ENZIMAS
ENZIMAS Son moléculas de naturaleza proteínica que aceleran las reacciones bioquímicas. Son catalizadores biológicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, de forma que se aceleran sustancialmente la tasa de reacción.
QUÉ ES UN CATALIZADOR? Es una molécula inorgánica u orgánica que incrementa notablemente la velocidad de las reacciones químicas sin ser modificada o consumida en la reacción.
Reacción enzimática simple E+S ES EP E : enzima libre S : sustrato ES : complejo enzima-sustrato EP: complejo enzima producto P : producto E+P
Cinética vs termodinámica Las reacciones proceden espontáneamente si hay un descenso en la energía libre cuando la temperatura y la presión se mantienen constantes. bioquímicas, que son termodinámicamente posibles, ocurren a velocidades despreciables, es decir son cinéticamente imposibles. Muchas reacciones De aquí la necesidad de la catálisis para incrementar sus velocidades. La catálisis en las células la llevan a cabo las enzimas.
Cinética vs termodinámica Lo que determina si una reacción es termodinámicamente posible es el valor del cambio en energía libre (ΔG). Lo que determina si una reacción es cinéticamente posible es el valor de su energía de activación (ΔG ).
El cambio negativo en energía libre (ΔG), o lo que es lo mismo el valor mayor de uno de la constante de equilibrio (Keq), nos dice que la reacción procede espontáneamente de S a P.
Relación entre la energía libre y la constante de equilibrio o ΔG = -RT ln Keq
Las enzimas, como cualquier catalizador incrementan notablemente la velocidad de las reacciones químicas al disminuir su energía de activación sin ser modificadas o consumidas en la reacción.
Reacción no catalizada Reacción catalizada
Necesidad de la biocatálisis Por qué la gran mayoría de las reacciones en los seres vivos necesitan ser catalizadas para que ocurran a una velocidad apreciable? Porque de lo contrario estarían todas en el equilibrio. Porque así la célula puede regular en forma diferencial su velocidad, regulando la actividad de los catalizadores de cada una de ellas.
Ventajas de inorgánicos las enzimas sobre los catalizadores Velocidades de reacción más elevadas, son más eficientes. (105-1017) Condiciones de reacción más suaves, (T<100 C, Presión atmosférica, ph fisiológico) Mayor especificidad de reacción, y (sustratos, reactivos, no subproductos) Capacidad para la regulación control alostérico, modificación covalente, [enzima]
QUÉ TANTO ACELERAN LAS ENZIMAS LAS VELOCIDADES DE LAS REACCIONES? La reacción en que una molécula de orotidina monofosfato (ácido orotidílico) pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando no es catalizada 1017 = 100 000 000 000 000 000 CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA Ácido orotidílico Ácido uridílico (UMP)
*Ejercicio 1. Aumento de la tasa de hidrólisis La ureasa aumenta la tasa de hidrólisis de la urea a ph 8.0 y 20 C por un factor de 1014. Una cantidad de ureasa puede hidrolizar completamente una cantidad dada de urea en 5.0 min a 20 C y ph 8.0. Cuánto tardará en hidrolizarse esta misma cantidad de urea en ausencia de la enzima y bajo las mismas condiciones? 9.5 x 108 años
Especificidad de la catálisis enzimática La catálisis enzimática requiere: Unión específica a la proteína de las moléculas de sustrato y de moléculas reguladoras. Reactividad específica de la proteína con el (los) sustrato (s).
Unión específica Las moléculas que van a reaccionar, llamadas sustratos, se unen a una región en la superficie llamada sitio activo.
Teorías de unión específica del sustrato Existen dos teorías para explicar la unión específica Teoría de la llave y la cerradura Teoría del ajuste inducido
Teoría de la llave y la cerradura
Teoría del ajuste inducido
Cambio conformacional de la hexocinasa inducido por su sustrato
ENZIMAS Apoenzima: Parte proteínica. Enzima Parte no proteínica: (holoenzima) Cofactores y coenzimas Grupo prostético: unión fuerte Resaltar que es covalente Cofactores: Uno o mas iones inorgánicos. Coenzimas: Moléculas orgánica o metaloorgánicas complejas Hemoglobina
COFACTORES Cofactores: Uno o mas iones inorgánicos.
