185 HER2 con el fin de investigar las diversas posibilidades para el tratamiento de las condiciones asociadas con la amplificación del gen HER2. Estos modelos terapéuticos se relacionan no sólo con el dominio extracelular, sino también con el ligando putativo,elcualsería posible de aislar y caracterizar mediante la utilización del dominio extracelular de p185 HER2 purificado. Descripción resumida de la invención La presente invención se refiere, por tanto, a una composición que comprende una porción extracelular de la molécula de HER2 que contiene al menos 9 aminoácidos, y/o contiene un epítope inmune, el cual está esencialmente exento de las porciones transmembrana e intracelular de la molécula de HER2, y en una forma sustancialmente pura, para su utilización en la inmunoterapia específica activa y la utilización de la mencionada porción extracelular de la molécula de HER2 en la fabricación de una composición para el tratamiento de un paciente por la inmunoterapia específica activa. La porción extracelular puede ser como mínimo un 99% pura, y se puede extender por la porción extracelular entera de la molécula de HER2. Además, la porción extracelular puede ser antigénica en los animales y puede conjugarse con un péptido que presente propiedades inmunogénicas; este péptido puede contener un epítope inmune. La porción extracelular de la molécula de HER2 puede combinarse con adyuvantes adecuados. Breve descripción de las figuras Fig 1. Vector de expresión de HER2 y proteínasdeher2detamaño completo y mutantes. El vector de expresión de HER2 contenía unidades transcripcionales eucarióticas para el cadn de la reductasa dihidrofolato (DHFR) murina y el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) bacteriano, ambos bajo el control del promotor temprano de SV40. La transcripción del cadn de HER2 de tamaño completo se dirigió también por el pro-
3 ES 2 106 033 T3 4 motor temprano de SV40. La proteína de HER2 de tamaño completo contenía un dominio extracelular con grupos ricos en cisteína (rectángulo rallado), separado por la región transmembrana (rectángulo relleno) del domino de tirosina quinasa intracelular (rectángulo abierto). La proteína mutante p185 HER2 TM presenta una deleción de 28 aminoácidos que incluye la región transmembrana. La proteína truncada p185 HER2XCD contiene todas las secuencias N-terminal hasta los 8aminoácidos anteriores a la región transmembrana. Fig. 2. Amplificación de los genes HER2 y HER2 TM. Las líneas celulares transfectadas con los plásmidos que expresan los cadns de HER2, nativo o mutante TM, se amplificaron selectivamente para su resistencia a metotrexato 400 nm. Los cultivos se marcaron metabólicamente con [ 35 S]-metionina y las proteínas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo G-H2CT17. Carril 1: Línea celular control del vector de las células NIH 3T3 transfectadas con CVN. Carriles 2 y 3: Líneas celulares HER2-3, parental y amplificada. Carriles 4,5 y 6,7: Líneas celulares parentales y amplificadas derivadas de dos clones independientes, A1 y B2, del mutante TM. Las flechas indican la posición esperada para las proteínas de peso molecular aparente de 175 y 185 KDa. Fig. 3. Autofosforilación de las proteínas p185 HER2 y p185 HER2 TM. Los lisados con Triton X-100 de las líneas celulares del control, HER2-3 400 ylaslíneas celulares que expresan el TM se prepararon y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo G-H2CT17. Los complejos inmunes se incubaron con 50 µl de HNTG, MnCl 2 5mM con 3 µci [γ 32 P] durante 20 minutos y se realizó una electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5%, y las bandas marcadas se visualizaron mediante autorradiografía. Carril 1: Control del vector CVN. Carril 2: Células HER2-3 400 que expresan el HER2 de tamaño completo. Carriles 3 y4: Doslíneas celulares independientes que expresan la p185 HER2 TM. Las flechas indican las posiciones esperadas de las proteínas de peso molecular aparente de 66,2, 97, 175 y 185 KDa. Fig. 4. Ensayo de secreción de los mutantes TM. Las líneas celulares CVN, HER2-3 400, TM-A1 400 y TM-B2 400 se marcaron con [ 35 S]- metionina durante toda la noche. Se prepararon los extractos celulares con Triton X-100 y se recogió el medio de marcaje. Se inmunoprecipitaron las células y el medio condicionado celular con el anticuerpo G-H2CT17 y se analizaron en geles de SDS-PAGE al 7,5%. Los carriles 1-4 son inmunoprecipitaciones de los extractos celulares de varias líneas celulares, y los carriles 5-8 son inmunoprecipitaciones de los medios condicionados celulares correspondientes. Carriles 1 y 5: Control del vector CVN. Carriles 2 y 6: Líneas celulares HER2-3 400 que expresan la p185 HER2 de tamaño completo. Carriles 3, 4 y 7,8: Las líneas celulares TM-A1 400 y TM-B2 400 que expresan la p185 HER2 TM mutante. Las flechas indican la posición esperada