1 TRABAJO PRACTICO Nº2 RECONOCIMIENTO Y PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS I) Péptidos Los aminoácidos pueden condesarse entre sí, uniéndose a través del grupo carboxilo de un aminoácido al grupo amino de otro aminoácido, lo que se denomina enlace peptídico. Los péptidos se forman por uniones de aminoácidos a través de los enlaces peptídicos, según el número de aminoácidos que componen el péptido existen: dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, etc. Si un péptido posee menos de diez aminoácidos se conoce como Oligopéptido; los que exceden este tamaño se conocen como polipéptidos. II) Proteínas Las proteínas están constituidas por largas cadenas polipeptídicas, en donde los aminoácidos están ubicados en una secuencia determinada y esto corresponde a una estructura primaria de una proteína. La estructura secundaria se refiere a la extensión en que un polipéptido o cadena posee una estructura helicoidal. Una espiral diestra o ά-hélice se estabiliza mediante la presencia de enlaces hidrógeno entre los grupos carbonilo e imido de los enlaces peptídicos. La estructura terciaria se refiere al modo como la cadena polipeptídica se curva para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las proteínas globulares, la estabilización de esta estructura se atribuye a las diferentes reactividades asociadas a los grupos R de los residuos aminoacídicos tales como: interacciones electrostáticas enlaces hidrógenos, interacciones hidrofóbicas, unión disúlfuro. La estructura cuaternaria pone de manifiesto como se disponen en el espacio las cadenas, por ejemplo: la enzima fosforilasa contiene dos subunidades idénticas que por separado son catalíticamente inactivas, pero cuando se unen para formar un dímero, constituyen la enzima activa.
2 III) PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS Las propiedades biológicas de una proteína, así como parte de sus propiedades físico-químicas, dependen de su estructura. Cuando estas estructuras se alteran o se destruyen, aunque no haya ruptura de las cadenas polipeptídicas, la proteína pierde sus características funcionales y se alteran sus propiedades físico-químicas; este proceso se denomina desnaturalización. El término desnaturalización tiene una variedad de significados, según: la proteína sea o no oligomérica, la pérdida de la conformación sea parcial o completa y la actividad biológica se pierda o no. En algunos casos el proceso es irreversible, en otros, se puede restaurar la conformación nativa y la actividad biológica. Los agentes desnaturalizantes actúan esencialmente destruyendo los enlaces puente hidrógeno y las uniones disúlfuro, lo que altera las estructuras secundaria y terciaria de las proteínas. Los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos fuertes, bases fuertes, calor y agitación mecánica. El aspecto más visible en la desnaturalización es el descenso de la solubilidad proteica. Por tales causas, los manejos de proteínas se hacen a temperatura reducida para evitar la desnaturalización térmica, se emplean tampones para mantener el carácter poliiónico natural de la proteína y se evita el trauma físico como la agitación o se mantiene al mínimo. Las investigaciones que tratan del aislamiento, purificación, y análisis de las proteínas, son verdaderamente representativas del arte del análisis bioquímico. IV) ACCIONES PARA DESNATURALIZAR LAS PROTEÍNAS 1. PRECIPITACIÓN POR SOLVENTES ORGÁNICOS La adición de solventes orgánicos neutros miscibles con el agua, tales como: metanol, etanol o acetona, disminuye la solubilidad en agua de la mayor parte de las proteínas globulares de tal manera que precipitan de la solución. La solubilidad de una proteína a un ph y fuerza iónica determinados está en función de la constante dieléctrica del medio.
