Evaluación de metodologías de detección de elementos transgénicos en campo: elección y validación de una técnica sensible, específica y de bajo costo. Responsable Técnico: Dra Gracia Alicia Gómez Anduro Primer informe de actividades: CIBIOGEM-CONACyT 234606 Etapa: 001 Nombre: Extracción de ADN Compromisos de la etapa: Etapa Nombre de la etapa Descripción Descripción de la de la etapa meta Actividades Productos comprometidos Producto cumplido Costo de la etapa Surgió algún cambio? Justificación 001 2 meses Extracción de ADN Extraer el material de ADN para la búsqueda Se de elementos obtendrá el transgénicos con ADN que se las 5 requiere herramientas para los propuestas en análisis de éste proyecto la siguiente (ELISA, etapa inmunodetección en tiras, PCR, microarreglos y LAMP) - Muestreos de campo en Sonora y Yucatan para la recolección de material - Muestreo de productos procesados de maíz, de comercios locales -Extracción de ADN por método casero y kit -Evaluación de la integridad del ADN - Cuantificación - Base de datos del análisis de los principales elementos transgénicos encontrados en México -colección de material genético de muestras ciegas de hojas, semillas y productos procesados de maíz -material genético controles -Base de datos en programa CIB_GM Scanner 1.1 que facilitaran la búsqueda de información -Colección de ADN de productos procesados, de semillas de Guanajuato y B.C.S, Sonora y Yucatan -Material control de SENASICA Gasto inversión: $200,000 congelador de -20 vertical:20,000 Fotodocumentador: 180,000 Gasto corriente: $343,000 pago de paquetería DHL para envío de muestras de los estados de Sonora y Yucatán ($1000) Pago de honorarios: 40,000 Insumos de laboratorio:300,000 Salidas de campo: 2000 Cambios en gasto de inversión: No se comprará el fotodocumentador puesto que se adquirió con otro proyecto, pero se solicitan otros equipos que serán de uso exclusivo para material OGM para evitar contaminación de controles negativos puesto que la técnica LAMP es muy sensible congelador de -20 vertical:20,000 Rotor de centrifuga $10,000 2 cámaras de electroforesis $5300 c/u=10,600 Juego de micropipetas 23149.13 Pockit combo: Es un equipo económico para PCR en campo, se solicitará al fondo con la finalidad de compararlo con la
técnica propuesta en éste proyecto Termociclador $69,613 Gasto corriente: $343,000 Ejercido, pago de honorarios: 40,000 Paquetería DHL solo se ha usado para Yucatán (500) SIN EJERCER TOTALMENTE Insumos de laboratorio: 300,000 Salidas de campo: 2000 1. INTRODUCCIÓN El presente reporte presenta la construcción del programa CIB_GM scanner 1.0 (Video tutorial de lo que el programa puede hacer disponible en: https://dl.dropboxusercontent.com/u/11521688/videotutorial%20cib.mp4) que facilitarán la búsqueda de elementos transgénicos y eventos por estado, por año en nuestro país, material que se está utilizando para escribir un artículo de meta_análisis de la distribución de elementos transgénicos en México. Igualmente describe la obtención de las muestras de alimentos procesados, controles positivos y negativos de transformación genética y su extracción de ADN para su posterior análisis de elementos transgénicos con las 5 herramientas de diagnóstico propuestas en este proyecto (ELISA, inmunodetección en tiras, PCR, microarreglos y LAMP). La segunda etapa del proyecto contempla la estandarización de un kit de detección de elementos transgénicos en campo, para lo cual se contempla un prototipo computarizado, sin embargo, encontramos comercialmente un aparato para PCR en campo (Pockit combo) de bajo costo. Por lo que proponemos para ésta propuesta hacer la detección mediante una tecnología basado en reacciones químicas exotérmicas y comparar la sensibilidad de nuestro kit, con el equipo existente, además de lo que se había propuesto anteriormente. La meta, es tener la protección intelectual de un kit sencillo de detección
de OGMs en campo y hacer la transferencia de tecnología al SENASICA para acelerar el trabajo del personal de monitoreo de campo y disminuir el numero de muestras que tengan que enviarse al Laboratorio Nacional de Referencia. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Programa CIB_GM Scanner 1.0 Es una aplicación que permite automatizar el proceso de búsqueda de elementos transgénicos a partir de la página de biosafetyscanner.org permitiendo hacer consultas mucho más rápidas y generando la información directamente en una tabla de Excel.
