Diagnóstico de Laboratorio de Malaria o Paludismo Dra. Mercedes Subirats S. Microbiología. H. Carlos III Dra. Rocío Martínez S. Microbiología. H. U. Puerta de Hierro-Majadahonda
Paludismo 4+1 tipos de Plasmodium que preferentemente afectan al Humano P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae +1: P. knowlesi (parásito del mono que aparece en zonas boscosas de Sudeste asiático)
Fiebre Paludismo = Malaria La principal enfermedad del viajero y del inmigrante procedente de países tropicales Toda fiebre en un paciente procedente del Trópico es PALUDISMO mientras no se demuestre lo contrario
URGENCIA! Paciente procedente de Guinea. Fiebre y sospecha de pielonefritis. Enviamos orina para cultivo Nuestra respuesta: 1. Vale, de acuerdo 2. Vale, pero enviadnos también una gota gruesa para descartar malaria La existencia de un proceso que justifique la fiebre NO EXCLUYE EL PALUDISMO
Diagnóstico parasitológico Diagnóstico directo: Muestra: sangre periférica Tinción de Giemsa o Field de la gota gruesa y extensión o frotis fino Visualización del parásito Identificación de la especie Cuantificación de la parasitemia Monitorización del tratamiento Técnicas de diagnóstico rápido: Inmunocromatografía Técnicas de biología molecular: PCR Diagnóstico indirecto: Serología
Recogida de la muestra Cuándo? Extracción durante el pico febril Cómo? Digitopunción Venopunción, tubo con EDTA (= Hemograma).
Gota gruesa: > sensibilidad Sangre con EDTA: Extenderla lo suficiente para poder ver a través de ella las manecillas del reloj. Sangre capilar: Extenderla durante 1 minuto para eliminar la fibrina. Dejar secar 30 antes de teñir. Extensión: diagnóstico de especie
Diagnóstico microscópico El gold standard es la Gota Gruesa. Ventajas Sensibilidad: detección 5-50 parásitos/µl (gota gruesa) Especificidad: eficaz al dar la especie y fase del ciclo (extensión) Información útil clínicamente: cuantificación de parasitemia, especie y fase del ciclo Control del tratamiento (ojo: gametocitos sólo) Barato Inconvenientes Entrenamiento y experiencia Buen microscopio y tinciones
TINCIÓN DE FIELD Solución A Solución B (se diluye a 1/5 para la extensión) A AGUA ph 7 2 B
Cómo distinguimos las distintas especies? Hematíe parasitado Tamaño Presencia de granulaciones Existencia de infecciones múltiples Características del trofozoito Tamaño, forma y número de parásitos Número de núcleos por anillo Características del esquizonte Tamaño y forma Número y disposición de los merozoitos Forma y distribución del pigmento palúdico Características de los gametocitos Tamaño y forma Forma y distribución del pigmento palúdico
Pv P. knowlesi
P. falciparum Aspecto de los hematíes: Tamaño normal Manchas de Maurer Infecciones múltiples frecuentes Infecta tanto los hematíes jóvenes como viejos. Parasitemia puede ser >>2% Trofozoitos: Anillos jóvenes pequeños, delicados 1/6 del diámetro del hematíe Frecuentemente con gránulos dobles de cromatina Algunos anillos en el borde del hematíe, forma accolé
P. falciparum Gametocitos: Alargados o en forma de media luna o banana Esquizontes: sólo en malaria cerebral 6-32 merozoitos (promedio 24) Estadios encontrados en sangre periférica: Anillos y/o gametocitos Los pre-esquizontes y esquizontes se desarrollan en los microcapilares No se observan en sangre periférica excepto en infecciones graves
Gota gruesa
Esquizontes de P falciparum secuestrados en la microcirculación cerebral
Paludismo grave: P falciparum con esquizontes
P. malariae Aspecto de los hematíes: Tamaño normal o disminuido Infecta a hematíes viejos. Parasitemia normalmente < 1% Raramente se observan puntos o manchas de Ziemann Trofozoitos: Redondeados, compactos con citoplasma denso, cromatina grande Formas características: Formas en ojo de pájaro Trofozoitos en banda o acintados
P. malariae Esquizontes: 6-12 merozoitos (promedio 8) Esquizontes en roseta con el pigmento palúdico en el centro Gametocitos: Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa todo el hematíe Estadios encontrados en sangre periférica: Todos los estadios Suelen observarse pocas formas en anillo o gametocitos
P. malariae
