Novedades de la prueba de viabilidad por Tetrazolio en soja R.M. Craviotto*; M.R. Arango Perearnau; C. Gallo. Diciembre 2011 Laboratorio de Semillas EEA Oliveros INTA. Ruta 11 Km 353, Santa Fe, Argentina. Te: 03476-498010 rcraviotto@correo.inta.gov.ar; marango@correo.inta.gov.ar; cgallo@correo.inta.gov.ar Palabras clave: viabilidad, tetrazolio, calidad de semilla Introducción El cultivo de la soja ha sufrido, en los últimos años, una gran expansión a nivel mundial como consecuencia de las numerosas aplicaciones para la industria agroalimentaria y con una perspectiva de evolución creciente. Esto ha determinado que a los países tradicionalmente productores del cultivo como Estados Unidos, Brasil y Argentina se hayan ido agregando otros como consecuencia de presentar condiciones ecológicas adecuadas para la producción de soja. La exitosa implantación inicial del cultivo es altamente dependiente, como en el resto de los cultivos extensivos, de la calidad de la simiente utilizada en la siembra. Diferentes aspectos de la calidad entran en juego cuando la misma es analizada por las empresas productoras de semillas haciendo necesario el contar con un adecuado proceso de evaluación de calidad. Entre los factores de primerísima importancia se encuentra la viabilidad del lote de simiente de soja y su reconocimiento implica la utilización de metodologías específicas de laboratorio. Entre las metodologías existentes, para evaluar la viabilidad de un lote de semillas, la Prueba de Viabilidad por Tetrazolio es la que refleja este atributo primario de la calidad con mayor rapidez y es considerada la más apta a nivel mundial. No obstante ello, las Reglas Internacionales de Análisis de Semillas editadas por la Asociación Internacional de Análisis de Semillas (ISTA, 2010) no reflejan la real importancia de desarrollar la citada técnica para la especie en cuestión y emitir recomendaciones que permitan validar la metodología entre los laboratorios de análisis de semillas habilitados en Argentina. Este hecho no permite afianzar el empleo de la técnica, por lo que el comercio de semillas carece en la actualidad de una herramienta de excelente precisión en el momento de tomar decisiones comerciales. Por otra parte, las Hojas de Trabajo de la Prueba de Tetrazolio de ISTA (2003) describen de manera incompleta, toda la gama de posibilidades y bondades que posee la técnica para brindar un valor agregado a la descripción de las fallas de calidad que puede presentar el lote. En este sentido la concentración, el tiempo y la temperatura de incubación que se emplean en la prueba juegan un papel importante en la obtención de una imagen topográfica que permite determinar el estado fisiológico de los tejidos y estructuras de las semillas. Por otro lado, una combinación adecuada de las variables mencionadas permite realizar la prueba de una manera más rápida, económica y eficiente. En la actualidad diferentes investigaciones han determinado la existencia de distintas coloraciones en las semillas que presentan un correlato estrecho con las variadas condiciones fisiológicas de las semillas (França Neto et al., 1988; França Neto et al 1998; Craviotto et al., 1991; Craviotto et al., 1995; Craviotto et al., 2008). De la detallada y cuidadosa observación de las semillas teñidas que realiza el Página 1 de 6
analista entrenado en la técnica surge el resultado de la prueba que permite diagnosticar la calidad del lote. El objetivo del trabajo fue evaluar visualmente el grado de tinción y sus correspondientes matices de color alcanzado por las diferentes combinaciones de concentración de la sal de tetrazolio, tiempo y temperatura de incubación y determinar la metodología más apropiada para realizar la prueba en forma precisa y eficiente en la especie. Materiales y Métodos En el estudio se utilizó semillas de soja de un lote comercial de calidad intermedia, evaluada por la Prueba de Germinación Estándar que mostró un valor de 81% de Poder Germinativo. Esta prueba de germinación se llevo a cabo siguiendo la metodología recomendada por las Reglas Internacionales de Análisis de Semillas (ISTA, 2010). Se utilizaron como tratamientos: 3 concentraciones de la sal de 2,3,5 Cloruro de Trifenil Tetrazolio (Merck KGaA, Argentina S.A.) (0,1; 0,5 y 1%), 6 tiempos (1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas) y 2 temperaturas (30 ± 0,5ºC y 35 ± 0,5ºC) de incubación. Las soluciones de tetrazolio empleadas se prepararon de acuerdo a las recomendaciones para la Prueba Bioquímica de Viabilidad por Tetrazolio descriptas en las Reglas Internacionales de Análisis de Semillas (ISTA, 2010). Las semillas se preacondicionaron en rollos de papel toalla (Scott Brand, Kimberly Clark, 29,67 gramos.m -2 ) húmedo durante toda la noche (18 hs.) a 20 ºC seguido de un periodo adicional de inmersión completa en agua de las semillas de media hora, con la finalidad de completar la imbibición y que todas las semillas alcancen su máxima hidratación. Las semillas