Código del Proyecto: 2-01-05-03-024 Centro de referencia: CENTRO NACIONAL DE SALUD PÚBLICA TÍTULO: Validación del PCR-basado en generador universal de heteroduplex para la identificación de Mycobacterium tuberculosis resistente a rifampicina y multidrogoresistente en Lima, Perú Autores Roger Calderon 1, L. Asencios 2, N. Quispe 2, G. Yale 3, C. Suarez 4, L. Lecca 5, L. Llanos Zavalaga 6 1. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú 2. Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias. Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú 3. Laboratorio de Referencia Regional de Lima Ciudad Dirección Regional de Salud V. Lima, Perú. 4. Laboratorio de Referencia Regional de Lima Este Dirección Regional de Salud IV. Lima, Perú. 5. Proyecto Vigía (MINSA/USAID). Lima, Perú. 6. Facultad de Salud Pública y Administración. Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú. Resumen Organización: Pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar procedentes de comunidades de alta incidencia de tuberculosis resistente en Lima. Objetivo: Validar el ensayo de PCR UHG-Rif para la identificación de M. tuberculosis resistente a rifampicina y multidrogoresistente Diseño: Comparar la determinación de la susceptibilidad antituberculosa mediante el método de las proporciones y el PCR UHG-Rif a partir de muestras clínicas. Finalmente se analizó la capacidad diagnóstica del ensayo de PCR UHG-Rif Resultados: La concordancia en la identificación de la susceptibilidad antituberculosa fue 0,95 (ĸ=0,899; P<0,05) mostrando una sensibilidad y especificidad del 0,973 y 0,922 (P< 0,05) respectivamente. El valor predictivo positivo fue 0,9386 (IC 95%: 0,879 0,970) y negativo fue 0,965 (IC 95%: 0,902 0,988), sin embargo la posibilidad de predicción de MDR fue 0,981 (P<0,05). Este método permite la detección de poblaciones mixtas y las discordancias pueden determinar la presencia de mutaciones silenciosas y por fuera de la región caliente del rpob asociado a resistencia a rifampicina. Conclusión: El ensayo de PCR UHG-Rif detectó mutaciones en el gen rpob mostrando una excelente sensibilidad, especificidad y adecuados valores predictivos con el método estándar en la determinación de la susceptibilidad antituberculosa. Por lo tanto este ensayo puede ser considerado como una excelente herramienta que contribuirá con el control de la tuberculosis, identificando correcta y oportunamente a los pacientes infectados con bacilos resistentes y MDR, permitiendo la reducción de casos de TB y TB resistente en nuestro país.
INTRODUCCION La tuberculosis multidrogo-resistente (TB MDR) es un serio problema de salud pública en el Perú y en el mundo, con cerca de tres millones de muertes anuales. Esta enfermedad es favorecida principalmente por la diseminación del VIH-SIDA y la inmigración de personas desde áreas de alta incidencia (1). Según el estudio de Vigilancia de la resistencia antituberculosa del año 1999, la TB MDR adquirida alcanzó en las Direcciones de Salud Lima Ciudad y Lima Este niveles de 10,6% y 41,6%, respectivamente (2); sin embargo, se estima que estos porcentajes pueden haberse incrementado. Dado este panorama, existe la necesidad de contar con métodos que permitan la detección oportuna de pacientes infectados con Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, sobre todo porque estos casos muchas veces presentan una baja tasa de curación al ser tratados con esquemas empíricos (sin contar con un perfil de susceptibilidad al inicio del tratamiento) (3). En nuestro país, normalmente los pacientes con sospecha de diagnóstico de tuberculosis pulmonar inician el tratamiento convencional, comúnmente conocido como esquema I (combinación de isoniacida, rifampicina, pirazinamida y etambutol), salvo algunos casos particulares a quienes se les indica otros tipo de esquemas terapéuticos. En algunos casos, o cuando el tratamiento inicial ha fracasado, se solicita un perfil de susceptibilidad antibiótica, prueba que se realiza