INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA Al incidir radiaciones electromagnéticas de longitud de onda adecuada sobre las moléculas orgánicas se puede producir una transición desde el estado electrónico fundamental hasta un estado electrónico excitado, generalmente el primero. Si bien en una solución a temperatura ambiente la mayor parte de las moléculas suelen encontrarse en su nivel vibracional fundamental, tras la excitación radiante pueden pasar a un nivel vibracional más elevado del primer estado electrónico excitado. Los estados excitados son inestables; por tanto, existe en las moléculas una tendencia a retornar al estado electrónico fundamental. La molécula, para perder el exceso de energía absorbida y volver el estado de mínima energía y por tanto el más estable. En fluorescencia esa energía se pierde en forma de un fotón, sin cambio en la multiplicidad del spin. La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos tan sencillos como complejos. El tipo más sencillo es el que presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo, los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de 5.896 y 5.890 Å. Después de excitados los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiación de estas dos mismas longitudes de onda en todas las direcciones. Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia. Muchas especies moleculares también presentan fluorescencia de resonancia. Sin embargo, es mucho más frecuente encontrar bandas de fluorescencia molecular centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia. Este desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores energías se denomina desplazamiento stokes. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fluorescencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta / visible. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida. El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se reduce en un factor de 100 o más).las señales procedentes del fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido del tratamiento de los datos para obtener la relación entre la intensidad de la fuente de radiación. 1
La sofisticación, las características de funcionamiento y el coste de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren de unos a otros como ocurre con los correspondientes instrumentos para las medidas de absorción. Los fluorómetros son análogos a los fotómetros de absorción, en ambos se utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de los haces de excitación y emisión. Los espectrofluorímetros son de dos tipos. Los primeros utilizan un filtro adecuado para seleccionar la radiación de excitación y un monocromador de red o de prisma para obtener el espectro de fluorescencia. Se pueden adquirir varios espectrofotómetros comerciales con adaptadores que permiten utilizarlos como espectrofluorímetros. Los verdaderos espectrofluorímetros son instrumentos especializados equipados con dos monocromadores; uno de ellos permite variar la longitud de onda de excitación y el otro permite obtener un espectro de emisión. La siguiente figura a muestra un espectro de excitación del antraceno en el que la emisión fluorescente se midió a una longitud de onda fija, mientras se variaba la longitud de onda de excitación, mientras se variaba la longitud de onda de excitación. Si se efectúan las correcciones adecuadas para compensar las variaciones de la intensidad de la señal de salida de la fuente y de la respuesta del detector en función de la longitud de onda, se obtiene un espectro de excitación absoluto que es muy semejante al espectro de absorción. La figura b muestra el espectro de emisión de fluorescencia del antraceno; aquí, la longitud de onda de excitación se mantuvo constante mientras se hacía un barrido de las longitudes de onda de emisión. Estos dos espectros son como una imagen especular uno del otro, ya que las diferencias de energía vibracional para los estados electrónicos fundamental y excitado son más o menos las mismas. La selectividad que proporcionan los espectrofluorímetros es de capital importancia en las investigaciones relacionadas con las características electrónicas y estructurales de las moléculas y es valiosa en los trabajos analíticos cualitativos y cuantitativos. Sin embargo, para medidas de concentración, la información proporcionada con instrumentos más sencillos es a menudo completamente satisfactoria. De hecho, los fluorómetros, relativamente baratos, que han sido diseñados específicamente para solventar los problemas de medida propios de los métodos fluorescentes, son a menudo tan específicos y selectivos como los espectrofotómetros de absorción modificados. La discusión que sigue está enfocada, en gran parte, a instrumentos sencillos para el análisis por fluorescencia. COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFOTÓMETROS Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros constan generalmente de: Fuentes Lámparas Fuentes: lámparas,láseres Filtros y monocromadores cubetas portamuestras Detectores Sistema electrónico y registrador Los factores primarios a considerar cuando se selecciona una fuente radiadora para instrumentación de fotoluminiscencia son la intensidad de la lámpara, la distribución de longitudes de onda de la radiación que la fuente emite y su estabilidad. De interés particular es la dependencia lineal de la señal luminiscente con la potencia de la radiación de excitación. En consecuencia, se tiene la ventaja al usar una fuente tan potente como sea posible. Los espectrofluorómetros de barrido requieren fuentes de radiación que emitan 2