de las proteínas de peso molecular aparente de 175 y 185 KDa. Fig. 5. Secreción de la p185 HER2XCD apartir de las células 3T3 y CHO. Las líneas celulares 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 NIH 3T3 y CHO que expresan la p185er2 de tamaño completo y truncada y los controles de los vectores se marcaron con [ 35 S]-metionina durante toda la noche. Los extractos celulares y los medios condicionados celulares se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal anti-her2, 3E8, y se analizaron en geles de SDS-PAGE al 7,5%. Carriles 1 y 2: Línea celular control de NIH 3T3, el extracto y el medio condicionado. Carriles 3 y 4: Línea celular A1 de NIH 3T3 que expresa la p185 HER2XCD,lascélulas y el medio. Carriles 5 y 6: Línea celular 3 400 de NIH 3T3 que expresa la p185 HER2 de tamaño completo, las células y el medio condicionado. Carriles 7 y 8: Línea celular control de CHO, el extracto celular y el medio condicionado. Carriles 9 y 10: Línea celular 2 de CHO, que expresa la p185 HER2XCD, las células y el medio condicionado. Carriles 11 y 12: Línea celular HER2 500 de CHO, que expresa la p185 HER2 de tamaño completo, las células y el medio condicionado. Las flechas indican el peso molecular de las bandas protéicas indicadas. Fig. 6. Incremento en la expresión de la p185 HER2XCD con la amplificación. La línea celular HER2XCD-2 derivada de CHO se seleccionó para el crecimiento en metotrexato 500 nm y luego en metotrexato 3.000 nm. La línea celular parental, los dos derivados amplificados y las células transfectadas con el vector control se marcaron con [ 35 S]-metionina. Los extractos celulares y los medios condicionados celulares se inmunoprecipitaron con el anticuerpo monoclonal anti- HER2, 3E8, y se analizaron en un gel de SDS- PAGE al 7,5%. Carriles 1 y 2: Extracto celular de CVN y el medio condicionado. Carriles 3 y 4: HER2XCD-2, las células no amplificadas y el medio condicionado. Carriles 5 y 6: HER2XCD-2 amplificada para su resistencia a metotrexato 500 nm, las células y el medio condicionado. Carriles 7 y 8: HER2XCD-2 amplificada en presencia de metotrexato 3.000 nm, células y medio condicionado. Con propósitos comparativos, se cargó una quinta parte como mucho de muestra de la línea celular resistente a metotrexato 3.000 nm, ysecomparóconlaslíneas celulares control y las resistentes a metotrexato 0 nm y 500 nm. Las intensidades de las bandas se cuantificaron con un densitómetro láser LKB2202. Las flechas muestran las posiciones de las proteínas de peso molecular aparente de 88 y 103 KDa. Fig. 7. Biosíntesis de la p185 HER2XCD. La línea celular HER2XCD2 3000 de CHO se marcó con [ 35 S]-metionina y se prepararon los extractos celulares y los medios condicionados celulares. Carriles 1 y 2: Extracto celular y medio condicionado celular. Carriles 3 y 4: El mismo medio condicionado incubado con endo H o con incubación simulada. Carriles 5 y 6: Extracto celular y medio condicionado de las células tratadas con tunicamicina. Las flechas muestran las posiciones esperadas para las proteínas de peso molecular aparente de 73, 88 y 103 KDa. Fig 8. Morfología de las células NIH 3T3 transfectadas con las construcciones de expresión deher2yher2 TM.AyD:Células parentales y células amplificadas a partir de las células NIH 3T3 transfectadas sólo con el vector. B y E: 3
5 ES 2 106 033 T3 6 Células NIH 3T3 que expresan la p185 HER2 TM (línea celular A1), derivada y parental amplificada seleccionada para su resistencia a metotrexato 400 nm. C y F: Células NIH 3T3 que expresan la p185 HER2 nativa (línea celular 3), derivada y parental amplificada, seleccionadas para su resistencia a metotrexato 400 nm. Fig. 9. Tinción inmunofluorescente de la superficie celular y del citoplasma de las líneas celulares control, HER2 y HER2 TM. Las fotos superiores son las células intactas marcadas con el anticuerpo monoclonal anti-her2. Las fotos inferiores son las mismas líneas celulares tratadas con el detergente Triton X-100 al 0,15% antes de la adición del anticuerpo. A y D: Células NIH 3T3 control transfectadas sólo con el vector. B y E: Línea celular HER2 TM-A1 400, que expresa la p185her2 TM. C y F: Línea celular HER2-3 400 que expresa la p185 HER2. Fig. 10. Histogramas del seleccionador de células activado por fluorescencia de la unión de las células control, HER2 y HER2 TM al anticuerpo monoclonal anti-p185 HER2,4D5.Unión al anticuerpo control, 368, dirigido contra el activador del plasminógeno tisular humano, línea punteada clara. Unión al anticuerpo anti-her2, 4D5, línea continua oscura. Panel A: Células NIH 3T3 control transfectadas sólo con el vector. Panel B: Línea celular HER2-3 400, que expresa la p185 HER2. Panel C: Línea celular HER2 TMA1 400 que expresa la p185 TM. Fig. 11. Biosíntesis de las proteínas p185 HER2 y p185 HER2 TM.Laslíneas celulares HER2-3 400 