2.2. Muestras Se adquirieron 22 alimentos altamente procesados de comercios locales en La Paz, B.C.S. conteniendo maíz, arroz y trigo; 10 harinas de trigo y maíz, siete frituras de trigo y maíz y 5 cereales de maíz, arroz y trigo, así como semillas de cultivos de maíz, soya, trigo y arroz, las cuales fueron desinfectadas, hidratadas y germinadas en confinamiento en el laboratorio de Biología Molecular de Plantas (CIBNOR) por 5 días (Tabla I). Como controles positivos de transformación genética se adquirió ADN de referencia de SENASICA (Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria) (Tabla II). Como controles negativos se obtuvieron 18 muestras de semillas de vitamaíz del Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados Unidad Irapuato, del Instituto Politécnico Nacional (IPN), las cuales también fueron desinfectadas, hidratadas y germinadas en confinamiento en el laboratorio (Tabla III).
Tabla I. Muestras de alimentos altamente procesados y semillas de cultivos de maíz, soya, trigo y arroz. Muestras Clave Estado de colecta H1 Harinas de maíz y trigo H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 B.C.S. C1 Cereales de maíz y trigo C2 C3 C4 C5 B.C.S. F1 F2 Frituras de maíz, trigo y arroz F3 F4 B.C.S. F5 F6 F7 ADN genómico de maíz 1 B.C.S. ADN genómico de soya 2 B.C.S. ADN genómico de trigo 3 B.C.S. ADN genómico de arroz 4 B.C.S. ADN de maíz transgénico 5 (PBI121) B.C.S. ADN de alfalfa transgénica (pmdc32) 6 B.C.S.
Tabla II. Materiales de Referencia de construcciones transgénicas. Especie Zea mays Gossypium hirsutum Glycne max Material de Estado de Evento Referencia colecta 36 DAS-1507-1 46 MON-87460-4 100 Z. mays convencional 111 DAS-59122-7 119 MON-00021-9 120 SYN-BT011-1 122 SYN-IR162-4 125 SYN-IR604-5 Distrito Federal 142 MON-89034-3 x MON- 00603-6 167 MON-00603-6 169 MON-00810-6 232 MON-88017-3 x MON- 89034-3 305 MON-00863-5 308 MON-88017-3 887 SYN-EV176 134 MON-15985-7 x MON- Distrito Federal 88913-8 185 MON-88913-8 89 MON-01445-3 278 DAS-24236-5 x DAS-21023-5 c- G. hirsutum convencional 174 G. max convencional Distrito Federal 314 MON-04032-6 460 DP-356043-5 Oryza sativa 848 O. sativa convencional Distrito Federal MON-00179-5 x MON- Distrito Federal Medicago sativa 879 00101-8 Triticum aestivum 161 T. aestivum convencional Distrito Federal
Tabla III. Claves de 18 muestras de semillas de vitamaíz proporcionadas por el Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados Unidad Irapuato, del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Entrada Stock ID Nombre Origen Estado de colecta 2 VITA102-005 VitW104 VA14A-Lineas-5 3 VITA102-019 VITY201 VA14A-Lineas-19 4 VITA102-21 VITY202 VA14A-Lineas-21 5 VITA102-025 VITQ302 VA14A-Lineas-25 6 VITA102-044 OPVDTPLPS VA14A-Lineas-44 7 VITA102-046 OPVDTPLPS VA14A-Lineas-046 8 VITA102-048 OPVDTPLPS VA14A-Lineas-48 9 VITA102-050 OPVDTPLPS VA14A-Lineas-50 10 VITA102-052 OPVDTPYTL VA14A-Lineas-52 11 VITA102-056 PSF86CML449 VA14A-Lineas-56 12 VITA102-058 LPSF103 VA14A-Lineas-58 13 VITA102-060 Tester B VA14A-Lineas-60 14 VITA102-062 Tester B VA14A-lineas-62 15 VITA102-064 QMP Tester B VA14A-Lineas-64 16 VITA102-066 Tester A VA14A-Lineas-66 17 VITA102-088 QPM VA14A-Lineas-88 18 VITA102-099 Subtropy Tester VA14A-Lineas-99 A 19 VITA102-101 Subtropy Y B VA14A-Lineas-101 Guanajuato
