Alteraciones Combinadas de la Hemostasia. Soledad Barrionuevo Romina Volcovich Hospital de Pediatría JP Garrahan Año 2009

Alteraciones Combinadas de la Hemostasia Soledad Barrionuevo Romina Volcovich Hospital de Pediatría JP Garrahan Año 2009

Introducción

Inhibidores adquiridos de la coagulación Sustancias endógenas que afectan una o varias etapas de la cascada de coagulación, prolongando in vitro las pruebas correspondientes. Inhiben específicamente algún factor Interfieren en uno o varios pasos de la cascada Neutralizantes [sitio activo inh f(x)] INHIBIDORES ESPECÍFICOS ANTICUERPOS ANTI-FACTOR NO neutralizantes INHIBIDORES NO ESPECÍFICOS o DE INTERFERENCIA Ac anti FosfoLípidos Paraproteínas PDF/pdf Heparina/Heparinoides

Anticuerpos Anti-Fosfolípidos Qué son? Los Ac anti-fosfolípidos (afl) son una familia de auto y aloac de amplio rango de especificidades y de afinidades, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. Cuáles son? Ac afl Grupo a) acardiolipina (CL) a[cl-β2gpι] aβ2gpι, aιι, aanexina V, Proteína C Grupo b) Anticoagulantes Lúpicos (AL)

Anticuerpos Anti-Fosfolípidos Cómo se detectan? Los del Grupo a) se estudian mediante inmunoensayos. En cambio los del Grupo b) son detectados por prolongación, in vitro, de los tiempos de coagulación dependientes de FLs. En qué circunstancias aparecen? Síndrome Anti-Fosfolipídico Enfermedades Autoinmunes ej: LES (1/3 pacientes) Afecciones Malignas Enfermedades Infecciosas (transitoriamente) Drogas Individuos Jóvenes SANOS Ancianos 2-10% AL (raramente juntos) 5-19% acl

Anticoagulante Lúpico Definido en 1983 como un anticoagulante que prolonga el tiempo de cefalina activada y a veces el Tiempo de Quick de un plasma, pero que no inactiva de modo específico ninguno de los factores de coagulación conocidos. Pertenece al heterogéneo grupo de los Ac afls, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. In vitro es detectado porque prolonga las pruebas de coagulación dependientes de FLs.

Anticoagulante Lúpico Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Levine JS et al., 2002 NEJM

Anticoagulante Lúpico Definido en 1983 como un anticoagulante que prolonga el tiempo de cefalina activada y a veces el Tiempo de Quick de un plasma, pero que no inactiva de modo específico ninguno de los factores de coagulación conocidos. Pertenece al heterogéneo grupo de los Ac afls, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. In vitro es detectado porque prolonga las pruebas de coagulación dependientes de FLs. In vivo, su presencia se asocia con elevado riesgo de trombosis venosa o arterial (1963, Bowie et al) y con morbilidad fetal (1980, Zapato y Boffa).

Patogénesis de la TROMBOSIS asociada a Acs afl Teorías: 1)Activación de células endoteliales 2)Injuria oxidativa del endotelio vascular 3)Potenciación de la activación plaquetaria 4)Modulación o interferencia con las f(x) regulatorias de la coagulación de Proteínas Unidoras de FL ej: β2gpι II, Proteína C, anexina V, Ft. Levine JS et al., 2002 NEJM

Anticoagulante Lúpico Su presencia NO siempre es patológica. El AL puede ser encontrado: como hallazgo de laboratorio en individuos asintomáticos en pacientes con clínica de trombosis o pérdidas fetales raras veces en pacientes con manifestaciones hemorrágicas SAF

Síndrome Anti-Fosfolipídico Criterios para llegar a su Diagnóstico (Consenso Sapporo revisado en 2006 -Miyakis et al, 2006, J Thromb Haemost - ): En 2 o más ocasiones separadas x >12 sem Conte A. et al., 2008, Acta Bioquím Clín Latinoam

Caso Clínico

Paciente femenino de 11 años. Sin antecedentes de importancia, comienza con dolor abdominal y macrohematuria a fines de agosto de 2008 y consulta al Htal. Vicente López: se detecta leucocituria y hematuria con urocultivo negativo, por persistencia del cuadro se trata con antibiótico. Se suman vómitos y decaimiento: se procede a la internación por deshidratación 2º a vómitos. La paciente presenta además epistaxis. Se solicita laboratorio inicial. TP: 22 % aptt: 124 seg AST: 475 UI/L ALT: 655 UI/L Se realiza transfusión con plasma, se coloca una dosis de vit K y con diagnóstico de Insuficiencia Hepática se deriva al Htal. Garrahan.