yher2 TM-A1 400 se marcaron con [ 35 S]-metionina y las proteínas p185 HER2 y p185 HER2 TM se recogieron mediante inmunoprecipitación y se analizaronen un gel de SDS-PAGE al 7,5%. Carril 1: Control del vector. Carril 2: p185 HER2 TM no tratada. Carriles 3 y 4: Alícuotas del mismo extracto celular tratado con endo H o sometido a tratamiento simulado con endo H. Carril 5: p185 HER2 no glucosilada a partir de células tratadas con tunicamicina. Carril 6: p185 HER2 no tratada. Carriles 7 y 8: Alícuotas del mismo extracto celular tratado con endo H o sometido a tratamiento simulado con endo H. Carril 9: p185 HER2 TM no glucosilada a partir de las células tratadas con tunicamicina. Las flechas muestran las posiciones de las proteínas de peso molecular aparente de 175 y 185 KDa. Fig. 12. Purificación del dominio extracelular de HER2. Las muestras del dominio extracelular de HER2 purificado se analizaron mediante los protocolos de electroforesis en de Gel-SDS Phast- System y tinción de plata, como se recomienda por Pharmacia. El análisiselectroforético en geles de SDS-poliacrilamida (gradiente del 10%-15%) se realizó de acuerdo con el protocolo de Pharmacia, número 110. La tinción de plata se realizó de acuerdo con el protocolo de Pharmacia número 210. El carril 1 contiene los marcadores de peso molecular (BRL). Carril 2: Concentrado 15X de las células de Ovario de Hámster Chino (1 microlitro). Carriles 3 y 4: Dominio extracelular de HER2 purificado por inmunoafinidad (1,6 microgramos y 0,16 microgramos, respectivamente). Carriles 5 y 6: Dominio extracelular 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 de HER2 purificado por inmunoafinidad después de la cromatografía de DEAE (0,25 microgramos y 0,083 microgramos, respectivamente). Carriles 7 y 8: Dominio extracelular de HER2 después de la formulación en PBS (0,32 microgramos y 0,082 microgramos, respectivamente). Fig. 13. La secuencia aminoacídica predecida del dominio extracelular de HER2, con la correspondiente secuencia de ácidos nucléicos. Las secuencias encuadrados muestran los potenciales epítopes de células T, mediante la utilización del algoritmo desarrollado por Margolit ycol.,j. Immunol. 138:2213-2229 (4) (1987). Descripción detallada Se había hipotetizado en un principio que la eliminación de la secuencia transmembrana produciría una proteína que sería secretada por la célula. Como se indicó previamente, la secuencia transmembrana está compuesta principalmente por aminoácidos hidrofóbicos, quienes anclan eficazmente la proteína en la membrana celular. Por ello, se esperaría que la eliminación de esta secuencia permita el paso de la proteína a través de la membrana. De acuerdo con ello, se preparó una primera construcción que delecionaba exactamente en fase los 22 aminoácidos de la secuencia transmembrana de HER2, y 3 aminoácidos en cada extremo (Figura 1). La construcción se preparó de la manera siguiente: El fragmento EcoRI central que contenía el segmento transmembrana se clonó en el sitio EcoRI del vector bacteriófago M13mp18 (Yanisch-Perron y col., Gene, 33:103-119 (1985). La cadena no codificante se utilizó como molde para la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos. La construcción delecionaba la secuencia transmembrana y 3 aminoácidos adicionales antes y después. Se delecionaron los residuos 651-678 al cebar la síntesis del ADN de cadena doble con un oligonucleótido de 30 pares de bases de secuencia 5 CAG AGA GCC AGC CCT CAG CAG AAG ATC CGG 3. Las células SR101 se transformaron con el ADN de cadena doble y se identificaron los mutantes mediante hibridación con el mismo oligonucleótido marcado en el extremo 5 mediante la polinucleótido quinasa y [γ- 32 P]ATP (Amersham, 5000 Ci/mmol). Un fragmento EcoRI que contenía la deleción se recombinó en un plásmido, que expresa el cadn de HER2, reemplazando la secuencia nativa. Cuando se expresó en las células NIH 3T3, este mutante, designado como HER2 TM, produjo un polipéptido, que se designó p185 HER2 TM, de peso molecular aparente de 175 KDa (Figura 2, carriles 5 y 7). La producción tuvo lugar a niveles comparables a la p185 HER2 nativa, amplificada al mismo nivel de resistencia al metotrexato (Figura 2, carril 3). Las proteínas mutantes también retuvieron una vigorosa actividad de tirosina quinasa. En presencia de [γ- 32 P]-ATP, las proteínas mutantes (Figura 3, carriles 3 y 4) se autofosforilaron en la misma magnitud que la p185 HER no modificada (Figura 3, carril 2). La Figura 3 muestra también las proteínas relacionadas con la p185 HER2 TM, autofosforiladas, de peso mo-
