A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación: Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección con rayo laser. Técnicas: FISH, CGH, MLPA: rearreglos cromosomales, variación en número de cromosomas. PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos específicos), PASA (amplificación alelo específica), alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA. Real time PCR. Microarray detección de mutaciones desconocidas: SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR. Determinación de grado de metilación de ADN Se utilizan para detectar: Rearreglos cromosómicos Pérdidas o ganancias cromosomales Mutaciones puntuales y polimorfismos Grado de metilación Permiten: Detección de individuos portadores de mutación recesiva (Detección de mutación en genes oncosupresores en individuos que aún no desarrollaron cancer). Diagnóstico prenatal Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD). Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de la base genética de la enfermedad, diagnóstico, clasificación de tumores, ERM, prognosis). Identificación de SNP s 1
Real time PCR Este método se aplica tanto para la determinación de duplicaciones y deleciones y para alteraciones puntuales (polimorfismos y mutaciones). Diagnóstico Cuantificación relativa (duplicaciones y deleciones) (MLPA y CGH) Comparación de cantidad de una determinada región en el genoma entre dos situaciones (enfermo vs sano) A B A R A R B B No de copias relativo = 2 (ΔCtB-ΔCtA)= 2 (ΔCtGen-ΔCtRef) Si la eficiencia es del 100% Para calcular eficiencia: pendiente de la variación del Ct con la dilución para cada gen Distintos tubos o mismo tubo con distintas sondas fluorescentes 2
Alteraciones puntuales (mutaciones y polimorfismos) PCR en tiempo real Variación en el Tm: Análisis de variación de Tm Discriminación de alelos con primers específicos o con sondas específicas a) Usar sonda FRET ó molecular beacon que hibride en la zona en que se encuentra la mutación a analizar. (no se usa sonda de hidrólisis ni Sybr green) b) Análisis del Tm del producto formado Mezcla de reacción Ej.: FRET ADN del paciente ó producto de PCR de una zona acotada primer forward primer reverse sonda de anclado: 5 LCRed-oligo sonda sensora: oligo-fluoresceína dntp Taq pol Sonda sensora Aplicación de Real time PCR para detección de variantes conocidas y desconocidas dentro de la secuencia de la sonda 3
PCR en tiempo real Discriminación de alelos con primers específicos ó con sondas específicas Análisis de variación de Tm Discriminación de alelos con sondas específicas Mutación responsable de la enfermedad de Tay Sachs (inserción de 4 pb) Molecular Beacon 4
Para aumentar el poder de discriminación entre alelos hay que utilizar una sonda sensora lo más corta posible Se puede acortar aún más el tamaño de la sonda mediante modificaciones que aumenten la estabilidad de la doble cadena Sistema de detección eclipse Se puede utilizar una sonda PNA (ác nucleico peptídico) 5
Identificación de la/s alteraciones responsables o que se asocian con una enfermedad genética Aneuploidías en meiosis variación en número de cromosomas Clonado de un gen candidato dada una enfermedad genética analizar síntomas y parámetros que caracterizan la enfermedad. Buscar gen candidato Cancer Alteración en cromosomas Comparación de genomas Comparación de transcriptomas Proteómica Patrones de metilación de ADN o histonas. Análisis de ligamiento y clonado posicional del gen Si dos genes están localizados en el mismo cromosoma, en forma cercana uno del otro es muy probable que se hereden en forma conjunta Aplicable a enfermedades monogenéticas, algunos cánceres en los que el gen que predispone se hereda en forma mendeliana (gen de Retinoblastoma). Marcadores de posicionamiento usados: RFLP, SSLP s Estudios de asociación en una población Aplicable a enfermedades Complejas. Marcadores usados: SNP s Diabetes, asma, autismo, transtornos mentales, lupus, migraña, hipertensión, epilepsia, Alzheimer, etc. 6