completamente hidratadas se colocaron en recipientes de vidrio con tapa y se cubrieron con suficiente volumen de cada una de las soluciones de tetrazolio preparadas a las concentraciones ensayadas (0,1; 0,5 y 1 %). La incubación de las muestras se realizó en oscuridad y en un Baño Termostático (Viking, Modelo Masson, B.A., Argentina) a las temperaturas de (30 ± 0,5 ºC y 35 ± 0,5 ºC) durante 1 a 6 horas respectivamente. Transcurridos los correspondientes períodos de incubación, los recipientes conteniendo las semillas en su interior, se retiraron del Baño Termostático, se eliminó la solución de cada recipiente y posteriormente las semillas se lavaron cuidadosamente con abundante agua corriente. Las semillas teñidas se colocaron en cajas de Petri de vidrio de 9 cm de diámetro, sumergidas en agua, con la correspondiente identificación de cada tratamiento y se realizó la observación visual de los colores obtenidos en la Prueba de Viabilidad. La Prueba Topográfica por Tetrazolio se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenadas, que participan en las reacciones de respiración de las células vivas. Estas enzimas están presentes en los tejidos vivos de las semillas y reducen la solución incolora que contiene la sal de tetrazolio a un compuesto insoluble denominado Formazan de color rojo/rosado (Glenner, 1990). Los colores obtenidos típicamente en esta prueba corresponden al rojo indicativo de tejidos vivos y al blanco indicativo de tejidos muertos (ISTA, 2010). Para realizar las observaciones de colores obtenidos en los distintos tratamientos se utilizaron los patrones de color descriptos por Craviotto et al., 2008. Página 2 de 6
Resultados y Conclusiones Los colores que se presentaron sobre los tejidos de las semillas fueron indicativos de su distinta condición fisiológica y pudieron ser descriptos de la siguiente manera: 1- Color Blanco brillante que caracterizó a los tejidos sanos y turgentes, correspondiendo a semillas muy vigorosas. Este color es un indicador de una excelente hermeticidad de la semilla, denotando además una óptima capacidad de permeabilidad selectiva de las células de los tejidos seminales. 2- Color Rosado pálido que también correspondió a tejidos fisiológicamente sanos y vigorosos. Este color es un indicador de muy buena hermeticidad y permeabilidad selectiva. En este caso la solución de tetrazolio logró penetrar la membrana celular de los tejidos de una manera lenta y uniforme. 3- Color Rojo intenso fue indicador de tejidos en proceso de deterioro. La aparición de este color puso de manifiesto una menor hermeticidad de la semilla y una rápida penetración de la solución de tetrazolio que es descompuesta a formazan por la intensa actividad respiratoria propia de los tejidos lesionados o fisiológicamente envejecidos. 4- Color Blanco mate fue indicador de tejidos muertos. Este color surgió como consecuencia de la falta completa de actividad respiratoria de estos tejidos. Las semillas que presentaron este color mostraron además una falta total o parcial de turgencia en los tejidos. 5- Color Verde fue indicador de tejido inmaduro. La presencia de este color aparece asociada a la permanencia de pigmentos clorofílicos en los tejidos, como consecuencia de un desbalance fisiológico de la planta originado por un estrés biótico o abiótico. La inmadurez de los tejidos impide la metabolización del tetrazolio a formazan. La constatación del estado de turgencia del tejido necesita que el analista entrenado realice cortes con instrumental apropiado sobre las diferentes estructuras de la semilla, con el objeto de percibir la textura y consistencia propia de cada tejido (Craviotto et al., 2008). Las comparaciones entre tratamientos tuvieron por objeto discernir la similitud de las distintas concentraciones, tiempos y temperaturas de incubación con el fin de distinguir nítidamente los colores descriptos precedentemente. En este sentido fue necesaria la observación conjunta y simultánea de todos los tratamientos para poder identificar claramente el o los tratamientos más semejantes en términos de coloración (Fig. 1). Fig 1: Vista panorámica de todos los tratamientos estudiados en forma simultánea. Página 3 de 6
La utilización de un tiempo de incubación de 1 hora, si bien permite acelerar la obtención de resultados no produjo una coloración satisfactoria que permita identificar los matices de color rojo y rosado. Este hecho fue válido para todas las concentraciones y temperaturas estudiadas. Se observó que para un mismo tiempo de incubación, la mayor temperatura de 35º C utilizada determinó un mayor grado de tinción de los tejidos respecto a la temperatura de 30º C. De igual manera los aumentos en los tiempos de incubación para una misma concentración y temperatura produjeron un incremento en la intensidad de la coloración. Cuando se utilizó un tiempo de incubación de 2 horas la concentración de tetrazolio de 1 % produjo resultados satisfactorios a la temperatura de 30º C. En este