por el método de proporciones, demorando varias semanas en reportarse el resultado, y por ende ello retrasa el empleo de tratamientos efectivos. Debido a que los actuales y convencionales métodos de detección de resistencia antituberculosa demoran en la emisión de resultados, es necesario evaluar nuevos sistemas de identificación temprana de los pacientes infectados con bacilos resistentes; debiendo ser sensibles, específicos y confiables. La resistencia a rifampicina está principalmente asociada (~96%) con mutaciones en el gen rpob (4, 5) y puede ser considerada como un excelente marcador de multidrogoresistencia, dado que la mayoría de los aislamientos resistentes a rifampicina son también resistentes a isoniacida (6). Para evaluar la factibilidad de una técnica de diagnóstico temprano, tanto en sensibilidad, especificidad y valores predictivos adecuados, en el presente trabajo se validó el ensayo de PCR UHG Rif (PCR basado en generador de heteroduplex universal) para determinar la susceptibilidad a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. En este ensayo un fragmento amplificado de 193pb del gen rpob fue hibridizado con un fragmento denominado universal heteroduplex generator (UHG) del mismo gen mostrando mutaciones, siendo usado para la determinación genotípica de la resistencia a rifampicina en M. tuberculosis y pueda ser una herramienta que contribuya con el control de la enfermedad en nuestro país.
MATERIALES Y METODOS Diseño experimental Se realizó un estudio experimental, prospectivo y doble ciego, para validación del ensayo de PCR UHG Rif en comparación con el método estándar empleado en el país para el diagnóstico de susceptibilidad antituberculosa: método de proporciones de Canetti y col. variante económica (7). Población y reclutamiento de los participantes La muestra la conformaron pacientes procedentes de dos localidades de Lima, cuyos registros indicaron una elevada tasa de TB-resistente: Dirección Regional de Salud IV Lima Este y la Dirección Regional de Salud V Lima Ciudad (2). Se incluyeron a los casos con diagnóstico de TB pulmonar BK(+) captados en diversos establecimientos de las zonas seleccionadas, ya sea nuevos (nunca tratados) con antecedente de contacto de casos de tuberculosis resistente, o antes tratados (recaída, fracaso o abandono). Se excluyeron a los casos paucibacilares, que contaban con su solicitud de investigación bacteriológica de tuberculosis incompleta y aquellos que no consintieron su participación en el estudio. Procedimientos Los procedimientos de preparación, lectura e informe de resultados para la baciloscopía, cultivo y prueba de susceptibilidad a drogas por método de proporciones de Canetti y col. variante económica siguieron lo descrito por los documentos referenciales (7,8). Para la realización del ensayo de PCR UHG Rif se realizó el siguiente procedimiento: Un volumen de 3 ml de cada muestra de esputo fue descontaminado con NaOH/N-acetil-Lcisteína, neutralizada, resuspendida en buffer fosfato (9, 10) y una porción fue separada, inactivada, tratada y purificada para PCR mediante el uso del QIAamp DNA Mini Kit (QIAGen). Una región de 193 pb del gen rpob fue amplificada mediante un heminested PCR; hibridado con el UHG Rif y evidenciado en electroforesis en poliacrilamida al 10% (10-12). Las mutaciones asociadas a resistencia a rifampicina fueron detectadas al obtener apareamientos incorrectos en los perfiles electroforéticos. Análisis de concordancia Para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) a rifampicina por PCR UHG Rif se compararon los perfiles de cada muestra frente al perfil de MTB H37Rv (10, 12). Los resultados fueron ingresados en una base de datos en Microsoft Excel y luego analizados usando el software SPSS v. 10 para Windows. Se determinó la sensibilidad, especificidad, valores predictivos e índice Kappa de concordancia entre los resultados de la prueba estándar (método de proporciones) y el método molecular (PCR UHG Rif).