07-09 09-2008: 1º 1 Consulta Htal. Garrahan Examen físico: Regular estado general-afebril-asténica-adinámica Pálida-no ictérica Abdomen depresible sin hepatomegalia Hematomas en sitios de punción Laboratorio inicial (08-09-2008): Hb: 11.4 g/dl Leucocitos: 6170 /mm3 (Fla. Normal) Hto: 35.2 % Plaquetas: 296 000 /mm3 TP: 50% Urea: 14 mg/dl aptt: 83 seg Creatinina: 0.49 mg/dl AST: 272 UI/L FAL: 719 UI/L Suero anictérico ALT: 486 UI/L GGT: 49 UI/L Orina Completa: 0-1 leucocito/cpo 25-30 hematíes/cpo

Interconsultas HEPATOLOGÍA Insuficiencia hepática de etiología desconocida + HEMATOLOGÍA Alteración de la coagulación Hepatitis infecciosa? Hepatitis autoinmune? Enfermedad de Wilson? Ecografía abdominal Ceruloplasmina/Cupruria/cupremia HAV HBV HCV EBV CMV ANA ASMA anti-actina anti-lkm Laboratorio de Hemostasia 09-09-2008 TP: 44 % aptt: 90 seg Plaquetas: 297 000 /mm3 Fibrinógeno: 415 mg/dl Factor V: 82% (VR: 70-120%) Hepatopatía? Se indica vit K y comienza estudio de la coagulopatía

16-09-2008 Laboratorio de Hemostasia Estudio de TP y aptt prolongados TP: 44 % VR: 70-120% aptt: 88 seg VR: 31-43 seg TT: 25 seg Normal: 23 seg Plaquetas: 266 000 /mm3 Estudio de Mezclas evaluar la corrección del plasma del paciente con plasma normal en proporción 1:1 P N P + N Interpretación CORRIGE NO CORRIGE Paciente Pool Mezcla Criterio de corrección TP: valor teórico de mezcla aptt: Índice de Rosner

Estudio de Mezclas P TP 44 % P + N N 75 % 107 % N+P 2 = 75 % TP CORRIGE aptt 88 seg 180 seg 37 seg Indice de Rosner (P+N) - N = X 100 = 162 % P > 10% aptt NO CORRIGE Efecto COFACTOR

Hasta ahora TP bajo CORRIGE aptt prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Con TT normal se descarta presencia de heparina Inh. Específico Neutralizante? Anticoagulante Lúpico? DOSAJE DE FACTORES DETECCIÓN DE ANTICOAGULANTE LÚPICO

Laboratorio de Hemostasia Algoritmo consenso para detección n de Anticoagulante Lúpico 1º SCREENING Realizar 2 pruebas dptes de PL y que alguna sea prolongada. Recomendadas: DRVVT y aptt sensible 2º CORRECCIÓN Verificar ausencia de corrección de las mismas pruebas con plasma normal. Pool de plasmas normales: in-house, 100% actividad, -70ºC 3º CONFIRMACIÓN Demostrar acortamiento de las mismas pruebas por neutralización con PL. Fosfolípidos hexagonales: más reproducibles que lisados de plaq. DETECTAR OTRAS COAGULOPATÍAS Frente a tests confirmatorios negativos o cuando hay sospecha de otra alteración además de la presencia de anticoagulante lúpico. Pengo et al., 2009 Thromb Haemost

Laboratorio de Hemostasia Algoritmo para detección n de Anticoagulante Lúpico SCREENING 1) DRVVT: 75 seg 2) PTT-LA: 83 seg 2 pruebas positivas CORRECCIÓN aptt DRVVT P 83 seg 75 seg P + N N 116 seg 39 seg 109 seg 31 seg las mismas pruebas NO CORRIGEN CONFIRMACIÓN Prueba de Neutralización con Plaquetas (PNP) Criterio de positividad: INDICE DE CORRECCIÓN = P/N basal P/N con plaquetas P/N basal X 100 > 10%

Laboratorio de Hemostasia Algoritmo para detección n de Anticoagulante Lúpico CONFIRMACIÓN Prueba de Neutralización con Plaquetas (PNP) Criterio de positividad: INDICE DE CORRECCIÓN = P/N basal P/N con plaquetas P/N basal X 100 > 10% basal + plaq aptt pool aptt pac DRVVT pool DRVVT pac 39 seg 83 seg 33 seg 75 seg 40 seg 60 seg 32 seg 50 seg IC = 29.5 IC = 32.0 las mismas pruebas se acortan con PL Los resultados anteriores son compatibles con la PRESENCIA DE ANTICOAGULANTE LÚPICOL

TP bajo CORRIGE aptt prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Con TT normal se descarta presencia de heparina Inh. Específico Neutralizante? Presencia de Anticoagulante Lúpico DOSAJE DE FACTORES

Laboratorio de Hemostasia Dosaje de factores Vía Intrínseca XII 1% XI 1% IX < 1% VIII < 1 % VR: 50-150 % Vía Extrínseca II 9 % V 69 % VII 77 % X 53% VR: 70-120 % Interferencia por AL! Alternativas: M. Cromogénicos M. Inmunológicos en relación al resto + clínica de sangrado + TP bajo que CORRIGE DÉFICIT DE FACTOR II?