7 ES 2 106 033 T3 8 lecular inferior al de la proteína completa. Estas proteínas más pequeñas pueden representar productos de degradación y, ya que no se observaron con la p185 HER2,podrían implicar una diferencia en el procesamiento intracelular de la forma mutante. Para determinar si la forma que carece de la secuencia transmembrana se secretó, se marcaron metabólicamente las células con 35 S-metionina. Las condiciones del cultivo que se utilizaron aquí fueron las siguientes: las células se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio Eagle modificado de Dulbecco y F12 con una mezcla de nutrientes de Ham, suplementado con glutamina (2mM), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 µg/ml) y suero al 10%. Las líneas celulares derivadas de NIH 3T3 se cultivaron con suero vacuno (Hyclone). Las células de Ovario de Hámster Chino deficientes en dihidrofolato reductasa (CHO-DHFR) se cultivaron con suero bovino fetal (Gibco) suplementado con glicina (0,13 mm), hipoxantina (0,11 mm), y timidina (0,02 mm). (Para la selección del plásmido transfectado con el gen DHFR o para amplificar los plásmidos introducidos mediante selección con metotrexato, se omitieron la hipoxantina y la glicina, y el suero se dializó extensamente y se sustituyó por suero bovino fetal). Se analizaron ambos, las células y el medio condicionado celular, para la p185 HER2. La Figura 4 muestra que toda la p185 HER2 se mantuvo asociada a las células(carriles2,3,4),ynila proteína nativa ni la forma mutante se secretaron (carriles6,7,8). Por ello, contrariamente a lo esperado, la deleción de la secuencia transmembrana no fue suficiente para producir una forma secretada de la p185 HER2. El descubrimiento de que la p185her 2 TM no se secretaba sugería que quizás existen secuencias distales a la región transmembrana que impiden el paso de la p185 HER2 através de la membrana plasmática. Se realizó, según ello, un segundo mutante que contenía un codón de parada UAA 8 aminoácidos antes del inicio de la secuencia transmembrana propuesta (Figura 1). La segunda construcción truncaba la p185 HER2 8aminoácidos antes del inicio de la región transmembrana en el residuo 645 mediante la adición de una cadena polipeptídica que finalizaba en un codón TAA. El oligonucleótido 5 AAG GGC TGC CCC GCC GAG TAA TGA TCA CAG AGA GCC AGC CCT 3 se utilizó para cebar la síntesis del ADN de cadena doble a partir del mismo molde que se utilizó para construir el mutante TM. Las placas mutantes se identificaron mediante hibridación con el oligonucleótido marcado en 5, y se confirmó medianteelanálisis de la presencia de un sitio Bcl 1 también introducido directamente después del codón ocre. El mutante de cadena truncada, designado HER2 XCD,serecombinó entonces en un plásmido de expresión del cadn de HER2. La estructura del plásmido y de los 2 derivados de HER2 mutantes se muestra en la Figura 1. La secreción de la forma resultante de la p185 HER2, designada como p185 HER2XCD, se 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 analizó primeramente mediante el marcaje metabólico de las células con 35 S-metionina, seguido de la inmunoprecipitación de las proteínas relacionadas con la p185 HER2 a partir de ambos, las células y los medios condicionados celulares. En el proceso de inmunoprecipitación (Hudziak ycol., Proc.Natl. Acad. Sci.USA, 84:7159-7163 (1987)), las células se cosecharon mediante tripsinización, se contaron electrónicamente con un contador Coulter, y se plaquearon 6 h. antes del marcaje como mínimo. Se retiró el medio de plaqueo, se lavaron las células con PBS y se resembraron con medio mínimo modificado de Dulbecco exento de metionina. Se añadió [ 35 S]-metionina (Amersham, 800 Ci/mmol, 29,6 TBq/mmol) a 100 µci/6 cm de placa en un volumen de 3 ml. Las células se lisaron a 4 C con 0,4 ml de tampón de lisis HNEG por cada 6 cm de placa. Al cabo de 10 minutos, se añadieron 0,8 ml de tampón de dilución de lisis (tampón HNEG con albúmina sérica bovina al 1%, detergente Triton X-100 al 0,1%) a cada placa y los extractos se limpiaron mediante microcentrifugación durante 5minutos. Se recogió el medio para analizar la secreción de las proteínas relacionadas con la p185 HER2 yse limpió mediante microcentrifugación. Se añadieron los anticuerpos a los extractos celulares o al medio condicionado y se permitió la unión a 4 C durante 2-4h. El anticuerpo policlonal, G-H2CT17(0), que reconoce los 17 aminoácidos del extremo carboxilo de la p185 HER2, se utilizó para la caracterización de las líneas celulares que expresan la forma transmembrana delecionada de la p185 HER2.Elanticuerpo monoclonal 3E8, que reconoce un epítope del dominio extracelular (Hudziak y col., Mol. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989)), se utilizó a8 µg/reacción para inmunoprecipitar la forma truncada. Se añadieron siete µgdelaigganti-murina de conejo a la inmunoprecipitación utilizando este anticuerpo monoclonal para mejorar la unión a la Sepharose-proteína A. Los complejos inmunes se recogieron mediante absorción a las bolas de Sepharose-proteína A y se lavaron (Hudziak y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5102-5106 (1988); Hudziak ycol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7159-7163 (1987)). Las proteínas se separaron en geles de sodio dodecil sulfatopoliacrilamida (SDS-PAGE) y se analizaron mediante autorradiografía. Esto puso de manifiesto una forma de la p185 HER2XCD de PM de 88.000 KDa que está asociada con las células (Figura 5, carril 3 y 9); sin embargo, los medios condicionados celulares de ambas líneas celulares derivadas de NIH 3T3 yovariodehámster Chino también contienen grandes cantidades de una proteína de PM de 103.000, que se inmunoprecipita con el anticuerpo monoclonal anti-her2 (Figura 5, carriles 4 y 10). También se expresó la p185 HER2 de tamaño completo en ambas células, NIH 3T3 y CHO (Figura 5), carriles 5 y 11. No existe secreción de la p185 HER2 a partir de cualquiera de estos tipos celulares (Figura 5, carriles 6 y 12). El tamaño mayor de las proteínas observadas en las células y el medio condicionado celular (88.000 y 103.000, respectivamente) compa- 5
9 ES 2 106 033 T3 10 rado con el tamaño predecido por la secuencia aminoacídica (71.644) sugería que la forma truncada se había glucosilado. Esto se confirmó mediante el tratamiento de las células con el antibiótico tucamicina, que impide la N-glucosilación. El tratamiento con tucamicina dió como resultado la aparición de una proteína asociada a la célula de PM de 73.000, que es cercano al predecido por la secuencia aminoacídica (Figura 7, carril 5). Este inhibía también, casi completamente la secreción de la p185 HER2XCD en el medio (Figura 7, carril 6). El medio condicionado celular de las células tratadas con tucamicina contiene sólo pequeñas cantidades de la forma de 103.000 madura, y ninguna delasformasmás pequeñas (carril 6). Esto sugería además que la secreción de la p185 HER2XCD está ligada a la glucosilación. La extensión de la glucosilación de la forma secretada se investigó con la enzima endoglucanasa H (endo H, Boehringer Manheim). Esta enzima hidrolizará los oligosacáridos unidos a la asparagina del tipo de elevada manosa. Los oligosacáridos de elevada manosa son intermediarios biosintéticos en el proceso de glucosilación. La maduración final de las cadenas laterales de los carbohidratos implica el recorte de algunas manosas y la adición de otros azúcares tales como la fucosa. Tales cadenas laterales de oligosacáridos maduras son resistentes a la endo H. Para determinar si la p185 HER2XCD es resistente a esta enzima, seinmunoprecipitó elmedio condicionado celular marcado con 35 S-metionina. Los inmunoprecipitados se recogieron sobre las bolas de Sepharose-proteína A y se incubaron con endo H. En los medios condicionados de las células que expresaban la p185 HER2XCD no se observó ninguna reducción en la movilidad asociada con la hidrólisis de las cadenas laterales de grupos glucosilos, ni en el medio con incubación simulada (carril 3), ni en el tratado con endo H (carril 4), lo que demuestra que la glucosilación es completa. Estos resultados, sin estar unidos por ninguna teoría en particular, tomados juntos sugieren que laformaasociadaalacélula de la p185 HER2XCD es un intermediario, y que el dominio extracelular de la p185 HER2 glucosilado y completamente maduro se sintetiza y secreta. Podría hipotetizarse que la falta de secreción de la proteína p185 HER2 M es el resultado de la presencia de información de procesamiento en la secuencia transmembrana, que es necesaria para el transporte por el aparato de Golgi y para dirigir la membrana plasmática; sin embargo, a partir de estos estudios parece que el transporte del dominio extracelular del receptor de la tirosina quinasa (o receptor similar) a la superficie de la célula está ligado a la glucosilación característica. Por ello, la inserción del codón de parada UAA, 8 aminoácidos antes del inicio de la secuencia transmembrana propuesta, produce un dominio extracelular de la p185 HER2 glucosilado y completamente maduro que se secreta libremente por la célula. Habiendo tenido éxito en la producción de una forma secretada de la p185 HER2,lapróxima etapa implicaba investigar si la cantidad de pro- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 teína secretada podría incrementarse por la amplificación génica. Mediante la utilización de la línea celular derivada de CHO, se halló que podría incrementarse la cantidad de dominio extracelular mediante la selección con metrotexato. La cantidad de producto secretado incrementó 29 veces en las células seleccionadas para su resistencia a metotrexato 500 nm, y un incremento adicional de 4,4 veces mediante la selección para su resistencia a metotrexato 3.000 nm (Fig. 6). Por ello, se obtuvo un incremento total de 128 veces en la p185 HER2XCD secretada cuando esta línea celular se amplificó para su resistencia a metotrexato 3000 nm, lo que