P. vivax Aspecto de los hematíes: Tamaño aumentado o normal Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos). Parasitemia normalmente <2% Punteado de Schüffner: Punteado fino, distribución uniforme en todo el hematíe Presente en todos los estadios excepto formas anulares iniciales Trofozoitos: Citoplasma irregular, anillo grueso ameboide, aspecto difuso, irregular
Basofilia punctata No hay parasito No confundir
P. vivax Esquizontes: 12-24 merozoitos (promedio 16). Ocupa casi todo el hematíe Gametocitos: Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el hematíe Estadios encontrados en sangre periférica: Todos los estadios Amplia gama de fases visibles en un frotis
P. vivax
P. ovale Aspecto de los hematíes: Tamaño aumentado Algunos hematíes infectados son ovales y/o desflecados Infecta hematíes jóvenes (reticulocitos). Parasitemia normalmente < 2% Punteado de Schüffner Trofozoitos: Redondeados, compactos, a veces ligeramente ameboides Los trofozoitos en desarrollo tienen una gran masa cromatínica
P. ovale Esquizontes: 6-14 merozoitos (promedio 8) rodeando al pigmento malárico Gametocitos: Redondo u ovalado. Casi ocupa todo el hematíe Estadios encontrados en sangre periférica: Todos los estadios se pueden ver. SINCRONIZACIÓN DE FASES: Todos son trofozoítos o son esquizontes o son gametocitos. Se desincronizan cuando 2% parasitemia
Pre-esquizonte de P ovale
P. knowlesi Aspecto de los hematíes: Tamaño normal o disminuido No son raras los eritrocitos poliparasitados Trofozoito: Anillos jóvenes pequeños, delicados 1 o 2 puntos grandes de cromatina Ocasionalmente, anillos en el borde del hematíe, forma accolé Trofozoito maduro: Redondeados, compactos con citoplasma denso y cromatina grande Ocasionalmente trofozoitos en banda o acintados
P. knowlesi Esquizontes: Hasta 16 merozoitos Esquizontes en roseta con el pigmento palúdico en el centro Gametocitos: Redondo u ovalado, compacto. Casi ocupa todo el hematíe Esquizontes Estadios encontrados en sangre periférica: Todos los estadios
P. knowlesi Trofozoito joven o anillo semejante al de P. falciparum P. knowlesi P. falciparum
P. knowlesi Trofozoito maduro, esquizonte y gametocitos semejantes a P. malariae P. knowlesi P. malariae
Trofozoitos P. falciparum P. malariae P. vivax P. ovale
Esquizontes P. falciparum P. malariae P. vivax P. ovale
Gametocitos P. falciparum P. malariae P. vivax P. ovale
Cálculo de la parasitemia Calcular el porcentaje de hematíes parasitados (en extensión fina): 1. Con el objetivo de inmersión, seleccionar un área de la extensión fina con una densidad aproximada de 100 hematíes/campo. 2. Contar 10 campos. 3. Dividir por 10 para calcular el porcentaje (%) de hematíes parasitados.
Inmunocromatografía Principio Antígenos de Paludismo detectados: Contiene anticuerpos monoclonales frente a antígenos especificos del Plasmodium Diferencian P falciparum del resto de las especies, algunas diferencian P. vivax, pero no pueden diferenciar entre las demás Enzimas metabólicas que se encuentran en todas las especies: 1. plactato deshidrogenasa (pldh) 2. Aldolasa Proteína Rica en Histidina 2 (HRP 2) se encuentra sólo en P falciparum
p-aldolasa y p-ldh Enzimas metabólicas parasitarias que intervienen en la glucolisis p-aldolasa Dihidroxiacetona-P Fructosa-1,6-diP + Gliceraldehido-3-P p-ldh Lactato Piruvato
Inmunocromatografía Ventajas: Fáciles de realizar Rápidas No precisan microscopio No precisan personal entrenado Útiles en el diagnóstico en gestantes debido al secuestro placentario de los parásitos (HRP-2) Desventajas: Falso N si parasitemia baja No miden la parasitemia Bien para P. falciparum. OJO: Cuidado con P.ovale y con los P. malariae que no los detecta bien. No distinguen todas especies Persisten(+) tras infección aguda y tras tratamiento Falso P con factor reumatoide Precio alto Evitar humedad (Tª 2-30ºC)
RESULTADOS pldh o Aldolasa HRP 2 Negativo Pl. no falciparum Pl. falciparum o infección mixta
Inmunocromatografía RDT (rapid test diagnosis)
PCR Ventajas: 5 parásitos / µl (0,0001%) Identificación de especie Mutaciones de resistencia S y E ~ 100% Inconvenientes: Precio Laboriosa Resultado en horas No distingue entre parásitos viables y no viables Infecciones mixtas, monitorizar respuesta al tratamiento y diagnóstico temprano de fallo terapéutico
Sensibilidad métodos diagnóstico malaria Gota gruesa: 5-100 parásitos/μl Extensión fina: 50-100 parásitos/μl Pruebas rápidas: 100 parásitos/μl PCR: 0,04-20 parásitos/μl
Resumiendo
Gracias