Destruyendo mitos enológicos?: Efecto del etanol y las enzimas de maceración en la extracción de taninos de semillas. Implicaciones enológicas Gómez-Plaza, E.*1, Busse-Valverde, N. ; Fernández-Fernández, J.I.2, Gil-Muñoz, R.; Martínez-Cutillas, A.; López-Roca, J.M.1, Bautista-Ortín, A.B1 Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia Campus de Espinardo, 30011 Murcia, SPAIN e-mail: encarna.gomez@um.es Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agroalimentario Trabajo presentado en la 28ª REUNIÓN ANUAL DEL GRUPO DE TRABAJO DE EXPERIMENTACIÓN EN VITICULTURA Y ENOLOGÍA. 16 y 17 de abril de 2013. Murcia, España INTRODUCCIÓN Los taninos son compuestos importantes para la calidad del vino tinto, ya que participan en las sensaciones de astringencia, amargor, estructura y cuerpo y en la estabilización del color. Los taninos se encuentran localizados en los hollejos y semillas de la uva. Las semillas contienen mayor concentración de taninos que los hollejos y mayor proporción de unidades galoiladas (Prieur et al., 1984), mientras que los hollejos contienen subunidades de epigalocatequina en su estructura y presentan mayor grado de polimerización que los taninos de las semillas (Moutounet et al., 1996). Estas diferencias en la composición química de los taninos afectan a sus propiedades organolépticas. Así, el porcentaje de galoilación y el grado medio de polimerización han sido positivamente correlacionados con la astringencia. En cambio, la presencia de unidades de epigalocatequina en los taninos parece disminuir esta percepción en el vino. Por eso, a los taninos de las pieles se les adscriben sensaciones mas redondas y suaves que a los de las semillas, considerados mas secos y astringentes. Los taninos pasan de la uva al vino durante la maceración. Siempre se ha considerado que los taninos de las semillas solo serán extraídos hacia el final del proceso de maceración, cuando los lípidos de las semillas sean eliminados (Glories y Saucier, 0) por la presencia de altos contenidos de etanol. 1
El uso diferentes técnicas enológicas pretende ayudar a modular la proporción de compuestos fenólicos de hollejos (antocianos y taninos principalmente) y semillas (taninos) en los vinos. Varias técnicas han sido desarrolladas con este fin. Entre las propuestas para ayudar a liberar los compuestos fenólicos de los hollejos de la uva y evitar la extracción de taninos de las semillas se encuentran el uso de bajas temperaturas antes de fermentación y el uso de enzimas de maceración, los cuales ayudan a degradar el hollejo de la uva y favorecer la difusión de los compuestos presentes en el mismo. El objetivo de este trabajo es determinar qué hay de verdad en afirmaciones comúnmente aceptadas, como es que el etanol es necesario para extraer taninos de semilla o que las enzimas de maceración solo afectan a la estructura de los hollejos, o si son solo mitos enológicos. Además, queremos comprobar cómo esto se ve reflejado en los resultados de algunas técnicas enológicas (maceración prefermentativa a baja temperatura y enzimas de maceración) MATERIAL Y MÉTODOS Ensayo con etanol Este ensayo fue realizado a temperatura ambiente colocando 100 g de semillas de la variedad Monastrell con 830 ml de diferentes soluciones de vino modelo (ajustadas a ph 3.6 con ácido tartárico y 50 mg/l de S0 2 ) mostrando distinto contenido de alcohol (0, 5, 10 y 15%). Las soluciones junto con las semillas fueron agitadas dos veces al día y los muestreos se realizaron cada dos días. El tiempo de maceración fue de 10 días y todos los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. Ensayo con enzimas Las semillas de bayas de la variedad Monastrell fueron manualmente separadas de los hollejos y la pulpa y lavadas con agua destilada. 0.5 g de semillas fueron maceradas con 15 ml de diferentes soluciones modelo. La extracción se llevó a cabo en un agitador magnético a 700 rpm y a temperatura ambiente durante 48 horas, todo ello en oscuridad. Tres soluciones fueron ensayadas: una solución control (solución acuosa conteniendo 5 g/l de ácido tartárico y ph 3,6) y otras dos soluciones donde un enzima comercial fue ensayado, una de ellas idéntica a la solución control y la otra 2
