Curso Posgrado 2014 Dra. María Gabriela Lacoste
EldiseñodelosprimersparaunaPCResFUNDAMENTAL. Longitud Especificidad Temperatura de Hibridación Complementariedad de secuencias Contendido GC
Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo. SECUENCIA CORRECTA!!
La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD Por ejemplo: Hay una probabilidad de ¼ (4-1 ) de encontrar una A, G, C o T en una secuencia dada. Hayunaprobabilidadde1/16(4-2 )deencontrarunasecuenciadedinucleótidos. Hay una probabilidad de 1/256 (4-4 ) de encontrar una secuencia de tetranucleótidos. Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente una vezcada4-17 basesoaproximadamente17billonesdebases. LONGITUD IDEAL: 18-24 nt Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento
Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer. T annealing depende de la Temperatura de melting o fusión(tm) de los primers. Tm=temperaturaalacuallamitaddelasmoléculasdeprimerestánapareadas coneladnmolde. Tm=2(A+T) + 4(G+C) Tm longitud contenido GC BAJO RENDIMIENTO O NO AMPLIFICACION Los primers no deben tener T a muy diferentesentresi(nomasde5 C). OPTIMA T annealing: 5 C por debajo del Tm más bajo del par de primers(t a=al menos 50 C) T annealing INESPECIFICIDAD
40-60% CONTENIDO GC AseguralauniónestableentreelprimeryelADNtemplado Evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas PoliT, PoliA o PoliA/T unión más débil: se puede separar el complejo primer-templado en esa zona. PoliC, PoliG o PoliG/C unión más fuerte: hibridación no específica.
GoCenelextremo3 Elongación empieza en el extremo 3 del primer. Aseguralaunióncorrectadel primeralmolde enelextremo3 (unión más fuerte que A/T) aumenta la eficiencia de la reacción PROBLEMA: Si el extremo 3 tiene 3 o mas G/C se puede unir establemente a casi cualquier secuencia con tres G/C. IDEAL: Extremo5 estable con1o2basesg/cyextremo3 connomas deunabaseg/c
Complementariedad intra-primer Más de 3 pb: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doble cadena interfiere con el annealing al ADN templado.
Complementariedad inter-primer Formación de dímeros competencia disminuye la formación de producto por
BUSQUEDA DE LA SECUENCIA DE INTERÉS Y DISEÑO DE PRIMERS CON PRIMER-BLAST National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Si queremos buscar un gen completo, por ejemplo, el CFTR humano 2 3 1
OMIM: información acerca de la asociación del gen con enfermedades humanas
EnestecasoelgenesdemasiadograndeparaelprogramaPrimer BLAST, por lo que tenemos que buscar un fragmento menor de interés dentro del gen.
Si queremos buscar un fragmento del gen, por ejemplo, el exón 10 del CFTR humano 2 3 1
Seleccionar el tamaño de amplicón deseado
Elegimos pares de primers para controlar estructura secundaria y alineación.
OTROS PROGRAMAS DE DISEÑO DE PRIMERS PrimerQuest: http://www.idtdna.com/primerquest/home/index
COMO UBICAR MI PRIMER EN LA SECUENCIA Forward ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5 3 Reverse OJO!!!! ACCGATTGAATATGGAGCCAA 5 3 AACCGAGGTATAAGTTAGCCA 3 5 TTGGCTCCATATTCAATCGGT complementaria ORIGIN 901 gcagagtacc tgaaacagga agtattttaa atattttgaa tcaaatgagt taatagaatc 961 tttacaaata agaatataca cttctgctta ggatgataat tggaggcaag tgaatcctga 1021 gcgtgatttg ataatgacct aataatgatg ggttttattt ccagacttca cttctaatga 1081 tgattatggg agaactggag ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat 1141 tctgttctca gttttcctgg attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc atctttggtg 1201 tttcctatga tgaatataga tacagaagcg tcatcaaagc atgccaacta gaagaggtaa 1261 gaaactatgt gaaaactttt tgattatgca tatgaaccct tcacactacc caaattatat 1321 atttggctcc atattcaatc ggttagtcta catatattta tgtttcctct atgggtaagc 1381 tactgtgaat ggatcaatta ataaaacaca tgacctatgc tttaagaagc ttgcaaacac 1441 atgaaataaa tgcaatttat tttttaaata atgggttcat ttgatcacaa taaatgcatt 1501 ttatgaaatg gtgagaattt tgttcactca ttagtgagac aaacgtcctc aatggttatt 1561 tatatggcat gcatataagt gatatgtggt atctttttaa aagataccac aaaatatgca
ANALISIS DE PRIMERS
OLIGO ANALYZER 3.1 Analizamos el Primer FORWARD
Parámetros generales
Hairpin El Tm debe ser menor que la temperatura de annealing propuesta para la reacción. Se sugiere que el Tm del hairpin debeseralmenos 50 CmenorquelaTdeannealing.
Self-Dimer Elvalorde Gdebeestarentre0y-9kcal/mol.
Hetero-Dimer Copiamos la secuencia del primer reverse
Hetero-Dimer Elvalorde Gdebeestarentre0y-9kcal/mol.
NCBI Blast Alineamos nuestro primer con la base de datos, para comparar su similitud con otras secuencias.
Repetimos el procedimiento con el primer REVERSE y también podemos analizar otros pares de primers propuestos por el programa de diseño hasta seleccionar el par que cumpla con las mejores características