El estudio contó con la aprobación del Comité de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Salud, habiéndose solicitado, según correspondiese, el consentimiento y/o asentimiento verbal de los participantes. RESULTADOS 243 muestras de esputo fueron obtenidas de pacientes con tuberculosis pulmonar desde marzo a septiembre del 2003, pero sólo fueron analizadas aquellas en las cuales se obtuvieron resultados de cultivo positivo y en las que pudieron completarse los exámenes de susceptibilidad. Finalmente, el análisis fue realizado sobre 200 muestras (115 de la DISA Lima Ciudad y 85 de la DISA Lima Este), de las cuales 153 pertenecieron a pacientes antes tratados (AT) y sólo 47 correspondieron a pacientes nunca tratados (NT) con antecedente de contacto con casos de tuberculosis resistente y MDR. En la Tabla Nº 1, se muestra el perfil de susceptibilidad antituberculosa encontrada en los aislamientos procedentes de los pacientes de Lima Ciudad y Lima Este. El PCR UHG Rif (10) fue completado en el total de las muestras que ingresaron al estudio, detectando a 83 de los 90 sensibles (92,2% de especificidad) y a 107 de los 110 resistentes (97,1% de sensibilidad) a rifampicina (Tabla N 2). En la Tabla Nº 3 se muestran la comparación de los resultados obtenidos en los grupos de pacientes nunca y antes tratados. De acuerdo a los resultados de susceptibilidad a isoniacida y rifampicina se determinó la capacidad predictiva del PCR UHG-Rif para TB-MDR, encontrando que la detección molecular presentó una concordancia del 98% con la detección convencional de la resistencia de esas drogas (p<0,05). Por otro lado, el PCR UHG Rif fue capaz de determinar perfiles o que presentaban simultáneamente el genotipo sensible y resistente (mixtos), revelando la heterogeneidad de la población de bacilos infectantes tanto en los pacientes NT y AT. Así también, no se encontraron diferencias significativas en la obtención de resultados del PCR UHG Rif al evaluar muestras clínicas con diferentes niveles bacilíferos. DISCUSION El análisis de la secuencia nucleotídica del gen rpob ha permitido establecer el mecanismo de la resistencia a rifampicina, por lo que en este trabajo se han demostrado los adecuados niveles de sensibilidad, especificidad y valores predictivos en la identificación de M. tuberculosis resistente a esta droga. Una especificidad del 0,922 (p<0,05) y una sensibilidad del 0,973 (P<0,05) del método de PCR UHG Rif fue encontrada teniendo al método de las proporciones como patrón. Anteriormente en un pequeño estudio similar con este método en nuestro laboratorio y a partir de 31 muestras de esputo BK+ procedentes de la Dirección de Salud Lima Norte (10), produjo una concordancia y especificidad del 100%, pero a pesar de ello, la sensibilidad mostrada fue 0,8. Por otro lado, en otro estudio, la aplicabilidad del PCR UHG-RIF en diagnóstico de la resistencia mostró una sensibilidad del 0,971 y una especificidad del 0,982 frente al MABA como patrón (13).
La identificación oportuna de los casos de TB-MDR es completamente necesaria y la aplicación de este método fue 98,1% concordante (nivel de sensibilidad) con el método de las proporciones, por lo que se muestra como un excelente sistema de detección de estos casos. Obviamente esta rapidez y oportunidad diagnóstica podría dirigir un óptimo tratamiento, disminuyendo así algunas características de riesgo como la persistente diseminación de esta enfermedad en casos no diagnosticados, especialmente en pacientes con elevado riesgo de contraer TB-MDR (presidiarios, personal de salud, pacientes VIH+) e influyendo eficazmente en la disminución de la morbi-mortalidad de la tuberculosis en nuestro país. Por otro lado, el análisis de PCR UHG-RIF fue eficientemente determinado en 100% de las muestras obtenidas que mostraron cultivo positivo, muy a pesar que por distintas razones no se cumpliera adecuadamente la determinación por el método de las proporciones. Algo que debe considerarse es la capacidad que tiene este ensayo en determinar perfiles mixtos a partir de una misma muestra, pudiendo encontrar pacientes R/S y R/R, de especial aplicación en la identificación de poblaciones mixtas de bacilos tuberculosos infectantes en pacientes que pueden encontrarse en el inicio de un fracaso terapéutico o que muestren resistencia a bajo nivel. La existencia de mutaciones fuera de la