continuamente sobre un amplio intervalo espectral. Los fluorómetros de filtro o espectrofluorómetros que se usan específicamente para mediciones analíticas a longitudes de onda fijas pueden usar fuentes espectrales de líneas atómicas. Lámparas de arco de alta presión de xenón se usan en casi todo espectrofluorómetro comercial. La lámpara de xenón emite un intenso y relativamente estable continuo de radiación que se extiende de los 300 a los 1300 nm. Varias líneas de emisión fuerte se encuentran entre 800 y 1100 nm. Su salida espectral se aproxima a la del radiador negro con temperatura de color equivalente a 6000 k aprox. Durante la operación de la lámpara la descarga de arco se comprime dentro del estrecho espacio que hay entre los electrodos, el parpadeo del arco determina la estabilidad de corto plazo, aproximadamente de 0,3%. La estabilidad de largo plazo se acerca a 1% por hora y está limitada por el desgaste del electrodo y la divagación del arco. En contraste con los arcos de mercurio, la distribución espectral no depende en alto grado de la presión del gas de operación ni del voltaje. Una lámpara de destello de xenón es una fuente compacta de poco costo. La muestra es excitada por un destello de alta energía producida por la descarga de un capacitor previamente cargado, a través de la lámpara llena de xenón. Haciendo repeticiones del destello, pueden usarse dispositivos de CA para amplificación y aprovechar todas las ventajas de la altura del pico de intensidad de destello. Una lámpara de destello capilar de 0.8 mm de diámetro tiene ventajas obvias para arrglos con microceldas y en flujo continuo, puesto que la imagen producida en la posición de la muestra es de aprox. 2mm de ancho y 18 mm de alto. Lámaparas de vapor de mercurio de baja presión son más frecuentemente utilizadas en los fluorómetros de filtro. La presión de llenado del gas es muy baja (aprox. 10 torr). La descarga de arco resultante es muy difusa especialmente y mucho menos intensas que la de un arco de alta presión. Su estabilidad es generalmente mejor. Estas lámparas pueden ser recubiertas con fósforo para emitir un espectro más cercano al continuo, o pueden tener un bulbo claro de material que transmite el UV para permitir el uso de líneas individuales del mercurio. Se usan filtros de interferencia para seleccionar las líneas individuales del mercurio para la excitación, o se emplean filtros de paso de banda para seleccionar varias líneas a la vez. Las líneas de emisión discontinuas que salen de la lámpara de mercurio muestran una sensibilidad considerable para un material cuyo espectro de excitación coincide con una línea de emisión de mercurio, pero la sensibilidad es menor para un compuesto que sea más fuertemente fluorescente, el cual se excita más eficientemente con otra longitud de onda de excitación que no se encuentra presente a la salida de la lámpara de mercurio. Láseres Desde los años 70, se utilizan también diversos tipos de láseres como fuentes de excitación para medidas de fotoluminiscencia. Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrogeno pulsante o un láser de Nd: YAG. La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequñas como en cromatografía con microcolumnas y en elctroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un l o menor;(2) en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales hidroxilo en la atmósfera o de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza colimada de los haces de láser es vital; o (3) cuando se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para minimizar los efectos de las interferencias fluorescentes. Filtros y monocromadores 3