Coenzimas: Moléculas orgánica o metaloorgánicas complejas
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS 1. Deshidrogenasas, oxidasas, peroxidasas. 2. Transaminasas, cinasas, transacetilasas, metiltransferasas, aciltransferasas, glucosiltransferasas. 3. Esterasas, fosfatasas, glicosidasas, proteasas. 4. Descarboxilasas, aldehído liasas, cetoácido liasas. 5. Racemasas, epimerasas. 6.Sintetasas.
ALCOHOL DESHIDROGENASA EC 1.1.1.1 Clase: 1 (oxidorreductasa) Subclase: 1 (actúa sobre un sustrato que posee un grupo CH-OH como donador de electrones) Subsubclase: 1 (NAD+ o NADP+ es la coenzima aceptor) Orden dentro de la subsubclase: 1 (primera enzima de este grupo)
CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Estereoespecificidad: sustratos quirales, las enzimas actúan sobre sustratos L o D, pero no sobre ambos. Las enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre aminoácidos del centro activo y los distintos grupos del sustrato. Especificidad geométrica: las enzimas son selectivas hacia la identidad de los grupos químicos situados en los sustratos. Sitio activo vacío Sitio activo ocupado Sitio activo: lugar donde se lleva a cabo la catálisis enzimática.
CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS Sitio activo: lugar donde se lleva a cabo la catálisis enzimática. Sitio de unión a sustrato: Sitios químicos capaces de unirse al sustrato. Sitio alostérico: Lugar de unión a moléculas pequeñas, cuyo efecto es un cambio en el sitio activo o en el sitio de unión a sustrato, que modulan la actividad enzimática.
Ejercicio 2. Requerimiento del sitio activo La carboxipeptidasa, la cual remueve residuos de aminoácidos del extremo carboxilo de sus sustratos peptídicos, es un polipéptido de 307 aminoácidos. Los dos residuos de aminoácidos catalíticos son Arg145 y Glu270. a) Si la carboxipeptidasa fuera una α hélice, Qué tan lejos estarían los residuos Arg145 y Glu270? b) Explique cómo los dos residuos de aminoácidos pueden catalizar una reacción que ocurre en un espacio de pocos Å. a) 190 Å b) El plegamiento tridimensional de la enzima hace que los aminoácidos Arg145 y Glu270 queden cerca.
Unidades de actividad enzimática Actividad 1 unidad internacional (U) = 1 µmol de producto formado/min 1 katal = 1 mol de producto formado/s Actividad específica U/mg de proteína katal / mg proteína
Reacción catalizada enzimáticamente Reversible Irreversible simplificada
Parámetros enzimáticos Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que V0 es ½ Vmax. Es una medida de la afinidad de la enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad de la enzima por S. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones saturantes del sustrato. Vmax Velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato.
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN
*Ejercicio 3 Una enzima que cataliza la reacción X Y se aisló de dos especies bacterianas diferentes. Las enzimas tienen el mismo valor de Vmax, pero diferente valor de Km para el sustrato X. La enzima A tiene un valor de Km de 2.0 mm, mientras que le enzima B tiene un valor de Km de 0.5 mm. En la siguiente gráfica se presenta la cinética de la reacción a la misma concentración de ambas enzimas Qué curva corresponde a la enzima A y cual a la enzima B? Enzima B Enzima A
ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN
La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con el sustrato.
Unidades de los parámetros cinéticos
Velocidad máxima (Vmax) Es la velocidad límite a la que tiende la reacción catalizada por enzimas a concentraciones saturantes del sustrato, es decir cuando toda la enzima está como ES. Vmax = kcat[e]total Su valor cambia durante el proceso de purificación porque cambia la [E]
Constante catalítica (kcat) Sólo puede conocerse cuando se tiene a la enzima pura y por tanto se conoce su concentración. kcat = Vmax / [E]total o kcat = Vmax / [sitios activos] Si uno de los pasos es limitante de la velocidad, kcat es la constante de velocidad de este paso. A kcat también se le conoce como número de recambio, porque indica el número máximo de ciclos catalíticos por sitio activo y por unidad de tiempo.