hacía posible la producción de cantidades relativamente grandes de p185 HERXCD. Para determinar si la sobrexpresión de la p185 HER2 TM se produce en la transformación celular, se introdujo el ADN en las células de mamífero mediante el procedimiento de coprecipitación con CaHPO 4 (Graham y col., Virology, 52:456-467 (1973)). Cinco µg del ADN del plásmido se añadieron a las placas mitad confluentes de células (6,0 cm) en 1 ml durante 4-6 h. El ADN se retiró ylascélulas se trataron con glicerol al 20% (v/v). Al cabo de dos días, se añadió el agente selectivo para la expresión fenotípica, geneticina, a 400µg/ml. Los clones se repicaron mediante la utilización de cilindros de clonación de vidrio con vaselina para pegar la parte inferior. Los plásmidos se amplificaron por el procedimiento de selección con metotrexato (Kaufman ycol., J.Mol. Biol., 159:601-621 (1982)). Cuando el mutante TM se expresó enlas células NIH 3T3, las colonias no amplificadas primariamente después de la selección presentaban el fenotipo no transformado, aplanado, normal (Figura 8, comparar la foto B con el control del vector sólo, foto A). Después de que el nivel de expresión se incrementara por la selección con metotrexato, las células tomaron la apariencia de células transformadas, refringentes, en forma de huso ytambién crecieron amontonadas en acúmulos irregulares (foto E). Esta observación es similar a nuestros primeros hallazgos con el cadn de HER2 no modificado (fotos C y F, parentales y derivadas amplificadas, respectivamente), y sugiere que los niveles elevados de la expresión de la proteína TM mutante fueron también transformantes. Los cambios morfológicos vistos a niveles equivalentes de amplificación (400 nm de metotrexato) no son tan marcados para el mutante, lo que implica que el potencial de transformación deestaformadelap185 HER2 puede ser inferior. A niveles superiores de resistencia al metotrexato, las células TM se tornan cada vez más transformadas en su apariencia. El plásmido fue también negativo en un ensayo de formación de foco, mientras que el plásmido de HER2 de tipo nativo fue positivo, lo que indica además que el potencial de transformación de la proteína p185 HER2 TM es inferior. Las células que expresan niveles elevados también exhiben otra propiedad del fenotipo transformado, el crecimiento en agar blando. La formación de colonias en agar blando se determinó mediante 6
11 ES 2 106 033 T3 12 el cosechamiento de cada línea celular a analizar con tripsina, el contaje de las células (contador Coulter), y el plaqueo de 80.000 células por placas de 6 cm. La capa superior consistió de4ml de agar al 0,25% (Difco, purificado ) sobre una capa inferior de 5 ml de agar al 0,5%. Las colonias se contaron al cabo de 3-4 semanas. Se plaquearon las células de 2 clones independientes en agar blando para hacer crecer colonias en el agar blando con una eficiencia comparable a las células que expresan el gen HER2 de tipo nativo: TABLA I Formación de colonias en agar blando Línea celular N de colonias en agar blando # CNV 0 CVN 400 0 HER2-3 0 5+/-1 HER2-3 400 208 +/ - 27 TM-A1 0 0 TM-A1 400 205 +/ - 62 TM-B2 0 0 TM-B2 400 205 +/ - 13 Se utilizaron dos líneas celulares control; las células NIH 3T3 tranfectadas con un plásmido que sólo expresa los genes neo y DHFR, y la misma línea amplificada para su resistencia a metotrexato 400 nm. El número de colonias en agar blando que se produjo se determinó para ambas líneas celulares, la parental y la amplificada, de los clones que expresan cualquiera de las proteínas p185 HER2 o p185 HER2. Cada línea celular se sembró por triplicado y se calculó el valor medio. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención se ha determinado que la eliminación de sólo la secuencia transmembrana no conduce a la secreción de la p185 HER2, a menos que se delecione también todo el dominio de tirosina quinasa. La eliminación de este dominio da como resultado la glucosilación característica y la secreción del dominio extracelular. Con el fin de obtener material de trabajo del dominio extracelular de HER2 purificado, se debe primero concentrar mediante ultrafiltración el líquido de la cosecha de las células de Ovario de Hámster Chino (CFF) que contiene el HER2 ECD recombinante, y purificarse entonces mediante una cromatografía de inmunoafinidad que utiliza un MAb específico de HER2 conjugado a Sepharose activada con CNBr; se pueden utilizar otros soportes adecuados de inmovilización. El CCf concentrado se aplica a la columna de afinidad después de la filtración a través de un filtro Millipor de 0,2 micras. Se realizan los ciclos necesarios de purificación hasta que se procesa la cantidad de CCF deseada. Durante cada ciclo de purificación, se aplica el CCF concentrado y la columna de afinidad se lava hasta la línea de base con tampón Tris 0,5 M