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la radiación fluorescente resultante. La mayoría de los espectrofluorímetros están equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red. Cubetas portamuestras Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiación dispersada que llega hasta al detector. Con este propósito, a menudo, se introducen deflectores en el compartimento. Incluso más importante que en las medidas de absorbancia, es evitar dejar las huellas dactilares en las cubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia fluorece. Hay cuatro medios para iluminar e inspeccionar la muestra: el método de ángulo recto (90 ), el frontal (37 ), el de celda de rotación y el de paso directo. En las siguientes fotos se ilustra los tres primeros métodos. La configuración de ángulo recto es eficiente porque ninguna de las superficies de la celda portamuestras iluminadas directamente por el haz de excitación queda frente al monocromador de emisión; entonces, ninguna fluorescencia debida a la celda (proveniente de trazas del uranio contenido en algunos vidrios y del cuarzo) ni radiación reflejada de estas superficies entra al monocromador de emisión. La radiación dispersada sólo se origina en el seno mismo de la solución. En el modo de inspección a 90, la radiación de excitación circula por un paso de solución bastante largo, de manera que hay un límite de concentración superior antes de que la atenuación o la radiación de excitación interrumpan la relación lineal entre la potencia luminiscente y la concentración del soluto. La disposición de las rendijas de entrada y salida, como se observa en la siguiente figura tiene influencia sobre la longitud de paso efectivo (o en el volumen crítico inspeccionado. El método frontal de iluminación de la celda se usa en primer lugar, para materiales semiopacos o para sólidos, o para soluciones que muestran gran absorción. La desventaja de esta configuración es que el monocromador de emisión se ve directamente iluminado por una superficie de la celda, que tiene su propia fluorescencia residual y refleja radiación inevitablemente. La radiación reflejada se minimiza seleccionando un ángulo de 37 como ángulo de despegue. El método de la celda en rotación es un modo de evaluar y corregir la potencia fluorescente por la absorción del rayo primario (o de excitación) y por la absorción del rayo secundario (o de emisión). La celda se hace girar de manera que se efectúan las tres mediciones en las posiciones 1 y 2 es una medida de la absorción de la radiación de excitación por la muestra. Detectores La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relación señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros, los detectores de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el registro rápido de los espectros de excitación y de emisión y particularmente son útiles en cromatografía y en elctroforesis. DISEÑO DE INSTRUMENTOS Fluorómetros de filtro Los fluorómetros de filtro ofrecen la ventaja de bajo costo y conveniencia para determinaciones cuantitativas rutinarias. En los fluorómetros las longitudes de onda de excitación y de emisión se escogen con filtros de absorción o de interferencia. Para análisis de rutina la pérdida de versatilidad no es un inconveniente mayor, 4
en tanto que la alta sensibilidad que puede lograrse si la longitud de onda de excitación corresponde con una línea de emisión de la fuente, puede ser una gran ventaja. El tamaño pequño de los filtros, comparado con el de los monocromadores, da lugar a un instrumento compacto. Un fluorómetro de filtro generalmente consta de una lámpara de mercurio como fuente de excitación, un filtro primario para transmitir la longitud de onda excitacional deseada y la cubeta portamuestras. En tubo fotomultiplicador mide la emisión fluorescente. El filtro secundario, entre la muestra y el fotodetector, se elige para transmitir la fluorescencia y para absober la radiación de excitación dispersada. Si celdas de flujo se incorporan en el compartimiento de la muestra, pueden formar parte de un sistema de instrumentación de flujo continuo, tal como en los sistemas de detección de la cromatografía líquida de alta resolución. El uso de filtros ópticos se traduce en niveles de radiación excitadora muy altos y en una detección eficiente, pero se sacrifica la selectividad obtenida por una selección más precisa de las longitudes de onda de excitación y emisión con los monocromadores. Los filtros de excitación son generalmente del tipo de paso de banda, que transmiten una banda bastante ancha de longitudes de onda, aunque se usan los filtros de interferencia para aislar líneas de mercurio particulares. Transmisión extra banda y, en consecuencia, un nivel de radiación parásita generalmente muy elevado, es características de los filtros de interferencia cuando se compara con los filtros de absorción. Esto se atribuye a picaduras o defectos en los recubrimientos de las películas. Los filtros de emisión son comúnmente del tipo de corte nítido, en donde pasan las longitudes de onda largas y se atenúan las longitudes de onda más cortas, un punto para recordar res que los filtros de paso de banda tienen más de una banda de transmisión o ventana. Los fotodetectores tienen a menudo una respuesta de bajo nivel en un gran intervalo de longitudes de onda. Esto puede dar una señal de radiación parásita elevada. Los filtros de corte nítido, en particular si son de vidrio, frecuentemente presentan cierta fluorescencia. Los fluorómetros de filtro casi siempre usan un arreglo de un solo rayo con un control de intensidad de la fuente para disminuir los efectos de las fluctuaciones y la deriva en la intensidad