3 La constante dialéctica (ε) está definida por la relación: F = e 1 x e 2 εr 2 F e 1 y e 2 r : Fuerza de atracción entre dos iones de carga opuesta : Cargas de los iones. : Distancia entre los iones. El agua tiene constante dieléctrica relativamente alta (ε=80 a 20º C) por lo cual en solución acuosa disminuye la interacción entre las moléculas proteicas (debido a sus grupos cargados) mientras aumenta la interacción entre las proteínas y el agua, esto favorece la solubilidad de las proteínas. Los solventes orgánicos tales como el metanol, etanol, acetona, tienen constantes dieléctricos bajas (32, 25 y 19 respectivamente a 20º C) de modo que al agregarlos a una solución acuosa de proteínas baja la constante dieléctrica del medio, lo que favorece la interacción de los grupos con carga eléctrica de la proteínas y por lo tanto de su precipitación. La precipitación proteica por los solventes no solo se explica en base a la constante dieléctrica, también, hay que considerar la deshidratación de las proteínas. Las moléculas del solvente no acuoso forman hidratos compitiendo por el agua con las moléculas proteicas produciéndose la precipitación por deshidratación de las proteínas. Los solventes pueden llegar a distorsionar la estructura de las proteínas, posiblemente por acción a nivel de los enlaces hidrofóbicos, determinando la desnaturalización de las proteínas. Este fenómeno disminuye a bajas temperaturas ya que el calor por sí mismo es un agente desnaturalizante. 2. PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR FOMACION DE SALES INSOLUBLE Las proteínas precipitan por la acción de ciertos ácidos como el ácido Tricloroacético, ácido túnqstico, ácido molíbdico y otros; también las proteínas pueden precipitar por la acción de ciertos iones metales pesados como Hg, Zn, Cd, Cu, y Pb. Todos estos agentes hacen precipitar las proteínas por que forman con ellas sales insolubles. El mecanismo de acción de estos agentes es la siguiente: los precipitantes ácidos forman sales insolubles con las formas catiónicas (+) de la proteína, siendo necesario efectuar el proceso de un ph más ácido que el punto isoeléctrico. A su vez los metales
4 pesados forman sales insolubles con las formas aniónicas (-) de la proteína necesitándose entonces un ph más alcalino que el punto isoeléctrico. 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA Dentro de un intervalo de temperatura entre 0ºC y 40ºC aumenta la solubilidad de las proteínas con el aumento de temperatura. Por sobre 40ºC a 50ºC la mayor parte de las proteínas son cada vez más inestables y comienzan a desnaturalizarse, por lo común con pérdida de solubilidad. La desnaturalización puede conducir a la coagulación de la proteína, es decir, a su agregación y precipitación irreversible. La coagulación es un criterio para reconocer la desnaturalización de una proteína. La formación de un coagulo blanco, insoluble, cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo común de desnaturalización térmica. Los fraccionamientos de proteínas por lo general se realizan a 0 C, ya que la mayor parte de las proteínas son estables a bajas temperaturas. 4. PRECIPITACIÓN O SEPARACION POR PUNTO ISOELECTRICO Las moléculas proteicas son polivalentes, es decir, llevan varias cargas en forma simultánea. Aparte de los grupos carboxilo (COO - ) y amino terminales (NH 3 ), la molécula proteica puede tener otras cargas positivas provenientes de aminoácidos diaminados. Otras cargas negativas pueden provenir de aminoácidos dicarboxílicos, aminoácidos con grupos SH y aminoácidos de carácter fenólico. Se denomina carga neta de la proteína a la diferencia absoluta entre el número de cargas positivas y el número de cargas negativas. Una misma molécula proteica puede presentar cualquiera de los tres estados electroestáticos (positivo, neutro, negativo) dependiendo del ph del medio en el cual se encuentra disuelta. Si el número de cargas positivas es mayor que el número de cargas negativas, la proteína estará cargada positivamente y viceversa. Si el número de cargas positivas es igual al de las cargas negativas, entonces la proteína será eléctricamente neutra. El punto isoeléctrico, queda definido como aquel valor de ph al que la molécula proteica no posee carga eléctrica neta ya que hay igualdad de cargas positivas y negativas y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. Cada proteína y aminoácido tiene un punto isoeléctrico (ph) característico que depende del número de grupos ionizables y de sus constantes de disociación.
