PNT-CO-01 PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO AEROBIAS/MICROAERÓFILAS DE CRECIMIENTO RÁPIDO, Y ANTÍGENOS DE HELICOBACTER PYLORI Y SHIGATOXINA Elaborado por Revisado por Aprobado por Dr. José Gutiérrez Fernández Director Técnico de Unidad Dra. Consuelo Miranda Casas Director Técnico de Sección Dr. José María Navarro Marí Director del Laboratorio EDICIÓN: 01 FECHA DE APROBACIÓN: 01/11//14 Página 1 de 11
INDICE 1. Coprocultivo. Concepto 3 1.1. Concepto 1.2. Microorgasnismos a investigar 2. Muestras para coprocultivos 3 2.1. Etiquetado. 2.2. Registro informático. 2.3. Muestras inaceptables. 2.4. Criterios de rechazo. 3. Procesamiento...4 3.1. Examen directo. a) Examen en fresco. b) Tinción de Gram. 3.2. Siembra de las muestras. 4. Inoculación...5 4.1. Examen rutinario. Medios de cultivo. 4.1.1. Placa de Agar Mac Conkey 4.1.2. Medios entéricos. a) Moderadamente selectivos b) Medio líquido 4.1.3. Medios para Campylobacter spp. 4.1.4. Medios para Yersinia spp. 4.1.5. Detección de Helicobacter y Toxina Shiga. 4.2. Cultivos especiales. 4.2.1. Vibrio spp. 4.2.2. Salmonella spp. 4.2.3. Escherichia coli. 4.2.4. Aeromonas mesofilas. 5. Interpretación.8 5.1 Coprocultivo de rutina 5.2 Identificación 6. Resultados 10 6.1. Cultivos negativos. 6.2. Cultivos positivos. 6.2.1. Resultados positivos 6.2.2. Disbacteriosis 6.2.3. Detección de antígenos y toxinas. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN: 01/11/2014 Página 2 de 11
1. Coprocultivo. Concepto. 1.1. Concepto. 1.2. Microorganismos a investigar. Salmonella spp. Shigella spp. Vibrio spp. * (petición expresa) Yersinia enterocolitica Campylobacter spp. Aeromonas spp Escherichia coli O157 (heces con sangre) 2. Muestras para coprocultivo. Para la recogida, transporte y manipulación de muestras podrán tenerse en cuenta los protocolos establecidos por la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Se requiere una parte pequeña del tamaño de 1 cm 3, o bien 1 ml aproximadamente de heces diarreicas. Es necesario tomar la parte muco-purulenta, si ésta está presente, en las heces del paciente. La muestra así tomada se depositará en un contenedor de boca ancha, similar al utilizado para orinas. En lactantes se pueden tomar las heces procedentes del pañal. No son aconsejables los escobillones rectales. La muestra se enviará al laboratorio tan pronto sea posible o se mantendrá en frigorífico a 4 ºC, 5 ó 6 horas. La muestra de elección para el cultivo de agentes bacterianos productores de gastroenteritis es una porción de heces diarreicas, nunca heces formes. A partir del cuarto día de hospitalización no debe realizarse coprocultivo para la determinación de gérmenes enteropatógenos habituales salvo en situaciones especiales. Las muestras de heces se procesarán para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes a su emisión. Si esto no es posible, es conveniente su conservación en un medio de transporte adecuado manteniéndose en refrigerador hasta su siembra. Los escobillones rectales son aceptables sólo para cultivos de muestras de un niño con diarrea aguda. Los escobillones deben mostrar heces. No se recomienda el cultivo sistemático de meconio o heces de recién nacido para diagnóstico de una infección neonatal. 2.1 Etiquetado. Se procederá a etiquetar con un número y su código de barras tanto la muestra como el volante de petición en los dos lugares preparados al efecto. 2.2 Registro informático. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 3 de 11
Pasará la muestra a la sección de procesamiento y el volante de petición a la sección de registro informático, dónde se le dará entrada mediante su código. 2.3 Muestras inaceptables. Los escobillones anales. Muestras no conservadas de más de 4-6 horas. Muestras conservadas cuyo indicador está virado indicando fallo del sistema buffer. Muestras múltiples del mismo día. 2.4 Criterios de rechazo. No se admitirán muestras de heces que vengan derramadas en la bolsa contenedora del recipiente, así como las que el volante no venga cumplimentado con los datos del paciente y su ubicación o sin los datos del médico peticionario que impidan el envío correcto de los resultados. 3. Procesamiento. 3.1 Examen directo. El examen microscópico directo de las heces persigue la observación de polimorfonucleares, que sugieren infección por un patógeno invasivo. a) Examen en fresco: sólo en heces hemorrágicas y diarreicas. b) Tinción de Gram: evaluación de purulencia y flora. Permite observar polimorfonucleares y flora predominante. 3.2. Siembra de las muestras (Procesamiento). Sembrar los medios de enriquecimiento líquidos. Con un asa diseminar la muestra en cada una de las placas, procediendo a realizar un buen aislamiento. Placa de Agar Sangre: incubar en CO2, 35 º C. Sólo en Biopsia rectal. Placa de Campylobacter: incubar en atmósfera con 10 % de C02 y 10 % de O2, 42 º C.24-48 h. Resto de placas: 35 º C en aerobiosis. Medios líquidos: Incubar en aerobiosis 6 horas a 35 º C, Dar pase al medio de Hektoen, pasado este tiempo, e incubar en aerobiosis a 35 º C. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 4 de 11