2.3 Extracción de ADN El ADN genómico de los cultivos de maíz, soya, trigo y arroz, así como de las muestras de vitamaíz fue extraído por el método de CTAB al 2% (Zhan et al., 1998). Para ello, 0.5 gr de tejido foliar de cada muestra fue macerado y homogenizado en morteros estériles. La extracción del ADN de los productos altamente procesados también se realizó por el método de CTAB al 2% con algunas modificaciones. Para ello, 2 gr de cada muestra fueron incubados por 1 hr a 60 C con 10 ml del Buffer de extracción CTAB (0.1 M Tris-HCL, 20 g/l CTAB, 1.4 M NaCl y 20 mm NA 2 EDTA, ph 8.0), posteriormente se agregaron 15 µl de proteinasa K a un mililitro de esta suspensión permaneciendo a 60 C por 1 hr. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 15000 rpm (5 min a temperatura ambiente), el sobrenadante fue mezclado con 600 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (PCI 25:24:1), y centrifugado a 15000 rpm (10 min a temperatura ambiente). Este último paso fue repetido dos veces más, para un total de tres extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamilico. La fase acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se adicionaron 500 µl de isopropanol a -20 C mezclando por inversión, las muestras se almacenaron a -20 C toda la noche. Los tubos fueron centrifugados a 11000 rpm (20 min a 4 C) y el pellet fue resuspendido en 100 µl de agua Miliq estéril mediante incubación a 60 C por 1 hr. Se agregaron 5 µl de RNAsa a cada tubo y se incubaron a 37 C por 1 hr. Se agregaron 200 µl de cloroformo:alcohol isoamilico (CIA 24:1), los tubos se agitaron vigorosamente por 60 segundos y se centrifugo a 11000 rpm (10 min a temperatura ambiente). Este último paso se repitió una segunda ocasión, para un total de dos extracciones con cloroformo:alcohol isoamilico. La fase acuosa fue transferida a un tubo nuevo, se adicionaron 50 µl de acetato de amonio 7.5 mm, se mezcló por inversión y se agregaron dos volúmenes de etanol al 100% se mezcló por inversión y se almacenaron a - 20 C por 1 hr. Finalmente las muestras se centrifugaron a 11000 rpm (20 min a 4 C), la pastilla de ADN fue lavada dos veces con 1 ml de etanol al 70% el etanol y resuspendida en 50 μl de agua Miliq esteril. Por último, se cuantificó la concentración de ADN mediante el uso de un espectrofotómetro (NanoDrop ND-100).
3. RESULTADOS 3.1. Base de datos de elementos transgénicos La base de datos se tiene organizada dentro del programa CIB_GM Scanner 1.1. El programa está basado en datos estadísticos de CIBIOGEM y SENASICA en cuanto a eventos permitidos y liberados. El programa hace la conexión con la página: http://en.biosafetyscanner.org/index.php para obtener la lista de los eventos por OECD UI para establecer los elementos transgénicos presentes en cada evento, así se facilita el análisis de elemento trangénico por estado, por año, tipo de liberación etc. Una vez localizado el evento, el sistema establece la conexión y obtiene los elementos por los que está conformado el evento. Al finalizar el proceso CIB_GM Scanner genera un archivo de Excel con los componentes organizados del evento y mostrara una leyenda de que el proceso ha finalizado generando el archivo de Excel.
El archivo ordena por columnas el Evento, Construcciones y Elementos, mostrando en la primera columna el evento con su enlace para ir directamente a la página de biosafetyscanner de donde se obtuvo la información.