Laboratorio de Hemostasia Dosaje de Factor II (protrombina( protrombina) Método Factor II (%) Coagulométrico 9 Cromogénico 7 Inmunológico 8 Existe baja actividad de protrombina por baja cantidad de factor circulante HIPOPROTROMBINEMIA CONFIRMADA

11 años clínica de sangrado sin antecedentes ANTICOAGULANTE LÚPICO HIPOPROTROMBINEMIA Fuerte sospecha de SÍNDROME DE ANTICOAGULANTE LÚPICO - HIPOPROTROMBINEMIA (LA-HPS)

Síndrome de Anticoagulante Lúpico - Hipoprotrombinemia (LA-HPS) Descripto por 1º vez en 1960 por Rapaport et al en una niña de 11 años con LES y sangrado severo. Es una enfermedad poco frecuente, más común en pediatría y en mujeres. Puede presentarse: como 1º manifestación o complicación de una patología autoinmune, asociado a infecciones virales transitorias y aún en individuos sanos. Mientras que el AL se asocia a elevado riesgo de trombosis, paradójicamente los pacientes con LA-HPS presentan riesgo de hemorragia severa cuando el déficit de II es marcado.

Cuál es el mecanismo de hipoii en el LA-HPS? Bajaj et al demostraron en 1983 que el plasma de pacientes con AL y severa hipoprotrombinemia contiene ANTICUERPOS ANTI-PROTROMBINA NO NEUTRALIZANTES se unen a la protrombina pero NO INHIBEN su conversión a trombina Postularon y aportaron evidencia de que estos anticuerpos actúan formando complejos Ag-Ac que son rápidamente depurados por el sistema monocítico macrofágico generando una disminución de factor II circulante (déficit adquirido). TRATAMIENTO: glucocorticoides para reducir el clearence Ag-Ac.

Cómo se demuestra la presencia de anticuerpos no neutralizantes? ELISA in house p-nitro-fenil-fosfato (450nm) anti IgG/M humana-fal SUERO Se informa como Relación de Positividad (RP) respecto al cutt-off Cutt-off = percentilo 99 de 50 sueros normales Controles positivo y negativo (no hay calibrador) Resultados del paciente: RP IgG = 27 POSITIVO RP IgM = 1 PROTROMBINA purif. comercial

11 años clínica de sangrado sin antecedentes ANTICOAGULANTE LÚPICO HIPOPROTROMBINEMIA Acs. ANTI-PROTROMBINA NO NEUTRALIZANTES Diagnóstico de SÍNDROME DE ANTICOAGULANTE LÚPICO - HIPOPROTROMBINEMIA (LA-HPS) Prednisona VO por riesgo de sangrado SOSPECHA DE PATOLOGÍA AUTOIMNUNE

REUMATOLOGÍA Evaluaron los siguientes resultados: 30-09-2008 Lab. Hematología: Hb: 11.3 g/dl Leucocitos: 3200 /mm3 Hto: 34.4 % Eritrosedimentación: > 120 mm/hora Lab. Hemostasia y Trombosis: TP: 54% Presencia de anticoagulante lúpico aptt: 79 seg Acs. anti-β2gpi: positivo Plaquetas: 271000/mm3 Acs. anti-cardiolipina: positivo Lab. Serología: Lab. Inmunología Humoral: VDRL: positivo Acs. anti-nucleares: positivo (+++) (interferencia) título: 1: 500 patrón moteado grueso Lab. Hemoterapia: Acs. anti-músculo liso: positivo Coombs directa: positivo Acs. anti-actina: negativo Acs. anti-lkm: negativo Proteinograma sérico: Acs. anti-dna: negativo Alb 4.47 C3: 38 mg/dl (98-150mg/dL) α1 0.20 C4: 3 mg/dl (15-30mg/d) α2 0.83 β 0.51 zona β2 γ 1.89 PT 7.9 Sospecha de LES Control: Hematología y Reumatología