4. Inoculación. 4.1. Examen rutinario. Medios de cultivo. El coprocultivo se realiza mediante la preparación de una emulsión de 1-2 gr. de heces en solución salina fisiológica, a partir de la cual se inoculan los medios de cultivo. 4.1.1. Placa de Agar MacConkey. En caso de disbacteriosis se informará el tipo de microorganismo. No es recomendable la realización del antibiograma. Sugerir al clínico el uso excesivo de antibióticos. Medio para diferenciar los bacilos entéricos fermentadores de la lactosa (L+) de los no fermentadores (L-), al tiempo que se inhibe el crecimiento de flora Gram positiva aerobia. En el caso de la Biopsia intestinal se añade a la rutina una agar sangre para investigar S. Aureus y una tinción de Gram para estudiar la calidad de la muestra. 4.1.2. Medios entéricos. a) Moderadamente selectivos: Usar al menos uno de estos medios para inhibir el crecimiento de la mayoría de las Enterobacteriaceae mientras se permite el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp. Medio Hektoen Agar (Lactosa, Tiosulfato, Citrato férricoamónico, Sales Biliares) Medio XLD Agar (Xilosa. Lisina, Desoxicolato) b) Medio líquido: Utilizar el medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubación. Se resiembra en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio líquido es fundamental para el estudio de portadores asintomáticos. Caldo Selenito. (Enriquecimiento Salmonella spp). 4.1.3. Medios para Campylobacter spp. Seleccionar uno de los siguientes medios selectivos e incubarlo 48-72 horas a 42ºC en ambiente microaerófilo. No se recomienda enriquecimiento. Poner un disco de Cefoxitina de 30 mcg. Campy-BAP (medio de Blaser) 4.1.4. Medios para Yersinia spp. Mac-Conkey Medio de CIN Agar (Cefsulodina, Irgasan, Novobiocina) 4.1.5. Detección de Helicobacter y Toxina Shiga. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 5 de 11
Helicobacter MATERIAL Atemperar las heces frescas o descongeladas. Tubo de dilución de muestra y tarjeta de reacción, que se sacan 10 minutos antes de la reacción. PROCEDIMIENTO Tomar una pequeña cantidad de heces con el tubo de dilución. Agitar el tubo varias veces. Abrir el sobre de la tarjeta de reacción. Romper la punta del tubo de dilución y depositar 4 gotas en la primera zona de la tarjeta. Esperar 10 minutos e interpretar los resultados. Volver a leer a los 20 minutos y confirmar si ahora es positivo. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Siempre debe aparecer la línea Roja de control. Si además aparece la línea roja del test se informa. Toxina Shiga 1. En un tubo Eppendorf, añadir: a. 750µl de diluyente (tapón negro) b. 1 gota del conjugado (tapón rojo) c. 25µl de la muestra 2. Mezclar exhaustivamente hasta homogeneizar la mezcla. 3. Transferir 500µl en el pocillo nº 2. 4. Esperar 15 minutos. 5. Adicionar 300µl del wash buffer en el pocillo central y esperar que se absorba completamente. 6. Añadir 2 gotas de substrato (tapón blanco) 7. Esperar 10 minutos para leer los resultados. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 6 de 11
Toxina Shiga1 (+) Toxina Shiga1 (+) Toxina Shiga1(-) Toxina Shiga1(-) Toxina Shiga2 (+) Toxina Shiga2 (-) Toxina Shiga2(+) Toxina Shiga2(-) EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 7 de 11