5 La menor solubilidad en el ph igual al punto isoeléctrico, se debe a que como la molécula no tiene carga eléctrica neta, no existen repulsiones electroestáticas entre moléculas de proteínas vecinas, lo cual conduce a la formación de agregados insolubles. Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de ph, también diferentes, con frecuencia pueden separarse, unas de otra, mediante precipitación isoeléctrica. La menor solubilidad de una proteína en su punto isoeléctrico puede ser utilizado como un método conveniente para determinar este punto. V) ELECTROFORESIS Es un término que se refiere al movimiento de partículas cargadas (iones) en un campo eléctrico. Es uno de los métodos más efectivos de separación y caracterización. Los requerimientos básicos son: a) Que los componentes de la mezcla tengan forma iónica o puedan ser convertidos en iones. b) Que cada componente tenga una carga neta distinta. La electroforesis ha sido muy valiosa en el aislamiento y separación de proteínas esto se debe a que los métodos electroforéticos se pueden realizar en condiciones muy suaves protegiendo a las proteínas de cualquier modificación estructural severa. En la actualidad han adquirido gran desarrollo las técnicas electroforéticas de zona en que las proteínas se mueven a través de un soporte uniforme del tipo de un gel, almidón, etc. VI) PROPIEDAD TAMPÓN DE LAS PROTEINAS El carácter de ácido débil de las proteínas en presencia de sus bases conjugadas les permite funcionar como soluciones tampones, es decir, que pueden agregarse cantidades relativamente grandes de ácido o de álcalis sin que varíe apreciablemente el ph. Esta propiedad es de gran importancia en los sistemas biológicos, donde se ha visto que las proteínas constituyen el principal sistema tampón. Por ejemplo, aproximadamente el 80% del poder amortiguador de la sangre de los mamíferos se debe a las proteínas.
6 VII) REACCIONES PARA EL RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS Las reacciones de coloración para el reconocimiento de proteínas se basan en muchos casos en la identificación de grupos estructurales de algunos de sus aminoácidos. 1. Reacción de Biuret La prueba de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino) es positiva para todos los compuestos que tengan dos o más uniones peptídicas. La coloración púrpura de una reacción positiva se debe a un complejo de coordinación entre el Cu +2 y cuatro átomos de nitrógeno proveniente de enlaces peptídicos. 2. Reacción xantoproteíca o reacción del ácido nítrico. En esta reacción se obtiene una coloración amarilla (griego XANTHOS=amarillo). El ensayo es positivo para las proteínas que llevan el anillo bencénico (aromático) como la tirosina, triptófano y fenilalanina. El color amarillo se debe a la formación de un compuesto aromático nitrado. Esta reacción explica la aparición de una coloración amarilla al caer gotas de ácido nítrico sobre la piel. OBJETIVO GENERAL Reconocer las propiedades de las proteínas. TRABAJO EXPERIMENTAL OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Observar la acción de los solventes orgánicos sobre las proteínas. 2. Observar la precipitación de las proteínas por formación de sales. 3. Observar la acción del calor sobre las proteínas.
7 i) Reacciones de Identificación A) La reacción se desarrolla de acuerdo a la siguiente tabla Tubo 1 2 3 Agua destilada --- --- Solución de albúmina Solución de leche Reactivo de Biuret 1 ml 1 ml 1 ml B) La reacción se desarrolla de acuerdo a la siguiente tabla Tubo 1 2 3 Agua destilada --- --- Solución de albúmina Solución de leche Acido nítrico concentrado 1 ml 1 ml 1 ml Nota: Tenga precaución al manipular el ácido nítrico concentrado, al caer sobre la piel puede provocar quemaduras. Evite la inhalación de sus vapores. Realice esta reacción bajo la campana. ii) Acción de solventes orgánicos Disponga de 3 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla: Tubo 1 2 3 Solución de albúmina Etanol Metanol Acetona Observe y anote sus resultados. Nota: Emplee las siguientes expresiones para los resultados No cambia : - Opalescencia : + Precipitado : ++
8 iii) Precipitación por formación de sales Prepare la siguiente serie de tubos: Tubo 1 2 3 Solución de albúmina Solución tampón ph= 9 1 ml 1 ml 1 ml Nitrato de plata Nitrato de plomo Cloruro férrico Observe y anote sus resultados. Nota: Emplee las siguientes expresiones para los resultados No cambia : - Opalescencia : + Precipitado : ++ iv) ACCION DEL CALOR SOBRE LAS PROTEINAS a) En un tubo coloque 8 ml de solución de albúmina y caliente en baño termoregulado a 37 ºC, b) En un tubo de ensayo, coloque 10 ml de solución de albúmina y caliente en un mechero con cuidado la parte superior hasta que hierva, compare con la parte inferior. v) Capacidad Tampón de las proteína En un tubo de ensayo coloque 3 ml de la solución de albúmina y agregue 2 gotas del indicador rojo Congo. Luego agregue lentamente 2 ml de una solución de ácido clorhídrico HCl 0,1 M. Anote el volumen gastado para virar el color. Repita la operación para un tubo de ensayo con 3 ml de agua destilada.
9