tratamiento fue posible la identificación de los diferentes matices de color que corresponden a las distintas calidades fisiológicas. Este caso difiere claramente de lo propuesto en las Hojas de Trabajo de ISTA (2003) para la especie soja, puesto que si bien se coincide con la concentración y la temperatura, no así con el tiempo de 6 hs de incubación recomendado para la prueba. De tal manera, que para el tratamiento de 1%, 30 ºC y 6hs, no fue posible distinguir matices diferentes de coloración al teñirse todos los tejidos vivos de la semilla de color rojo intenso. La concentración de la solución de tetrazolio al 1% determinó que a partir de 4 horas de incubación a 30 ºC y a 35 ºC no se visualizaran diferencias de coloración, siendo esta de un color rojo intenso tanto en tejidos vigorosos como en los deteriorados. Para la concentración de la solución de tetrazolio al 0,5 %, 30 ºC 3 horas se obtuvo un resultado satisfactorio en cuanto a la oportunidad de discernir diferentes matices indicativos de estados fisiológicos particulares de las semillas. El tratamiento que conjuga la menor concentración de tetrazolio (0,1%) y la menor temperatura (30º C) arrojó resultados satisfactorios a las 4 hs de incubación, permitiendo una visualización óptima de los matices de color. Por otra parte, las semillas del tratamiento que incluyó una concentración de la solución de tetrazolio al 0,1%, 35 ºC y 3 hs de incubación, manifestaron los patrones de coloración descriptos para los distintos estados fisiológicos. El estudio permitió establecer la existencia de cuatro tratamientos con idénticas posibilidades de ejecución de la prueba para la obtención de resultados satisfactorios (Tabla 1). Tabla 1: Detalle de los tratamientos seleccionados Concentración de tetrazolio en % Temperatura de incubación en ºC 0,1 35 3 0,1 30 4 0,5 30 3 1 30 2 Tiempo de incubación en horas La elección del tratamiento mas conveniente para la prueba buscó la combinación más efectiva en términos de tiempo de duración de la prueba dentro de un laboratorio de análisis de semillas, como así también salvaguardar la necesidad de preservar la salud ambiental en términos de disminución de producción de desechos tóxicos y la reducción de los costos de la droga utilizada en el análisis (Fig. 2). En tal sentido la utilización del tratamiento al 0,1%, 35 ºC y 3 horas, fue considerada como la más oportuna ya que se utiliza la menor concentración de tetrazolio y el menor tiempo (Fig. 3). Al mismo tiempo, se hizo clara la necesidad de aprovechar al máximo las potencialidades de la Prueba de Viabilidad por Tetrazolio desde el momento en que las concentraciones, temperaturas y tiempos Página 4 de 6
seleccionados permitieron además inequívocamente distinguir condiciones fisiológicas que quedan ocultas al emplear la metodología propuesta por ISTA para la especie. El empleo de este método permitiría por otra parte, la utilización de la prueba para inferir la condición de vigor del lote mediante el establecimiento de patrones de clase de las distintas semillas con disímiles situaciones de intensidades de coloración, aunados a los diferentes tipos de daños presentes. Fig. 2: Semillas soja teñidas luego de la Prueba de Tetrazolio utilizando distintos tratamientos: a) 0,1% - 30 ºC - 4 hs; b) 0,5 % - 30 ºC - 3 hs y c) 1% - 30 ºC - 2hs Página 5 de 6
Fig. 3: Semillas soja teñidas luego de la Prueba de Tetrazolio utilizando una concentración de 0,1 % de solución de tetrazolio, 35 ºC y 3 horas de incubación. Bibliografía CRAVIOTTO, R.M.; VARELA, H.G.; FRANCONI, C.R.. 1991. Prueba de Tetrazolio. Manual de Evaluación para Semilla de Soja. Publicación Miscelánea Laboratorio de Semillas EEA Oliveros. 32 pp. CRAVIOTTO, R.M.; FARED, M.; MONTERO,M.S. 1995. Prueba de Tetrazolio. Patrones para la especie soja. Publicación Miscelánea Laboratorio de Semillas EEA Oliveros. Centro Regional Santa Fe. ISSN 0327-3377. 35 pp. CRAVIOTTO, R.M.; ARANGO PEREARNAU, M.R.; GALLO, C. 2008. Prueba Topográfica por Tetrazolio en soja. Suplemento Especial. Análisis de Semillas. ISSN. 1851-9615. Año 2008. Nº 1. 96 pp FRANÇA NETO, J.; PEREIRA, L.A.G; PEREIRA DA COSTA, N; KRYZANOWSKI, F.C.; HENNING,A.A. 1988. Metodologia do Teste de Tetrazólio em sementes de soja. EMBRAPA- CNPSo. Documentos, 32. 60pp FRANÇA NETO, J.; KRYZANOWSKI, F.C.; PEREIRA DA COSTA, N. 1998. El Test de Tetrazolio en Semillas de Soja. EMBRAPA- CNPSo. Documentos, 117. 72 pp GLENNER, G.G. 1990. Formazans and Tetrazolium Salts. In: Biological Stains. Edited by R.D. Lillie, M.D. Sigma Chemical Company. ISBN 0-941633-29-2 p.225-235. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. 2010. Internacional Rules for Seed Testing. P.O. Box. 308,8303 Basserdorf, CH-Switzerland. 300 pp INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. 2003. ISTA Working Sheets on Tetrazolium Testing Vol. I. Agricultural, Vegetable & Horticultural Species. Edited by Leist, N; Kramer, S; Jonitz, A. Basserdorf, CH-Switzerland. 200 pp. Página 6 de 6