quecontienenacl0,15maunphdeaproximadamente 7,5 (TB). Se eluye entonces el dominio 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 extracelular de HER2 de la columna con tampón citrato sódico 0,1 M que contiene NaCl 0,5 M a un ph de aproximadamente 3,5. Las fracciones del eluyente de la columna de afinidad que contenían HER2 ECD se agruparon y se neutralizaron. La columna de inmunoafinidad se volvió a equilibrar entre cada ciclo de purificación con TB. En una segunda etapa, se intercambia el tampón del eluyente de la columna de afinidad por 25 ml de tampón Tris, a un ph de aproximadamente 7,0 (TB2). Se aplica entonces el dominio extracelular de HER2 a una columna de DEAE Sepharose Fast Flow, y se lava con TB2. Se elimina el HER2 ECD de la columna mediante la etapa o elución en gradiente salino en TB2 (que contiene hasta NaCl 200 nm). Después de la cromatografía de DEAE, las fracciones de HER2 ECD purificadas se agrupan, se intercambia su tampón por una solución salina de tampón fosfato, y se almacenan a 2 C-8 C. El material que resulta es sustancialmente puro, es decir, aproximadamente 99% puro (ver Fig. 12). Mediante los procedimientos de la presente invención es posible, según ello, producir un dominio extracelular de la p185 HER2 glucosilado y secretado. Esto abre diversas posibilidades para posteriores investigaciones, así como también un amplio campo de aplicaciones terapéuticas potenciales. Como se indicó previamente, el gen HER2 es de un particular interés ya que su amplificación se ha correlacionado con ciertos tipos de cáncer. En un estudio de 189 adenocarcinomas de glándulas mamarias primarios, se halló que el 30% contenían amplificaciones del gen HER2. Slamon ycol., Human Breast Cancer: Correlation of Relapse and Survival with Amplification of the HER-2/neu Oncogene, Science 235,177-182 (1987). La amplificación se correlacionó conun pronóstico negativo y una elevada probabilidad de recidiva. Esto sugiere que de 120.00 mujeres diagnosticadas con cáncer de mama cada año, 36.000 presentarán una amplificación de HER2. Aproximadamente la mitad de estas mujeres, o alrededor de 15.000, puede esperarse que exhiban una amplificación mayor de 5 veces, lo que corresponde a cerca de la mitad de las 40.000 muertes relacionadas con cánceres de mama anuales. Se ha demostrado que un anticuerpo monoclonal dirigido específicamente contra el dominio extracelular de la p185 HER2 inhibe el crecimiento de las líneas celulares derivadas de tumores de mama, que sobrexpresan el producto del gen HER2; impide la formación de colonias en agar blando de las células NIH 3T3 transformadas con HER2; y reduce la resistencia al efecto citotóxico del factor de necrosis tumoral alfa que acompaña la sobrexpresión de HER2. Hudziak y col., p185 HER2 Monoclonal Antibody has Antiproliferative Effects In Vitro and Sensitizies Human Breast Tumor Cells to Tumor Necrosis Factor, Mol. Cell. Biol. 9: 1165-1172 (1989). Ver también, Drebiny col., Inhibition of Tumor Growth by a Monoclonal Antibody Reactive with an Oncogene-Encoded Tumor Antigen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9129-9133 (1986) 7
13 ES 2 106 033 T3 14 (tratamiento in vivo conunanticuerpomonoclonal anti-p185 conocido por inhibir el crecimiento tumorigénico de las células NIH 3T3 transformadas con neu e implantadas en el ratón). Este efecto ofrece la posibilidad de que las condiciones caracterizadas para la amplificación del gen HER2 puedan estar sujetas al tratamiento por la inmunoterapia específica activa. Esta modalidad terapéutica contempla el provocar una respuesta inmune en un paciente mediante la vacunación con una forma inmunogénica del dominio extracelular. El dominio extracelular (o un derivado de lo mismo, como se discute más adelante) puede ser combinado con un adyuvante local que es seguro y efectivo en los humanos, tal como el alumbre, el Bacillus calmette-guerin (BCG), adyuvantes derivados de las paredes celulares de BCG, el Detox (Ribi-inmunochem), el Syntex-1 o el Corynebacterium parvum. Alternativamente, los adyuvantes sistémicos, tales como el Interferón gamma, lainterleucina 1, lainterleucina 2 o la Interleucina 6 pueden ser adecuados. Para maximizar la respuesta humoral y la mediada por células se seleccionaría una dosis apropiada y programada. Puede también ser posible incrementar la respuesta inmune dirigiendo el inmunogen hacia el sistema inmune, que podría conducir a una captura más eficiente del antígeno por las células que presentan el antígeno, o controlando el inmunogen a fin de que se presentara en las moléculas de la Clase 1 del MHC, ya que ello induce generalmente una respuesta de las células T. Además de la imnunoterapia específica activa, sería posible utilizar el dominio extracelular purificado par aislar y caracterizar el ligando putativo. El ligando de HER2 puede utilizarse a su turno