región caliente de 81 pb en el gen rpob, encontradas en una muy baja frecuencia (14) puede ser la responsable de los casos de falsos sensibles (falsos negativos) determinados por el PCR UHG-Rif. Por su parte, la presencia de mutaciones silenciosas y aquellas que dirigen resistencia a bajo nivel, pueden ser responsables de los falsos resistentes (falsos positivos). Todo ello sin embargo debe ser investigado, considerando la exacta correlación entre la presencia de mutaciones y el fenotipo de resistencia en aislamientos peruanos de Mycobacterium tuberculosis procedente de regiones representativas a nivel nacional, para conocer la verdadera aplicabilidad de esta metodología en la detección de la resistencia antituberculosa, en los casos discordantes, para lo cual son un pequeño porcentaje. En resumen, la determinación molecular de la susceptibilidad a rifampicina mediante el PCR UHG-Rif es una excelente alternativa a los métodos basados en cultivo, debido a que su aplicación toma aproximadamente 48 horas para la emisión de resultados. El criterio clínico puede considerar esta herramienta como un método de diagnóstico temprano para la toma de oportunas decisiones, sobre todo en pacientes con elevado riesgo de drogo-resistencia y así evitar el fracaso terapéutico, pudiendo escoger alternativamente drogas de segunda línea en el tratamiento, evitando la exposición empírica e innecesaria a drogas antituberculosas. Nosotros hemos demostrado que el PCR UHG Rif puede dirigirse a pacientes con alta sospecha de tuberculosis resistente, entre los cuales se pueden tener en la comunidad a los pacientes ATs y contactos de pacientes con tuberculosis resistente que provengan de zonas tales como La Victoria, El Agustino y Lima Cercado, así como a pacientes hospitalizados.
CONCLUSION En este trabajo se ha demostrado la capacidad diagnóstica de resistencia a rifampicina y multidrogoresistencia mediante el establecimiento de una herramienta molecular: el PCR UHG- Rif. Su alto grado de concordancia en el diagnóstico, sus adecuados niveles de sensibilidad, especificidad y valores predictivos permiten su aplicabilidad en áreas de elevada prevalencia de TB MDR. Un siguiente paso a seguir corresponde a la identificacion de los potenciales usuarios y la puesta en práctica de la herramienta molecular en el diagnostico de multiresistencia antituberculosa. Sin embargo se debe continuar investigando la problemática de la resistencia en M. tuberculosis, debido a que se ha podido identificar, por ejemplo, un pequeño índice de bacilos que no cuentan con mutaciones en la región caliente de 81 pb analizada mediante la generación de heteroduplexes, así mismo la presencia de mutaciones silentes y la frecuencia de las mutaciones que dirigen resistencia y sobre todo comparar los niveles de concentraciones mínimas inhibitorias frente a la aparicion de mutaciones específicas en M. tuberculosis. REFERENCIAS 1. RATTAN A, KALIA A, AHMAD N. Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis: Molecular perspectives. Emerg Infect Dis 1998; 4(2):195-209. 2. MINISTERIO DE SALUD. Evaluación del Programa nacional de control de la Tuberculosis en el Perú - Año 1999. Lima: MINSA; 2000. Informe Anual. 3. FARMER P, SHIN S, BAYONA J, KIM J, FURIN J, BRENNER J. Making DOTS Plus work. In. Multidrug resistant tuberculosis. Edited Bastian I, Portaels F. Kluewer Acad. Publishers. Dordrech; 2000. 4. RAMASWAMY S, MUSSER J. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuberc and Lung Dis 1998, 79: 3-29. 5. FLUIT AC, VISSER MR, SCHMITZ FJ. Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin Microbiol Rev 2001; 14(4): 836-71. 6. COLE S, TELENTI A. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Eur Res J 1995; 20: 701S 13S. 7. CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS (CPZ-OPS/OMS). Manual de Normas y procedimientos técnicos para la Bacteriología de la Tuberculosis. Parte III: Sensibilidad del Mycobacterium tuberculosis a las drogas. La identificación de Micobacterias. Buenos Aires: CPZ-OPS/OMS; 1986. 8. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. Manual de Normas y Procedimientos en Bacteriología de Tuberculosis. Lima: INS; 1995. Serie de Normas técnicas N 26. 9. WILLIAMS DL, GILLIS TP, DUPREE WG. Ethanol fixation of sputum sediments for DNAbased detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 1995; 33: 1558-61.