*Ejercicio 4. Número de recambio La anhidrasa carbónica de los eritrocitos (Mr 30,000) cataliza la hidratación de CO2 y tiene uno de los mayores números de recambio que se conocen. H2O + CO2 H2CO3 Este es un proceso importante en el transporte de CO2 de los tejidos a los pulmones. Si 10.0 µg de anhidrasa carbónica cataliza la hidratación de 0.3 g de CO2 en un minuto a 37C a Vmax. Cuál es el número de recambio (Kcat) de la anhidrasa carbónica? Expresarlo en min-1 Kcat 2.0x107 min-1
Constante de Michaelis Menten (Km) En todos los casos es la concentración de sustrato a la que v = Vmax / 2
Constante de especificidad (Vmax/Km o kcat/km) Indica cuál es el mejor sustrato de una enzima (aquél que tenga la mayor constante de especificidad). Indica la eficiencia catalítica de la enzima a concentraciones de sustrato por debajo de los niveles de saturación. Representa el paso de unión de la enzima y el sustrato (cualquier factor que afecte esta constante está afectando el paso de unión).
Ejercicio 5. Constante de especificidad La enzima acetilcolinesterasa tiene un valor de Km para la acetilcolina de 9.5x10-5 M y un valor de Kcat de 1.4x104 s-1, mientras que la enzima catalasa tiene un valor de Km para el H2O2 de 2.5x10-2 M y un valor de Kcat de 1.0x107 s-1 Cuál de las dos enzimas está más próxima a la perfección catalítica (más específica)?
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Transformaciones de la ecuación de velocidad de Michaelis Menten Lineal 1/v vs 1/[S] (Dobles recíprocos o Lineweaver-Burk) Sigmoidal v versus log S (semilogarítmica)
ECUACIÓN DE LINEWEAVER Y BURK
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LINEWEAVER Y BURK Forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten, gráfica de dobles recíprocos.
Gráfica sigmoidal (velocidad inicial vs log [S])
*Ejercicio 6. Estimación de Vmax y Km por inspección Aunque los métodos gráficos dan una determinación exacta de la Vmax y Km de una reacción catalizada por una enzima, a veces estos valores pueden estimarse rápidamente inspeccionando los valores de Vo al incrementar [S]. Estimar Vmax y Km de la reacción catalizada enzimáticamente con los siguientes datos obtenidos: Vmax = 140 μmol/ml min Km = 1 x 10-5 M [S] (M) V0 (µmol/ml min) 2.5 X 10-6 28 4 X 10-6 40 1 X 10-5 70 2 X 10-5 95 4 X 10-5 112 1 X 10-4 128 2 X 10-3 139 1 X 10-2 140
Ejercicio 7. Relación entre la velocidad de reacción y la concentración del sustrato. Ecuación de MichaelisMenten. Determina la fracción de Vmax que podría ser obtenida a las siguientes concentraciones de sustrato: 0.5 Km, 2 Km y 10 Km. 0.5 Km 2.0 Km 10 Km V0= 0.33 Vmax V0= 0.67 Vmax V0= 0.91 Vmax
Respuesta 0.5 Km 2.0 Km 10 Km V0= 0.33 Vmax V0= 0.67 Vmax V0= 0.91 Vmax
Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas Concentración de sustrato o sustratos (cofactores) Concentración de enzima Inhibidores Activadores ph Temperatura
Regulación de la actividad enzimática por unión a la enzima de ligandos que no son sustrato INHIBIDOR : Molécula o ion que al unirse a la enzima produce una disminución en la velocidad de la reacción catalizada. ACTIVADOR: Molécula o ion que al unirse a la enzima produce un aumento en la velocidad de la reacción catalizada.
TIPOS DE INHIBIDORES ISOSTÉRICO El inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato (sitio activo). ALOSTÉRICO El inhibidor se une a un sitio diferente al que se une el sustrato (sitio alostérico).
TIPOS DE INHIBIDORES COMPETITIVO El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato. INCOMPETITIVO El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación de producto. MIXTO El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzimas sustrato, interfiriendo la unión del sustrato y la formación del producto. NO COMPETITIVO Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato.
INHIBICIÓN COMPETITIVA El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del sustrato Su efecto se contrarresta cuando [S]. Compiten con el sustrato por su sitio de unión. Reduce la concentración de enzima libre disponible.
Patrones de inhibición competitiva
INHIBICIÓN INCOMPETITIVA El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con la formación del producto) Inhibidores cuyo efecto NO se contrarresta incrementando la concentración del sustrato.