de la fuente para disminuir los efectos de las fluctuaciones y la deriva en la intensidad de la fuente y en la respuesta del detector. Se dispone de una variedad de ingeniosas formas de obtener un canal de muestreo o monitoreo. Una parte de la radiación de la lámpara pasa a través del sistema óptico primario y se atenúa mediante un disco de apertura de referencia y la señal de la muestra que proviene del fotodetector de la muestra se aplican un divisor electrónico de estado sólido, que se encarga de calcular el cociente muestra/referencia de señales. La lectura del medidor o el cuadrante es proporcional a la concentración. Las mediciones pueden extenderse a concentraciones extremadamente pequeñas, aumentando la sensibilidad del fotodetector o la intensidad de la fuente de radiación. Las mediciones de fluorescencia se hacen usualmente con referencia a algún estándar elegido arbitrariamente. El estándar se coloca en el instrumento y el circuito se balancea con la escala de lectura a algún valor previamente escogido. Sin volver a ajustar ninguno de los componentes del circuito, el estándar se reemplaza por soluciones conocidas del analito y se registra la fluorescencia de cada una de ellas. Finalmente se mide la fluorescencia del solvente y de la celda juntos para establecer la lectura real de concentración igual a cero. Algunos fluorómetros están equipados con un circuito de ajuste a cero. Una gráfica de las lecturas de fluorescencia contra la concentración de las soluciones de referencia da lugar a una curva de calibración. Algunos estándares de fluorescencia comúnmente utilizados son la rodamina B en etilenglicol, el sulfato ácido de quinina en sulfúrico 0.1N el triptófano en agua y el antraceno en ciclohexano o en etanol. Filtros de referencia de vidrio también son convenientes. ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN Antes de explicar el funcionamiento y estructura de un espectrofluorómetro se debe de explicar dos conceptos importantes. Con los espectrofluorómetros se pueden obtener dos tipos de espectro: 5
de excitación: es una representación del número de fotones absorbidos por la molécula en función de la longitud de onda. Para registrar el espectro de excitación se fija el monocromador secundario de emisión a una longitud de onda determinada (la longitud de onda de fluorescencia máxima), y se hace un barrido exploratorio de longitudes de onda con el monocromador primario de excitación. Las rendijas de excitación han de ser lo suficientemente estrechas como para permitir obtener el espectro bien resuelto. de emisión: se obtiene fijando el monocromador primario a la longitud de onda en la cual existe un máximo en el espectro de excitación, haciendo un barrido espectral con el monocromador secundario. Al registrar un espectro de fluorescencia, las curvas obtenidas representan la variación de la corriente del fotomultiplicador en función de la longitud de onda de fluorescencia que incide sobre el fotomultiplicador, teniendo en cuenta que la magnitud de la corriente fotoeléctrica es proporcional a la intensidad de la señal de fluorescencia. Los espectros de fluorescencia se encuentran a menudo acompañados por cuatro bandas indeseables que dificultan su estudio: dispersión Rayleigh dispersión Raman posible fluorescencia del solvente y de la cubeta máximos de segundo orden, cuando de emplean como selector de radiaciones redes de difracción. Sin embargo, en la práctica resulta sencillo distinguir estas cinco emisiones, y detectar la fluorescencia que será el objetivo propuesto. El espectro de emisión de los compuestos fluorescentes es especialmente sensible al entorno molecular. Por ello, el estudio de los factores ambientales que pueden afectar al proceso de fluorescencia es muy importante. ESPECTROFLUÓROMETRO El mayor alcance analítico del análisis por fluorescencia se logró al reemplazar los filtros por monocromadores de rejilla para obtener un barrido de longitudes de onda en la región de 200 a 800 nm, la región más útil para la técnica de fluorescencia. Otra ventaja de la espectrofluorometría es que el analista ve la radiación dispersa al comparar el espectro de la muestra contra un espectro de referencia y al examinar la distorsión de los picos de fluorescencia o la presencia de picos adicionales. Usualmente tienen incorporados monocromadores de rejilla del tipo Czarny Turner, con una distancia focal de 0,25 m y una apertura f/4 o f/5. los monocromadores usan rejillas con 600 estrías/mm, marcadas para 300 nm en la unidad de excitación y para 500 nm en la unidad de emisión. Se usan filtros para bloquear radiación difractada de orden mayor. El monocromador de excitación se localiza entre la fuente de radiación y la muestra, y el monocromador de emisión se halla entre la muestra y el tubo fotomultiplicador. Para hacer análisis cuantitativo, se seleccionan las longitudes de onda deseadas de excitación y de emisión y se comparan las potencias fluorescentes relativas del estándar y de las muestras problema. Para tener una buena selectividad espectral y poder resolver la estructura fina de los espectros, el monocromador de emisión debe ser capaz de resolver dos líneas con 6