Enfermedades genéticas complejas Estudios de asociación en población: Estudios de gran escala de asociación comparando en una población casos vs controles sanos. Se testea dentro de una población la correlación de la presencia de un alelo dado con la presencia de la enfermedad. Un marcador alélico que se encuentra en una colección de individuos afectados con una frecuencia diferente a la de la población control, se dice que está asociado. Puede ser una asociación positiva (suceptibilidad) o negativa (resistencia). El marcador puede estar en el mismo gen de suceptibilidad o puede ser un marcador asociado al alelo que causa suceptibilidad (Desequilibrio de unión). 7
Desequilibrio de unión: ocurre cuando una combinación de alelos en diferentes locus ocurre más frecuentemente en una población de lo que podría ser esperado por una asociación al azar. Cuanto más cercanos más probable que se hereden juntos. SNP s: Polimorfismos de un único nucleótido. Estos son diferencias en la secuencia de ADN en una única base que puede ser observada entre individuos de una población. Se trata de polimorfismo si el alelo menos común ocurre en un porcentaje de 1% o mayor en una población. Los SNP s se presentan en el genoma humano con una frecuencia promedio de 1 cada 1000 pb. Son generalmente bialélicos entonces para aumentar el polimorfismo se debe determinar la asociación combinada de varios SNP s cercanos al gen de suceptibilidad (haplotipo). Ejemplos de Genes de suceptibilidad: Diabetes mellitus insulino-dependiente:gen de suceptibilidad del locus HLA. Alzheimer: gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 (ApoE) y en cromosoma 12. Migraña: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 19 y en cromosoma X. Psoriasis: Gen de suceptibilidad en el cromosoma 3. Diabetes no insulino-dependiente: cromosoma 12 y cromosoma 2 Asociación de distintos tipos de cancer con SNP s La asociación no es del 100% ya que otros genes son necesarios para para que la enfermedad se desarrolle. La fuerza de asociación es una indicación de la contribución relativa del locus a la etiología de la enfermedad. La gran mayoría es un desequilibrio de unión entre un determinado alelo en un locus y un locus de suceptibilidad a la enfermedad. Aquí la fuerza de asociación es función de la distancia de recombinación entre el marcador y el locus de suceptilbilidad y de la contribución relativa del locus a la etiología de la enfermedad. 8
Se están elaborando actualmente mapas de alta densidad de SNP s del genoma humano. Se calcula que hay mas de 10 millones de SNP s en el genoma humano. De la gran cantidad de SNP s totales, interesan los que se encuentran en zonas codificantes, o aquellas que afecten la regulación de la transcripción, el splicing o la traducción de genes o sea que el polimorfismo tenga una consecuencia funcional. También se estudian para cada enfermedad en particular, alrededor de genes que se sospecha que puedan tener algún efecto en el desarrollo de la misma. Utilidad en biomedicina de los SNP s * Análisis forénsico * Establecimiento de relaciones entre diferentes poblaciones y dilucidar migraciones ancestrales * Estudio de desordenes multifactoriales o complejos. Monitoreo de suceptibilidad y resistencia Cononcer cuales son los genes de suceptibilidad permite contar con nuevos target para una terapia. * Farmacogenómica 9
Métodos de estudio de SNP s: SNP s desconocidos: Secuenciación (pyrosecuenciación), SSCP, DGGE, Clivaje enzimático de heteroduplex, microarray (variant detection array (VDA)) SNP s conocidos: Secuenciación, Cualquiera de los métodos descriptos para detección de mutaciones conocidas Microarray. Ensayo a gran escala con miles de muestras Microarrays (análisis múltiple) 10
Microarrays Hibridación alelo específica Unir al soporte oligos correspondientes a las distintas variantes posibles para cada SNP. Cada chip se tendrá miles de oligos (array de alta densidad). Cada chip se hibrida con ADN amplificado marcado de un individuo y se visualiza la señal positiva en las posiciones correspondiente a los oligos complementarios a sus SNP s. Se puede aplicar tanto para la detección de SNP s desconocidos como la determinación de SNP s conocidos. Detección de SNP s desconocidos Array de detección de variantes (VDA) A y B: Distintos individuos 1-25 2-26 3-27 4-28 etc T G C A Oligos sintetizados sobre el soporte de 25 nt de longitud Tamaño 8L Homocigotas, heterocigotas Se amplifican distintas regiones del ADN, se marca y se hibrida sobre el chip (también es utilizable para detección de SNP s conocidos) 11