Patrones de inhibición incompetitiva
INHIBICIÓN MIXTA El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato, por lo tanto interfiere en la unión del sustrato y en la formación del producto
Patrones de inhibición mixta
INHIBICIÓN NO COMPETITIVA Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato
Patrones de inhibición no competitiva
EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS Inhibidor competitivo Km, no cambia Vmax Inhibidor mixto Km, Vmax Inhibidor incompetitivo Km, Vmax Inhibidor no competitivo No cambia Km, Vmax
*Ejercicio 9. Inhibidores En la siguiente tabla se incluyen las velocidades iniciales de una reacción catalizada por una enzima que sigue cinética de Michaelis-Menten, medidas en ausencia (control), y en presencia de dos inhibidores diferentes (1 y 2), ambos a una concentración de 10 mm. Se usó la misma concentración de enzima en todas las determinaciones.
[S] (mm) 1 2 5 10 20 Control 2.50 4.00 6.30 7.60 8.50 V0 (µmol/ml s) Inhibidor 1 Inhibidor 2 1.17 0.77 2.10 1.25 4.00 2.00 5.70 2.45 7.20 2.68 a) Presentar en un análisis gráfico de dobles recíprocos el patrón de inhibición. b) Determinar las constantes cinéticas (Km y Vmax) de la enzima en ausencia y presencia de los inhibidores. c) Para cada inhibidor determinar el tipo de inhibición.
Efecto del ph sobre la actividad de las enzimas Cambio en la ionización de los residuos de aminoácidos implicados en la unión del sustrato. Cambio en la ionización de residuos de aminoácidos implicados en la catálisis. Cambio en la ionización de grupos del sustrato. Cambio en la ionización de residuos de aminoácidos implicados en la estabilidad de la enzima.
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas La temperatura afecta la constante de velocidad de una reacción química como describe la ecuación de Arrhenius.
En las reacciones catalizadas por enzimas: La velocidad aumenta con la temperatura hasta que la enzima comienza a desnaturalizarse. No existe una temperatura óptima de reacción, depende de las condiciones en que midamos la reacción, especialmente del tiempo.
Mecanismos de regulación enzimática Regulación de la cantidad de la enzima Regulación de la actividad de la enzima preexistente
Mecanismos de regulación de la cantidad de enzima Regulación transcripcional Síntesis del ARNm Maduración y vida media del ARNm Regulación traduccional Síntesis de la proteína Regulación postraduccional Degradación de la proteína
Mecanismos de regulación de la actividad de la enzima Regulación por moléculas o iones. Sustratos, productos, cofactores. Inhibidores, activadores, ph. Regulación por modificación química Irreversible Zimógenos Reversible Adición de un grupo químico Oxidación-reducción de cisteínas Regulación por localización intracelular Isoenzimas
Regulación de la actividad enzimática por proteólisis limitada
Zimógenos Formas inactivas de enzimas que son convertidas a formas activas por proteólisis en sitios específicos. En general son enzimas proteolíticas que de sintetizarse activas producirían daños a la célula. Se activan una vez fuera de la célula que las produce (enzimas digestivas, enzimas implicadas en la coagulación sanguínea) o cuando deben llevar a la muerte celular (caso de las caspasa en la apoptosis).
Isoenzimas Proteínas que en un organismo catalizan la misma reacción pero están codificadas por genes diferentes. Difieren en sus propiedades cinéticas. Se expresan diferencialmente en diferentes tejidos, organelos o estados fisiológicos o patológicos.
Modificación química reversible por adición de un grupo
Modificación química reversible por oxidación-reducción de cisteínas vecinas
Cooperatividad enzimática
Enzimas con cooperatividad positiva La unión del sustrato es cada vez más fácil a medida que la enzima se satura más y más. Dependencia sigmoidal de la velocidad inicial vs [S]. Enzimas con cooperatividad negativa La unión del sustrato es cada vez más difícil a medida que la enzima se satura más y más. Dependencia hiperbólica de la velocidad inicial vs [S].
Cooperatividad positiva entre los sitios alostéricos La unión del efector alostérico (inhibidor o activador) es cada vez más fácil a medida que la enzima se satura más y más por este ligando. Dependencia sigmoidal de la velocidad inicial vs el efector alostérico.
MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA OBJETIVO: Disminución de la energía de activación de la reacción catalizada con respecto a la no catalizada
Tipos de catálisis enzimática CATÁLISIS ÁCIDO-BASE CATÁLISIS ELECTROSTÁTICA CATÁLISIS COVALENTE
Catálisis ácido-base La catálisis ácida general consiste en la transferencia de un protón desde un residuo de la enzima, que se comporta como un ácido de Brönsted, al sustrato o intermediarios de la reacción, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición. La catálisis básica general consiste en la transferencia de un protón desde el sustrato o intermediarios de la reacción a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Brönsted, disminuyéndose así la energía libre del estado de transición. Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene una catálisis ácido-base concertada.