para liberar la toxina contra las células tumorales que sobrexpresan el HER2, como la fusión molecular del ligando con la toxina, o por 5 10 15 20 25 30 35 40 unión química. Alternativamente, los pacientes que sobrexpresan el HER2 pueden ser vacunados con el ligando de HER2 conjugado a, o en combinación con, un adyuvante adecuado. Un paciente que sobrexpresa el HER2, presumiblemente también sobrexpresará el ligando de HER2. La interacción de la unión ligando-her2, que contribuye probablemente al crecimiento del tumor, puede inhibirse al bloquear el ligando libre en el suero de los pacientes. Este bloqueo se puede realizar mediante el tratamiento del paciente con el dominio extracelular de HER2, que procederá a unir el ligando de HER2 libre, por consiguiente impide la unión del ligando al sitio del receptor de HER2. En vez de utilizar el dominio extracelular de HER2 per se, puede ser más deseable el utilizar un derivado que presente una afinidad incrementada por el ligando, y/o tenga una vida media in vivo aumentada. Se sabe que las uniones intermoleculares mejoran la afinidad de unión en las células, lo que sugiere que la unión intermolecular artificial puede utilizarse para mejorar la capacidad de unión del dominio extracelular de HER2. La vida media del dominio extracelular en el suero puede ser mejorada mediante, por ejemplo, la fusión del dominio extracelular con otras moléculas presentes en el suero que son conocidas por tener una vida media larga, tales como la porción Fc de una molécula de inmunoglobulina. La presente invención se ha descrito necesariamente en el presente documento haciendo referencia a ciertos procedimientos y materiales específicos. Debe entenderse que la descripción de estos procedimientos y materiales específicos no constituye de ninguna manera una limitación del ámbito de la presente invención,elcualcom- prende cualquier material y procedimiento alternativos adecuados para conseguir los objetivos de la presente invención. 45 50 55 60 65 8
15 ES 2 106 033 T3 16 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la fabricación de una composición para su utilización en la inmunoterapia específica activa que comprende, la fabricación de una porción extracelular de la molécula de HER2 que comprende al menos 9 aminoácidos y/o un epítope inmune, esencialmente libre de las porciones transmembrana e intracelular de dicha molécula de HER2, y en una forma sustancialmente pura. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la porción extracelular de la molécula de HER2 tiene una pureza de al menos aproximadamente 99%. 3. Procedimiento según la reivindicación1ola reivindicación 2, en donde la porción extracelular de la molécula de HER2 comprende la porción extracelular entera de la molécula de HER2. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la porción extracelular de la molécula de HER2 se conjuga con un péptido que tiene propiedades inmunogénicas. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en donde dicho péptido comprende un epítope inmune. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición comprende además un adyuvante. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en donde el adyuvante comprende uno cualquiera de los constituyentes del grupo que comprende: el alumbre, el Bacillus calmette-guerin (BCG), un 5 10 15 20 25 30 35 derivado de la pared celular de BCG, el Detox, el Corynebacterium parvum, el interferón gamma, la interleucina 1, la interleucina 2, el Syntex-1 o la interleucina 6. 8. Utilización de una porción extracelular de la molécula de HER2 que comprende al menos 9 aminoácidos y/o un epítope inmune, esencialmente libre de las porciones transmembrana e intracelular de dicha moléculade HER2, en lafabricación de una composición para el tratamiento de un paciente mediante la inmunoterapia específica activa. 9. Utilización según la reivindicación 8, en donde la porción de la molécula de HER2 comprende la porción extracelular entera de la molécula de HER2. 10. Utilización según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde la porción extracelular de la molécula de HER2 se conjuga con un péptido que tiene propiedades inmunogénicas. 11. Utilización según la reivindicación 10, en donde dicho péptido comprende un epítope inmune. 12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la composición comprende un adyuvante. 13. Utilización según la reivindicación 12, en donde el adyuvante comprende uno cualquiera de los constituyentes del grupo que comprende: el alumbre, el Bacillus calmette-guerin (BCG), un derivado de la pared celular de BCG, el Detox, el Corynebacterium parvum, el interferón gamma, la interleucina 1, la interleucina 2, el Syntex-1 o la interleucina 6. 40 45 50 55 60 65 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 9
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