10. CALDERÓN R, ASENCIOS L, QUISPE N, CUSTODIO W, MONTOYA Y. Detección rápida de resistencia a drogas en Mycobacterium tuberculosis mediante PCR-SSCP y PCRheteroduplex. Rev Peruana Med Exp Salud Pública 2003; 20(4): 65-71. 11. WHELEN AC, FELMLEE TA, HUNT JM, WILLIAMS DL, ROBERTS GD, STOCKMAN L, et al. Direct genotypic detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance in clinical specimens by using single-tube heminested PCR. J Clin Microbiol 1995; 33: 556-561. 12. WILLIAMS DL, LIMBERS C, SPRING L, JAYACHANDRA S, GILLIS T. PCR/Heteroduplex detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. In: PCR protocol for emergenging infectious diseases. Ed. Persing D. ASM; 1994.p. 122-129. 13. MAYTA H, GILMAN R, ARENAS F, VALENCIA T, CAVIEDES L, MONTENEGRO S, et al. Evaluation of a PCR-Based Universal Heteroduplex Generator Assay as a Tool for Rapid Detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Peru. J Clin Microbiol 2003; 41(12): 5774-5777. 14. HEEP M, BRANDSTATTER B, RIEGER U, LEHN N, RICHTER E, RUSCH-GERDES S, et al. Frequency of rpob mutations inside and outside the cluster I region in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Clin Microbiol 2001; 39: 107-10. AGRADECIMIENTOS Personal de los Centros de Salud participantes de las DISAS Lima Ciudad y Lima Norte, y al Téc. Lab. David García por su experticia en la realización de la electroforesis y la tinción de los geles con sales de plata. ANEXOS Tabla Nº 1 Perfiles de Resistencia a las principales drogas antituberculosas encontradas en los aislamientos de los pacientes procedentes de Lima Ciudad y Lima Este en el año 2003 Patrón de resistencia Total Nunca tratados Antes tratados N % N % N % A un medicamento (cualquiera) 131 65,5 18 38,3 113 73,9 A Isoniazida (INH) 116 55,0 10 21,3 100 65,4 A Rifampicina (R) 110 58,0 13 27,7 97 63,4 A Estreptomicina (SM) 104 51,0 16 19,1 88 60,8 MDR 106 53,0 13 27,7 93 60,8 Sensibles 69 34,5 29 61,7 40 26,1 TOTAL 200 100 47 23,5 153 76,5
Tabla Nº 2 Comparación de la determinación de la susceptibilidad antituberculosa a rifampicina entre el PCR UHG-Rif, el método de las proporciones y secuenciamiento del gen rpob PCR UHG-Rif Método de proporciones % Valor Predictivo Resistente Sensible Positivo Negativo Resistente 107 7 0.939 b Sensible 3 83 0.965 c Sensibilidad Especificidad Concordancia (ĸ) 0.973 a 0.922 a 0.899 a a P<0.05, b Intervalos al 95%de confianza: 0.879 0.970, c Intervalos al 95%de confianza: 0.902-0.988 Tabla Nº 3 Comparación de la sensibilidad, especificidad y valores predictivos del PCR UHG-Rif en pacientes nunca y antes tratados. PCR UHG-Rif vs. Método de proporciones Nunca tratados Pacientes Antes tratados Sensibilidad 1,0 a 1,0 a Especificidad 1,0 a 1,0 a Valor Predictivo positivo (IC 95%) 1,0 a (0,77 1,0) b 0,96 a (0,90 0,98) b Valor predictivo negativo (IC 95%) 1.0 a (0,9 1,0) b 1.0 a (0,93 1,0) b Concordancia (ĸ) 1,0 1,0 a P<0.05, b Intervalos al 95%de confianza