Catálisis electrostática La enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta. En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unión.
Catálisis covalente La enzima forma transitoriamente un enlace covalente con el sustrato. La catálisis covalente consiste en tres pasos sucesivos: Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente). Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto). Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrólisis).
Mecanismo catalítico de la quimotripsina
Liberación del extremo amino de uno de los fragmentos en que se rompió la cadena polpeptídica
Liberación del extremo carboxilo del otro fragmento en que se rompió la cadena polipeptídica
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Caracterización cinética de las enzimas Determinar la velocidad inicial de la reacción catalizada Variando la concentración de sustrato(s) y manteniendo la concentración de enzima constante. Variando la concentración de enzima y manteniendo la concentración de sustrato(s) constante. Determinar los parámetros o constantes cinéticas: Vmax, kcat, Km, Vmax/Km, kcat/km
VELOCIDAD DE REACCIÓN Velocidad de reacción: Cambio de concentración por unidad de tiempo.
Por qué medir la velocidad inicial? En el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, hay dos razones que hacen muy conveniente medir velocidades iniciales: El producto es un inhibidor de la reacción. La enzima puede ser inestable en el medio de reacción.
INHIBICIÓN COMPETITIVA
Distribución de las especies de la enzima en ausencia de cooperatividad
Distribución de las especies de la enzima en caso de cooperatividad extrema
Cooperatividad de unión
Curvas de saturación sigmoidal por inhibidores y activadores
Saturación sigmoidal por el sustrato (cooperatividad positiva)
Constantes o parámetros cinéticos Son las constantes que aparecen en las ecuaciones de velocidad. Están formadas por constantes de velocidad de los pasos que constituyen la reacción catalizada.
Efecto del ph sobre la estabilidad vs efectos sobre la actividad de las enzimas
Interés del estudio de los efectos del ph sobre la velocidad de las reacciones catalizadas
Los H+ son inhibidores y/o activadores
Enzimas alostéricas con cooperatividad positiva de unión Son enzimas oligoméricas que poseen varios sitios activos y sitios alostéricos y exhiben una cinética de saturación por sus sustratos y/o efectores alostéricos de tipo sigmoidal, resultado de una unión cooperativa de estos ligandos. Cinética sigmoidal Alosterismo Cooperatividad De unión Cinética Enzimas oligoméricas
Ecuación de Arrhenius k(t): constante cinética (dependiente de la temperatura) A: factor preexponencial o factor de frecuencia. Refleja la frecuencia de las colisiones. Ea: energía de activación, expresada en kj/mol. R: constante universal de los gases. Su valor es 8,3143 J K-1 mol-1 T: temperatura absoluta [K]
Importancia fisiológica de las enzimas alostéricas con cooperatividad positiva de unión Pueden ser reguladas por compuestos no análogos del sustrato (retroinhibición y retroactivación). La cooperatividad positiva de unión, tanto del sustrato como de inhibidores o activadores, les permite responder a cambios pequeños en la concentración de sus ligandos con cambios grandes en la velocidad de la reacción catalizada (amplificación de la señal).
Significado del número de Hill (nh)
Especificidad vs afinidad Especificidad es la capacidad que tiene una enzima de discriminar entre posibles sustratos (sustratos alternos). Nos indica la velocidad relativa a la que se llevará a cabo la reacción catalizada con estos sustratos diferentes. Se mide por la constante de especificidad para cada sustrato. Los mejores sustratos, es decir aquellos que producen una reacción más rápida, son los que tienen una constante de especificidad mayor.
Especificidad vs afinidad Afinidad es la estabilidad del complejo ES. Nos indica la capacidad que tiene la enzima de formar un complejo con un determinado sustrato. Se mide por la constante de disociación (Kd) del complejo ES, que en ocasiones es igual a la Km. Los sustratos con mayor afinidad son los que tienen una menor Kd.
EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS Tipo de inhibidor Vmax Km Competitivo Vmax akm Incompetitivo Vmax /a Km/a Mixto Vmax /a a Km/a No competitivo Vmax /a *Km *Si a = a a Km/a =Km
Patrones de inhibición
Ecuación de Hill
Parámetros cinéticos de la ecuación de Hill
Valores del número de Hill
Efecto del ph sobre los parámetros cinéticos