4.2. Cultivos especiales. 4.2.1. Vibrio spp. Sólo en los meses de verano. Medios de enriquecimiento: agua de peptona alcalina a partir de las 6 horas, subcultivar en TCBS. Medio selectivo: TCBS Agar. (Tiosulfato, Citrato férrico, Bilis, Sacarosa). 4.2.2. Salmonella spp. y Shigella spp. Medio XLD Agar (Xilosa, Lisina, Deoxicolato) Medio Hektoen Agar (Lactosa, Tiosulfato, amónico, Sales biliares). Citrato férrico- Investigación de portadores de Salmonella: sólo se investiga en medio de enriquecimiento, realizando la siembra en caldo selenito y tras pase a las 6 horas a Hektoen y XLD, se investigarán las colonias típicas. 4.2.3. Escherichia coli. Los procedimientos de aislamiento en heces de E. Coli, habitualmente quedan fuera de la práctica rutinaria de la mayoría de los laboratorios. De las colonias no fermentadoras del medio Mac-Conkey Sorbitol, pasar a Agar Sangre. Realizar una suspensión en 1 ml de solución salina de tal manera que tenga una fuerte concentración bacteriana, ha de quedar lechosa, y aglutinar con antisuero específico. Empleamos una reacción de coaglutinación en látex con controles de suspensión positivos y negativos así como control negativo de látex Constituye una excepción la Escherichia coli 0157H7 por las posibles complicaciones (síndrome hemolítico urémico), por lo que para esta cepa, por su gravedad, podría estar indicado la utilización de medios especiales para su detección o la investigación de toxinas fundamentalmente en heces hemorrágicas. 4.2.4. Aeromonas mesofilas. Entre los medios utilizados para su detección está el medio de CIN-II (con sólo 4 μg/ml de Cefsulodina). La temperatura de incubación debe ser de 25-30º C. 5. Interpretación 5.1. Coprocultivo de rutina Las placas se leen a las 18 horas. En caso de negatividad se reincuba la placa de Campylobacter y los pases de Selenito y Peptona. La identificación presuntiva de enteropatógenos se realiza sobre las colonias desarrolladas con las siguientes características: a) Salmonella spp: se desarrollan en Medio de Hk y XLD como colonias negras o con punto negro central rodeada de halo blanco. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 8 de 11
b) Shigella spp: se desarrollan en medio XLD y Hk, como colonias crema, claras, sin punto negro. c) Yersinia enterocolitica: se desarrolla en medio de CIN como colonia roja, pequeña. En Mac Conkey se asemeja a Enterococcus faecalis. d) Campylobacter spp: se desarrolla en el medio Blaser como colonia cremosa, pequeña, a menudo confluente, que presenta una reacción de oxidasa positiva fuerte y que al Gram con Fucsina aparece como bacilos pequeños Gram negativos. e) Escherichia coli O157: aparece en el medio de Sorbitol como no fermentadora, colonia grisácea, no roja, o de color claro. Estas colonias han de aglutinar al anticuerpo especifico. f) Vibrio spp.: Aparecen en medio TCBS como colonias amarillas, mucosas, dando una reacción de oxidasa fuertemente positiva. g) Aeromonas spp: En TCBS aparecen como colonias planas amarillentas. En Mc. Conkey se asemejan a un E. Coli no fermentador. Dan una reacción de oxidasa positiva clara. 5.2. Identificación a) Identificación presuntiva de enterobacterias y definitiva de Campylobacter: MALDI-TOFF b) Identificación definitiva de enterobacterias: Micro-Scan que nos permite obtener la identificación y antibiograma. Ciprofloxacino se ensaya con E-test. c) Identificación serológica: las Salmonella spp. y Shigella spp, se han de serotipar. Para ello, realizar una suspensión densa a partir de un cultivo en Agar Sangre y aglutinar con sueros específicos somáticos. Sueros de Salmonella spp.: Polivalente, A, B, C, D. Shigella: Grupo A, B, C EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 9 de 11
6. Resultados. 6.1. Cultivos negativos. Se informará: No desarrollo de bacterias enteropatógenas en coprocultivo de rutina. 6.2. Cultivos positivos. 6.2.1. Resultados positivos. Se informará del aislamiento del agente patógeno (salmonela, shigela, yersinia, aeromona, aquí con la observación 002) y se emitirá inicialmente el antibiograma realizado para Ampicilia, Cefotaxima, Trimetoprim- Sulfametoxazol y Ciptofloxacino (mediante el panel NC53 de microscan, y E- test de ciprofloxacino para Salmonela). Las salmonelas se aglutinan. En los aislados de Campylobcater se adelantan los resultados y se hace E-test en MH sangre a 42ºC 24 horas de Eritro y Cripo. Se puede ampliar a Tetra, Imipenem, Amoxicilina-Clavulánico y Tigeciclina. Para estos tres últimos no hay puntos de corte. 6.2.2. Disbacteriosis. Se informa escaso desarrollo bacteriano (observación EDB) en caso de no existir crecimiento en la placa de Agar Mc Conkey 6.3. Detección de antígenos de Helicobacter y Toxina Shiga Se informará como resultado positivo o negativo. EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 10 de 11
CONTROL DE EDICIONES Nº Edic/Fecha Descripción de modificaciones Nº 01/ 01/11/2014 Creación EDICIÓN: 07 FECHA DE APROBACIÓN:01/11/2014 Página 11 de 11