Sobre SNP s conocidos 1) Amplificación de ADN y Hibridación alelo específica (discriminación sobre el array): demasiados spots, demasiadas amplificaciones. 2) Amplificación de ADN Hibridación alelo específica (discriminación sobre el array) Cortar ADN con enzima de restricción Ligar adaptadores a los extremos de los fragmentos Amplificar con un solo par de primers 3) Amplificación de ADN Hibridación alelo específica (discriminación sobre el array) PCR múltiple 12
4) Amplificación de ADN PCR múltiple Discriminación de alelo en solución Detección sobre array Hibridación con productos de extensión de un único nucleótido (SNuPE ó SBE). Protocolo 142 SNP s 9 reacciones (9 pooles, los SNP s de cada pool comparten el mismo polimorfismo,multiplex PCR) 9 multiplex SBE ddutp-biotina, ddctp-fluoresceína Se combinan los pooles Se hibridan a un chip que tiene las secuencias complementarias a los tags unidos a cada SNP Lavado y tinción con Phycoerytrina-streptavidina escaneado Colección de fluorescencia A 530 y 560 nm Variante genérica: Tag-SBE (array de oligonucleótidos genéricos de alta densidad- Los oligos (tag) no deben dar reacción cruzada y deben tener similares características de hibridación. 13
5) Discriminación de alelo sobre el ADN genómico Amplificación de los targets discriminados con un solo par de primers (ó 3 primers) Detección s/array (array de secuencias complementarias a tags) P1 Molecular Inversion probe Discriminación en la reacción de extensión de un solo nucleótido Golden Gate assay Discriminación por hibridación alelo específica 14
Enfermedad determinada por alteraciones genéticas: estudios que se pueden realizar A nivel de proteínas A nivel de ARNm A nivel de ADN Detección de apoptosis 15
A nivel de ARNm: Variación en niveles de expresión de genes : Hibridación sustractiva por supresión SAGE Microarray RT-PCR cuantitativa (RT-PCR en tiempo real) 16
SAGE AAAAA TTTTT b cdna synthesis Serial analysis of Gene Expression (SAGE) redrawn from (Velculescu et al., 1995) CATG GTAC Primer A GTAC AAAAA TTTTT b Divide in half Ligate to linkers A + B Cleave with anchoring enzyme (AE) Bind to streptavidin beads AAAAA TTTTT b CATG GTAC Cleave with tagging enzyme (TE), Blunt end GGATGCATGXXXXXXXXX CCTACGTACXXXXXXXXX TE AE Ligate and amplify with primers A and B GGATGCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGCATCC CCTACGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACCTAGG Ditag Primer B AAAAA TTTTT b GGATGCATGOOOOOOOOO CCTACGTACOOOOOOOOO TE AE Cleave with anchoring enzyme Isolate Ditags Concatenate and clone -----CATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXOOOOOOOOOCATG----- -----GTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXOOOOOOOOOGTAC----- AE Tag 1 Tag 2 AE Tag 3 Tag 4 AE Ditag Ditag mrna is reverse transcribed using biotinylated oligo(dt) primers to produce cdna, and this is subsequently cleaved with a 4 bp recognition site restriction endonuclease (e.g. NlaIII) termed the anchoring enzyme (AE). Restriction fragments, biotinylated at the 3 end, are immobilised using streptavidinated beads and then divided in half. Each fraction is ligated to one of two adapter linkers (A and B), designed to contain sequence complementary to the overhangs produced by the anchoring enzyme, a type IIS restriction enzyme recognition site (e.g. BsmFI) known as the tagging enzyme (TE), and sufficient additional sequence complementary to adaptamer PCR primers. Cleavage with the tagging enzyme releases the linker and a short cdna sequence known as the tag. Tags from pools A and B are blunt ended and ligated to each other to form ditags. Ditags serve as amplification templates for PCR using adaptamer primers A and B, and cleavage of amplification products with the anchoring enzyme releases the ditags. Ditags are concatenated by ligation and concatemers cloned and subsequently sequenced. Serial sequence analysis of ditags of fixed length is achieved using the anchoring enzyme recognition site as punctuation in the sequence. 17