conteniendo 12% de etanol. El enzima (Enozym Vintage, Agrovin, Spain) fue adicionado a una dosis de 10 mg/l. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Ensayo con vinificaciones Tres vinificaciones fueron realizadas a partir uvas de la variedad Monastrell de la vendimia del 9 cultivadas en secano en una parcela de la D.O. de Jumilla: una vinificación control (VC), una vinificación con una previa maceración prefermentativa a 10ºC durante 10 días (VMPF) y otra vinificación con adición de un enzima comercial después del estrujado (VE, Enozym vintage, Agrovin S.A., España, 5g/100kg de uva). Todas las vinificaciones fueron realizadas en depósitos de 100 litros y por triplicado, a partir de 90 kg de uva. La uva fue previamente despalillada, estrujada y sulfitada con una dosis de 8 g de SO2 por cada 100 Kg de uva. La acidez total fue corregida a 5,5 g/l. La levadura de fermentación utilizada fue Levuline GALA (Oenofrane, Francia) con una dosis de 10 g/100kg de uva y el tiempo de maceración fue de 10 días. La recogida de muestras fue llevada a cabo a los 2, 6 y 10 días de maceración para la realización de los análisis de taninos. La concentración y composición de los taninos fueron determinadas utilizando el método de la fluoroglucinolisis descrito por Kennedy y Jones (1) con algunas modificaciones (Busse-Valverde et al., 2010). Las muestras de mosto-vino fueron preparadas siguiendo el método propuesto por Pastor del Río et al. (6). Los análisis de los taninos fueron realizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) según el método propuesto por Busse-Valverde et al. (2010). Estos análisis permiten la determinación del contenido total de taninos, el grado medio de polimerización (GPm), el porcentaje de galoilación (%G) y el porcentaje de epigalocatequina (%EGC). El tratamiento estadístico de los datos se ha realizado utilizando el paquete estadístico Statgraphics 5.0 Plus. RESULTADOS Y DISCUSION El efecto del etanol sobre la concentración de taninos de las semillas se muestra en la Tabla 1. La concentración de taninos se incrementa con el aumento de etanol aunque es de remarcar que la disolución que solamente contenía agua 3
consiguió extraer también una importante concentración de taninos de las semillas, solo un 30% menos que la disolución con un 15% de etanol. Los resultados del experimento con taninos en soluciones modelo indican que el etanol no es esencial para la extracción de taninos de las semillas, aunque su extracción es más intensa y rápida en presencia del mismo, especialmente al comienzo de la maceración, ya que desde el día 6 hasta el 10 de maceración la velocidad de extracción es exactamente igual para todas las soluciones. El principal efecto del alcohol es probablamente ayudar a desorganizar la capa lipídica que protege a las semillas. Una vez que la cutícula ha sido eliminada (lo cual ocurre más rápido en presencia de alcohol), los taninos son extraídos independientemente del contenido del mismo. Tabla 1. Concentración de taninos (mg/l) en las disoluciones con distinto contenido en etanol. Dias de extracción Concentración de etanol 0% 5% 10% 15% 2 15,63 20,85 21,30 24,90 4 29,22 46,03 52,88 69,73 6 37,38 51,45 66,51 81,20 8 67,16 89,27 101,28 119,89 10 116,23 131,11 148,54 160,09 Para comprobar que repercusiones tiene este hecho en vinificaciones cuyo efecto se basa, en parte, en la asunción de que sin etanol no hay extracción de taninos de semillla, se realizó una elaboración donde se utilizó maceración prefermentativa en frío, técnica usada para conseguir extraer, durante la etapa prefermentativa en frio, mas compuestos fenólicos de las pieles y evitar la extracción de fenoles de las semillas, y esta vinificación se comparó con una vinificación control. La Figura 1 muestra la concentración y composición de los taninos durante los 10 días de maceración fermentativa en ambas vinificaciones. A los 2 día de maceración se observan grandes diferencias entre las vinificaciones. Los 10 días de maceración prefermentativa en frío produjeron una gran extracción de taninos. Los valores de taninos siguen incrementándose en esta vinificación hasta el día 6, para 4
después mantenerse estables. Pero es muy de señalar que la vinificación con la maceración prefermentativa en frio presentó un contenido muy elevado de taninos procedentes de semilla, demostrándose lo observado en las disoluciones modelo, que la extracción en medio acuoso favorece tambien la extracción de taninos de las semillas y no solo de las pieles. Figura 1. Concentración y composición de los taninos durante los 10 días de maceración fermentativa en una vinificación con una etapa de maceración prefermentativa en frio (MPF) y una vinificación control 800 Taninos totales (mg/l) GmP 10 9 8 600 7 6 400 800 Taninos hollejo (mg/l) Control MPF Taninos de semilla (mg/l) 5 4 3 250 600 400 150 100 50 2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 Dias de maceración fermentativa Dias de maceración fermentativa De forma similar, para comprobar si los enzimas de maceración comunmente utilizados en enología tiene efecto sobre la extracción de taninos de semilla, diversas actividades enzimaticas fueron probadas en disoluciones acuosas e hidroalcohólicas y se midió la cantidad de taninos extraídos. Se puede ver claramente en la Tabla 2 como el enzima incrementa de forma importante la concentración de los taninos de las semillas en la disolución modelo, siendo su efecto más marcado con la presencia de etanol, aunque por el contrario, no 5