Se hizo una actualización del programa CIB_GM Scanner 1.1, el cual permite identificar los elementos que existen por estado de la república Mexicana, por año, información que se presenta por el programa en hojas Excel para poder hacer gráficos o análisis correspondientes. Por ejemplo en Chiapas del 2008 al 2009 hubo 28000 permisos de liberación, en donde en ésos años los elementos transgénicos más comunes fueron p-e35s, cp4epsps, 3 nos y ctp4 que aparecen 2 veces cada uno puesto que se sembró el mismo evento en 2008 y 2009. En el caso de Baja California Sur, en donde las hectáreas totales fueron 369, con permiso de liberación 24, y los elementos transgénicos más comunes fueron: 3 nos, I-rAct-1, p- e35s que aparecen 27 veces, seguidos de: cp4epsps y ctp2 que aparecen 18 veces.
El programa sigue en proceso de mejoras y el material de análisis que se está obteniendo se presentará como publicación de meta_análisis de los elementos transgénicos en México. 3.2. Calidad del ADN Se realizaron extracciones de ADN de las muestra de alimentos procesados (Figura 1 y Figura 2), de muestras de semillas de maíz, trigo, soya y arroz (Figura 3) y controles negativos de transformación genética (Figura4).
Figura 1. Gel de electroforesis de agarosa al 1% de ADN de harinas y cereales. En donde, M: es el marcador de peso molecular de 1 kb plus, H1: harina de trigo, H2: harina de maíz, H3: harina de maíz, H4: harina de trigo; Carril 5, H5: harina de trigo, H6: harina de trigo, H7:harina de trigo, H8: harina de maíz, H9: harina de maíz, H10: harina de trigo, C1: cereal de maíz y trigo, C2: cereal de trigo, C3: cereal de trigo y arroz, C4: cereal de trigo y arroz, C5: cereal de maíz y trigo. M F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 12 Kb Figura 2. Gel de electroforesis de agarosa al 1% de ADN de frituras. En donde, M: es el marcador de peso molecular de 1 kb plus, F1: frituras de maíz, F2: frituras de maíz, F3: frituras de maíz, F4: frituras de maíz, F5: frituras de maíz, F6: frituras de maíz, F7: frituras de maíz.
M 1 2 3 4 5 6 12 Kb Figura 3. Gel de electroforesis de agarosa al 1% de ADN de muestras de semillas y controles positivos de transformación del laboratorio de Biología Molecular de Plantas. En donde, M: es el marcador de peso molecular de 1 kb plus, 1: ADN genómico de maíz, 2: ADN genómico de soya, 3: ADN genómico de trigo, 4: ADN genómico de arroz, 5: ADN de maíz transgénico (PBI121), 6: ADN de alfalfa transgénica (pmdc32). 12 Kb Figura 4. Gel de electroforesis de agarosa al 1% de ADN de 18 muestras de vitamaíz. En donde, M: es el marcador de peso molecular de 1 kb plus, 1-18: ADN genómico de maíz.
4. CONCLUSION Se cuenta con un programa que facilita el análisis y manejo de datos de los principales elementos transgénicos en México, se obtuvo el material genético de 70 muestras en total; 22 muestras de productos procesados de maíz, trigo y arroz, 4 muestras ciegas de semillas de maíz, trigo, arroz y soya, 26 muestras de materiales de referencia de construcciones transgénicas de maíz, algodón, soya, arroz, alfalfa y trigo y 18 muestras de vitamaíz como controles negativos de transformación genética. 5. RESUMEN DE PRODUCTOS DE LA ETAPA I (entregables) * Colección de material genético de muestras ciegas de semillas y productos procesados. * Colección de material genético de controles positivos y negativos de transformación. * Base de datos del análisis de los principales elementos transgénicos encontrados en México, mediante el programa CIB_GM scanner 1.0 (Video tutorial de lo que el programa puede hacer disponible en: https://dl.dropboxusercontent.com/u/11521688/videotutorial%20cib.mp4 ) que facilitarán la búsqueda de elementos transgénicos y eventos por estado en nuestro país, utilizando las bases de datos disponibles. Con éste material se está preparando un artículo de meta_análisis de los elementos transgénicos en México.