diferencia de 0,1 nm. Los instrumentos que miden las características de la muestra sin una comparación continua con un estándar de referencia tienen los mismos inconvenientes mayores que se presentan al intentar registrar espectros de absorción con un instrumento de un solo haz. Si la fuente es inestable y varía en intensidad, puede crear picos falsos en el espectro. Igualmente graves son las variaciones en la sensibilidad del fotodetector con respecto a la longitud de onda. El término no corregido se aplica a este tipo de espectrofluorómetro, porque los espectros de excitación y de emisión que se presentan son una combinación del espectro real de un compuesto y diversos equipos instrumentales. Cuando se grafican los espectros de excitación reales, de la distribución espectral a la salida de la lámpara y de la eficiencia del monocromador de excitación con la longitud de onda. Asimismo, los espectros de emisión obtenidos son combinación de los espectros de emisión reales, de la distribución espectral de la respuesta del detector y de la eficiencia del monocromador de emisión con la longitud de onda. En ciertas regiones del espectro estos factores instrumentales se vuelven dominantes. A pesar de estas desventajas, el espectrofluorómetro no corregido se utiliza para análisis cuantitativos con la conveniencia de que las longitudes de onda se seleccionan y usan para comparaciones bastas de los espectros obtenidos en otros laboratorios, y para comparaciones directas de los obtenidos dentro del mismo laboratorio. Las limitaciones instrumentales causadas por la inestabilidad de la fuente de xenón son eliminadas por la operación en modo cociente o razón. Una pequeña fracción de la radiación excitadora es dirigida hacia un fotodetector de referencia, que en primera instancia se escoge para una respuesta amplia en longitudes de onda. La radiación emitida se aisla con un fotodetector de emisión especialmente seleccionado con una corriente oscura pequeña y alta sensibilidad. La señal de salida de fototubo de referencia se amplifica y se alimenta a un circuito controlador de voltaje por dínodo fotomultiplicador, el cual se usa como un monitor para controlar el voltaje del dínodo de ambos tubos fotomultiplicadores en una relación inversa. Conforme la radiación excitadora aumenta o disminuye en potencia por las fluctuaciones de la lámpara de xenón, hay un aumento o una disminución correspondientes en la fluorescencia relativa. El detector de referencia es el componente del sistema con la velocidad y la amplitud de respuesta necesarias para examinar la potencia radiante de excitación. Como la señal se examina después del monocromador de excitación, los espectros de excitación son compensados por las fluctuaciones de energía dependientes de la longitud de onda. Sin embargo, este procedimiento no aporta un verdadero espectro de excitación corregido. Conforme el entrecortador gira, toda la radiación es bloqueada en un tubo fotomultiplicador o en el otro. Cualquier señal de un detector durante el periodo en que el cortador bloquea la radiación que proviene de él es una corriente oscura inherente al detector. Las señales de los dos fotomultiplicadores, ahora separados en el tiempo, se alimentan a un amplificador diferencial, que efectivamente resta la corriente oscura y que muestra el registrador sólo la diferencia de la señal. Monocromación doble El diagrama óptico de un instrumento que usa monocromacion doble se muestra en la siguiente figura. La sección óptica del instrumento comprende cuatro monocromadores de rejilla. Dos se usan en tándem para dispersar la energía de excitación y los otros dos se usan para examinar los espctros de fluorescencia. Un filtro óptico, colocado en el paso de la radiación entre la fuente de xenón y el monocromador de excitación elimina la excitación de segundo orden cuando las longitudes de onda excitacionales utilizadas son mayores que 400 nm. El monocromador doble reduce drásticamente la radiación dispersada y también permite el uso de rendijas más grandes para alcanzar la misma resolución que los monocromadores comunes, que tienen anchos de rendija más pequeños. Las rendijas más grandes permiten que pase más radiación a través del 7