EVOLUCIÓN Laboratorio 1º control post-tto 21-10-2008 Hb: 13.1 g/dl Leucocitos: 7600 /mm3 (Fla. Normal) Hto: 39 % Plaquetas: 291 000 /mm3 TP: 88% Factor V: 132% A. Lúpico persitente aptt: 42 seg Factor II: 37% Acs. Anti-II IgG RP: 18 TT: 23 seg Fibrinógeno: 292mg/dL Urea: 50 mg/dl Creatinina: 0.48 mg/dl AST: 31 UI/L ALT: 43 UI/L GGT: 37 UI/L Acs. Anti-nucleares: positivo 1:1000 moteado grueso Acs. DNA: negativo C3: 52mg/dL (98-150mg/dL) C4: 15mg/dL (15-30mg/dL)

EVOLUCIÓN Enero 2009: Internación por fiebre y poliartralgias = Reactivación del LES Marzo 2009: Proteinuria significativa y punción bx. Renal = Glomerulonefritis Lúpica Proliferativa Mesangial Mayo de 2009: Dolor lumbar y aplastamiento vertebral = microfracturas por corticoterapia prolongada Actualmente: Tratamiento ambulatorio con prednisona, hidroxicloroquina y enalapril, bajo control por los servicios de Hematología, Reumatología, Nefrología y Patología Espinal. El LA-HPS fue una manifestación precoz del LES.

Discusión

Síndrome de AL-HipoProtrombinemia Se han encontrado pacientes con AL y Ac anti-ii Positivos que NO manifiestan una hipo-protrombinemia severa éstos serían Ac de Baja Afinidad (Fleck et al, 1988). El tratamiento estaría indicado en pacientes con hipoprotrombinemia severa * que presenten manifestaciones hemorrágicas, y * en aquellos pacientes asintomáticos que deban ser sometidos a cirugía (ejemplo: Chung et al, 2008). El seguimiento cercano de los pacientes con LA-HPS es crucial, porque aunque tengan tendencia al sangrado, podrían desarrollar trombosis asociadas a la presencia del AL circulante (Chung et al, 2008).

Síndrome de AL-HipoProtrombinemia Una hipo-protrombinemia severa en un paciente con LA-HPS puede comprometer la Sensibilidad de algunas pruebas confirmatorias de AL El ensayo Staclot-LA (Stago) sería, por su diseño, el menos afectado (Baca et al, 2002) Tubo 1 Tubo 2 Plasma Paciente X X Buffer FL hexagonales Staclot-LA (Stago) X X Mezclar e incubar a 37 C Plasma Humano Normal X X Mezclar e incubar a 37 C Cefalina Activada X X Mezclar e incubar a 37 C Ca2+ y Largar cronómetro X X

Conclusiones

Anticoagulante Lúpico El denominado AL es un conjunto heterogéneo de Ac dirigidos contra proteínas con afinidad por FL aniónicos, que interfieren in vitro con las reacciones de coagulación dependientes de FLs, prolongando las pruebas de APTT, KCT, dpt, drvvt (sensibles por emplear baja CC de FLs). In vivo, el AL puede ser un hallazgo de laboratorio, y raras veces ser encontrado en pacientes con manifestaciones hemorrágicas (siempre asociado a trombocitopenia o hipoprotrombinemia severa concomitante). Sin embargo su presencia persistente se asocia con un aumento del riesgo trombótico, y se lo encuentra con mayor frecuencia en pacientes con trombosis venosa o arterial, o mujeres con complicaciones obstétricas o partos prematuros. Por lo tanto, su persistencia debe ser controlada 12 semanas después de su primera detección, realizando paralelamente la búsqueda de Ac antifl (acl y aβ2gpi) por métodos inmunológicos para identificar a los pacientes con elevado riesgo de trombosis.

Anticoagulante Lúpico El AL puede ser uno de los constituyentes de una alteración combinada de la hemostasia, de la cual pueden hacernos sospechar * una alteración simultánea de APTT y TP, * correcciones parciales en estudios de mezclas, y * que el paciente presente manifestaciones de sangrado.

Síndrome de AL-HipoProtrombinemia El LA-HPS es uno de los pocos cuadros clínicos en los que el AL es hallado persistentemente en pacientes con manifestaciones de sangrado, las cuales se deben a la presencia de Ac anti-protrombina No Neutralizantes que aumentan el Clearence del factor II provocando un estado de hipo-protrombinemia. En el caso clínico descripto, el LA-HPS fue la primera manifestación de una enfermedad autoinmune sistémica de la que inicialmente no había presunción clínica, y hacia la que orientaron los resultados del estudio de hemostasia. Aunque aún no se han reportado eventos trombóticos asociados a este síndrome, la presencia persistente del AL determina que estos pacientes estén en riesgo de desarrollarlos, por lo que es esencial seguirlos de cerca.

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Agradecimientos Lab. de Hemostasia y Trombosis Hospital Garrahan Dras. Mirta Hepner, Graciela Pieroni y Eliana Annetta Compañeras de Residencia y Becarios Bioquímicos y técnicos del hospital

MUCHAS GRACIAS!!!