fueron observadas diferencias en el GPm. Las paredes celulares de las células de las semillas están compuestas por celulosa, hemicelulosa, pectinas, proteínas, lignina, mucílagos y gomas, por tanto, el uso de un enzima de maceración en el que están presentes varias de estas actividades, podría ser capaz de producir la destrucción de la organización celular y subcelular de los tejidos de las semillas, favoreciendo la liberación de los taninos presentes en las mismas. Tabla 2.Concentraciones de taninos (mg/l) en las distintas soluciones en presencia de distintas actividades enzimáticas Control Celulasa PG Xilanasa PME Enzima comercial Solución acuosa Taninos 1126 a 2402 b 3345 c 1535 ab 1168 a 4622 d GPm 8,9 a 9,5 ab 9,1 a 10,3 c 9,9 bc 9,0 a %Galoilación 9,0 a 10,6 b 14,7 c 10,6 b 7,9 a 15,4 c Solución hidroalcohólica Taninos 1616 a 4851 c 4501 c 2444 b 4603 c 7727 d GPm 9,1 cd 8,9 c 9,2 cd 9,3 d 7,7 a 8,3 b %Galoilación 10,2 a 13,1 b 15,4 c 10,8 a 10,3 a 15,7 c Para comprobar si esto también se observaba en vinificaciones reales, la concentración y composición de una vinificación control se comparó con otra donde se utilizó un enzima comercial (Figura 2). El uso del enzima promovió un aumento en el contenido de taninos durante todo el proceso de maceración, aunque este aumento es más ralentizado en los últimos días del mismo. Varios estudios también han obtenido un mayor contenido de taninos con la aplicación de enzimas, pero siempre ha sido atribuido a una mayor degradación de las paredes celulares del hollejo de la uva. Los vinos control y con enzima evolucionan de forma similar respecto al GPm, taninos procedentes de hollejo y de semilla pero siempre son superiores en los procedentes de la vinificación con enzima. Parece que la acción del enzima facilita una mayor extracción de taninos tanto de los hollejos como de las semillas, pero sin cambiar su proporción o composición respecto al vino control. 6
Figura 2. Concentración y composición de los taninos durante los 10 días de maceración fermentativa en una vinificación con enzimas de maceración y una vinificación control 800 A Taninos tatales (mg/l) B GPm 9 8 600 7 6 400 5 Vino control Vino con enzimas 4 800 C Taninos hollejo (mg/l) D Taninos semillas (mg/l) 3 250 600 400 150 100 50 2 4 6 8 10 Días de maceración 2 4 6 8 10 Días de maceración CONCLUSIONES Los ensayos diseñados han demostrado que el etanol no es imprescindible para la extracción de taninos de semilla y que las enzimas de maceración también degradan las estructuras de las semillas, favoreciendo la extracción de taninos de éstas. Cuando estos efectos se comprobaron en bodega, los resultados fueron corroborados. Las vinificaciones mostraron que la maceración prefermentativa frío, contariamente a lo esperado, produce vinos con mayor contenido de taninos procedentes de las semillas, mientras que el uso de enzimas de maceración también promueve una mayor extracción de taninos, pero sin cambios importantes en su 7
composición respecto al vino control, indicando que el enzima favorece la extracción de compuestos fenólicos tanto de los hollejos como de las semillas. BIBLIOGRAFÍA Busse-Valverde, N., E. Gómez-Plaza, J. M. López-Roca, R. Gil-Muñoz, J. I. Fernández-Fernández, and A. B. Bautista-Ortín. 2010. Effect of Different Enological Practices on Skin and Seed Proanthocyanidins in Three Varietal Wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58:11333-11339. Glories, Y.; Saucier, C. Tannin evolution from grape to wine. Effects on wine taste. In The ASEV 50 th Anniversary Annual Meeting; Ratz, J., Ed.; ASEV: Davis, CA, 0. Kennedy, J. A. and G. P. Jones. 1. Analysis of Proanthocyanidin Cleavage Products Following Acid-Catalysis in the Presence of Excess Phloroglucinol. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:1740-1746. Moutounet, M., J. Rigaud, J. M. Souquet, and V. Cheynier. 1996. Caracterisation structurale des tanins de las baie de raisin. Quelques exemples de l'incidence du cepage, du terroir et du monde de conduite de la vigne (1). Bull. O. I. V. 433-443. Pastor del Rio, J. L. and J. A. Kennedy. 6. Development of proanthocyanindins in vitis vinifera L. cv. Pinot noir grapes and extraction into wine. American Journal of Enology and Viticulture 57:125-132. Prieur, C., J. Rigaud, F. V. Cheynier, and M. Moutounet. 1994. Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds. Phytochemistry 36:781-784. 8