monocromador de excitación para poder excitar la muestra. Esto es muy ventajoso para muestras a bajas concentraciones porque una cantidad máxima de energía se hace asequible sin sacrificar resolución. Espectrofluorómetro de fluorescencia de doble haz Por doble haz se entiende un sistema óptico electrónico que permite el uso de un segundo rayo de luz para lograr, esencialmente una compensación simultánea de la fluorescencia de la muestra por comparación con una muestra de referencia. En estas fotos se muestra un esquema de la óptica de estos instrumentos. El diseño, en concepto, utiliza un sistema electroóptico de tiempo compartido con pasos ópticos equivalentes para los haces de la muestra y de referencia y un cortador óptico para crear una señal de CA, así como para dividir el rayo. La lámpara de arco de xenón 150 W se enfoca hacia una rendija de entrada que se encuentra en la entrada del monocromador, después de que la radiación ha sido cortada ópticamente con un disco en forma de corbata de lazo. Un espejo secturado, localizado más allá de las rendijas de salida del monocromador de excitación, está unido por un eje común con el cortador. En el modo de fluorescencia de doble haz, la radiación emitida se observa en ángulo recto con la radiación de excitación, tanto para el rayo de la muestra como para el de referencia. La radiación de cada rayo se enfoca alternadamente en la rendija de entrada del monocromador de emisión usando espejos de superficie frontal comunes o equivalentes. El espejo de celosía es un espejo plano, semiluminado y semitransparente, que refleja el rayo de referencia y transmite el rayo de la muestra hacia el monocromador de emisión. Ambos rayos emergentes de las rendijas de salida del monocromador de emisión llegan al detector fotomultiplicador con una diferencia de fase de 180. Cuando el entrecortador abre por primera vez, el espejo secturador refleja el rayo hacia la referencia. Cuando el disco cortador por segunda vez, el espejo también abre y, por lo tanto, permite que pase la radiación hacia la muestra. En el tiempo restante de cada revolución del entrecortador, se mide el cero óptico, mientras se interpone la parte opaca del disco. La técnica de doble haz suministra una mayor precisión analítica, mayor conveniencia y mayor velocidad que las técnicas de un solo haz comparables, ya que elimina la dispersión interferente y la fluorescencia de los reactivos. También hace posible la medición de pequeñas diferencias entre dos muestras fluorescentes muy similares. La corrección completa del espectro de excitación se hace registrando el cociente de la señal de salida del detector de la muestra con respecto a la de un detector referencia que toma muestras de la emisión de un contador cuántico. El contador cuántico es una celda especial que contiene una concentración elevada de un material fluorescente, que a menudo es la rodamina B. Sobre un intervalo considerable de longitudes de onda de excitación, toda energía incidente es absorbida y una fracción cuántica fija es reemitida prácticamente a una sola longitud de onda (640 nm). Entonces, una parte de este haz emitido se deja llegar alternadamente al mismo fotomultiplicador que se usa para medir la emisión fluorescente de la muestra. Las señales provocadas por la luz del contador cuántico y por la muestra se separan eléctricamente y se usan para operar un registro de cocientes. Ya que la luz emitida por el contador cuántico es proporcional a los quanta que se dejan llegar a la muestra, se obtienen automáticamente espectros de excitación corregidos. La computadora de espectros corregidos almacena automáticamente factores de corrección de tal manera que genera y almacena una curva de error tanto para los espectros de excitación como para los de emisión. Las mediciones de fluorescencia corregida brindan información útil concerniente a los estudios de transferencia de energía (Inter e intramoleculares), a la energía de los desplazamientos de Stokes y a los estudios de macromoléculas. Dado que, en fluorescencia, un espectro de excitación corregido es idéntico a un 8
espectro de absorción pero 1000 veces más sensible, se aplica con ventaja en el análisis de trazas que comúnmente usan la espectrofotometría de absorción UV visible. PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. En la imagen se muestra el esquema de funcionamiento de un microscopio de epifluorescencia, en el que la luz incide sobre la preparación a través de las lentes del objetivo. Este microscopio, de gran poder de resolución tiene que tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la luz ultravioleta. En el esquema se sitúan los tres elementos característicos del microscopio de fluorescencia: Primer filtro de corte o filtro de excitación. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) Espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra. Segundo filtro de corte o filtro de emisión. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caos deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. En el esquema los filtros que se han indicado serían los que emplearíamos la fluorescencia asociada al isotiocianato de fluoresceína, molécula fluorescente ampliamente utilizada en microscopía de fluorescencia acoplada a anticuerpos. Existe un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos, inclusive conjuntos que permiten la observación simultánea de dos fluorocromos. Es de gran importancia seleccionar el adecuado conjunto de filtros para la observación. En las imágenes que encontrarás a continuación encontrarás el resultado de la observación de una preparación de células Ptk2 en las que se ha inmunodetectado la tubulina mediante anticuerpos acomplejados a fluoresceína (verde), y se ha teñido el núcleo con DAPI (azul). Se muestra el espectro característico de tres sistemas de filtros (WU, WIB y FITC&DAPI) de la empresa Olympus y las tres imágenes obtenidas. Filtros espectros imagen WU Se detecta la emisión de DAPI pero no la de FITC por su baja excitación. 9