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Microarray aplicado a expresión genómica: el mrna proveniente de una dada línea celular o tejido se usa para generar una muestra marcada que se hibrida en paralelo, a un gran número de secuencias de ADN, inmovilizado sobre una superficie sólida en forma ordenada. Miles de transcriptos pueden ser detectados simultáneamente. 20
Aumento de cantidad de RNA para microarray (cuando hay poca muestra) dntp marcados 21
Objetivos Interés en hallar el cambio en la expresión Estudiar patrones de expresión global génica, causa de la alteración del fenotipo También para análisis de hipermetilación Muestras a comparar Causa o efecto? Redundancia Insuficiencia Reg. Traducc. # estadíos #etapas del ciclo celular Activacion por # factores Software: para comparaión de # patrones de expresión validación de los resultados 22
Ejemplo: Distinguir distintos tipos de linfoma difuso de células B (DLBCL) Morfologica y inmunohistoqcamente homogeneo. DLBCL Clinicamente heterogéneo, solo el 40% responde bien a la terapia. FL CLL Array de 18000 cadn: Genes que se inducen o reprimen durante la activacion de células B y T por mitógenos. cadn de células B germinales. Biblioteca de DLBCL. Clones con cadn de linfoma folicular (FL), de leucemia (CLL) y de otros linfomas. y otros genes de importancia en linfocitos y en biología del cancer (reproducibilidad) Muestras cuyo perfil de mrna se estudió: DLBCL, FL, CLL, linfocitos en distintos estadíos. Del mrna proveniente de cada muestra se obtuvo un cadn marcado con Cy5. Se compara con un cadn de calibración (obtenido de pool de mrna de 9 líneas celulares de linfomas) marcado con Cy3. G E N E S En total: 1.800.000 medidas en 96 muestras usando 128 microarrays. < > Genes coordinadamente expresados en muestras relacionadas 23
Cel B Germinales DLBCL Cel B s/act FL CLL Distincion entre FL y CLL por un lado Y DLBCL Inhomogeneidad en DLBCL 24
Descubrimiento de distitos tipos en el linfoma difuso de celulas B (DLBCL) Hay dos grupos bien diferenciados en base a la expresion de genes de B germinal y de genes de B activados (no histologica ni inmunologicamente). Clasificacion de paciente: en base a los dos sets de genes (heterogeneidad) A los 5 años de tratamiento sobrevive el 52% del total (76% delos GC-like Y 16% de los B-like. Buscar dentro de cada tipo subgrupos en base a expresión de otros genes Potencial del análisis de cluster Identificar función de genes desconocidos por asociación con genes conocidos Identificar la firma de un tipo celular o estadío. Util para clasificación de tumores Identificar un mecanismo de control de la transcripción 25
RT-PCR en tiempo real IL1-b A Referencia B Referencia A IL1-b B Numero de veces diferentemente expresado en el estado A respecto del estado B = Eficiencia (ΔCtA-ΔCtB) ΔCtA= Ct gen-ct referencia en la condición A (patológica) ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B (sano) 26
Cambios epigenéticos Hipermetilación Metilación aberrante de DNA e histonas Identificación sitios de hipermetilación Análisis de la alteración de expresión por desmetilación por la técnica de microarray Validación: PCR y secuenciación post tratamiento con bisulfito de sodio ó PCR en tiempo real post tratamiento con bisulfito ó RT-PCR en tiempo real Diagnóstico: Detección, clases de tumor, prognosis 1) Efecto de metilación sobre corte con enzimas de restricción 2) Cambio de nucleótido por acción del bisulfito de sodio y detección alelo específica de mutación Ejemplo PCR en tiempo real: -discriminación alelo específica (con primers especificos) (Tokum -Variación en Tm 3) Silenciamiento de transcripción por metilación por RT-PCR en tiempo real (Sybr green) 27
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Metodo de detección de SNP s en multiwell 29