WIB Se detecta la emisión de FITC pero no la de DAPI pues no es excitado. FITC & DAPI El filtro de dos bandas FITC y DAPI permite la correcta excitación y detección simultánea de FITC y DAPI. técnica Contraste de fases + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la de contraste de fases y la tercera a la combinada. Interferencial de Nomarski + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la interferencial de Nomarski y la tercera a la combinada. estructura de los grupos ópticos imagen En numerosas ocasiones es muy conveniente combinar la observación de la preparación con dos técnicas diferentes, una panorámica que informe del aspecto general de la misma (por ejemplo microscopía de contraste de fases o microscopía interferencial) y una segunda que nos dé una imagen específica de uno o pocos componentes (por ej. la microscopía de fluorescencia). A continuación tienes dos ejemplos de estas técnicas combinadas. Microscopía de fluorescencia confocal La observación microscópica es posible cuando se dispone de objetos pequeños o de secciones finas del material a observar. Dependiendo de las condiciones de la observación se observa simultáneamente un cierto grosor de la muestra (profundidad de campo). En las observaciones con el microscopio de fluorescencia puede suponer observar al mismo tiempo todo el grosor de una célula. La discriminación en planos o imágenes independientes siempre es posible, aunque técnicamente complejo, mediante la obtención de secciones correspondientes a planos consecutivos. La microscopía de fluorescencia confocal aporta otra solución mucho más directa. Mediante el empleo de fuentes de iluminación de gran intensidad y sincrónicas, de un juego de diafragmas y de un sistema de captación de imagen electrónico, permite la obtención de imágenes de finas secciones ópticas. A partir de series de secciones ópticas de este tipo obtenidas a diferentes profundidades, archivadas en un ordenador, resulta posible reconstruir una imagen tridimensional. A pesar de que los detalles ópticos del microscopio de fluorescencia confocal son complejos, la idea es sencilla. El sistema óptico del microscopio, generalmente fluorescente, no ilumina toda la preparación a la vez, sino que en cada momento sólo ilumina un pequeño punto a una cierta profundidad de la muestra. Para ello se necesitan fuentes luminosas de gran potencia, habitualmente haces láser, cuya luz pasa a través de un diafragma. La luz fluorescente emitida por la preparación se recoge y produce una imagen a la entrada de un 10
fotodetector adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar que es confocal con el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el punto iluminado de la muestra quedan enfocados. La luz que procede de ese punto penetra en el detecto, mientras que la que procede de otras regiones de la muestra queda fuera de foco en el diafragma y no es detectada. La muestra es barrida por el punto luminoso de una manera similar al barrido que forma la imagen en una pantalla de TV. La imagen bidimensional, digital, se forma al almacenar en una matriz numérica las intensidades luminosas medidas en cada uno de los puntos del barrido. La imagen en un microscopio confocal se forma en un sistema electrónico y se genera uno o más ficheros que contienen tanto las imágenes obtenidas como la información acerca de las condiciones en que se han tomado. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA 2. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA 3. COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFLUORÓMETROS: FUENTES FILTROS Y MONOCROMADORES CUBETAS PORTAMUESTRAS DETECTORES 4. DISEÑO DE INSTRUMENTOS FLUORÓMETROS DE FILTRO ESPECTRO DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN ESPECTROFLUORÓMETRO. MONOCROMACIÓN DOBLE. ESPECTROFLUORÓMETRO DE FLUORESCENCIA DE DOBLE HAZ 5. PRINCIPIO DE LA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA CONFOCAL BIBLIOGRAFÍA PRINCIPIOS DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL SKOOG/HOLLER/NIEMAN EDITORIL MC GRAW HILL QUINTA EDICIÓN ANÁLISIS INSTRUMENTAL SKOOG/LEARY EDITORIAL MC GRAW HILL CUARTA EDICIÓN ANÁLISIS INSTRUMENTAL D.A.WEST/D.A.SKOOG EDITORIL MC GRAW HILL TÉCNICAS INSTRUMENTALES EN FARMACIA Y CIENCIAS DE LA SALUD Dr. ORIOL VALLS/Dr. BENITO DEL CASTILLO EDICIONES PIROS CUARTA EDICIÓN 11
MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS WILLAR/LYNNE J. MERRIT/JOHN DEAN/FRAN A. SETTLE EDITORIAL IBEROAMERICANA www.ub.es/biocel/wbc/técnicas/mfluorescencia.htm 12