A. Anexo: Extracción de dsrna por columnas de exclusión de Sephadex G-50 (Tomado de Guzmán, 1994; Rodríguez, 2006) 1. En un tubo eppendorf tapa rosca estéril colocar 100 mg de material vegetal pulverizado en nitrógeno líquido. 2. Adicionar 250 µl de buffer de extracción (Tris ph 8.0 0.1 M, SDS 2%, EDTA 2Mm), 250 µl de fenol (saturado en Tris ph 8.0) y 250 µl de Cloroformo. Mezclar en vortex 3. Incubar a 70 C por 5 minutos, mezclar en vortex y llevar a hielo 4. Centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos 5. Transferir cuidadosamente el sobrenadante (con la precaución de no tomar de la interfase) a un nuevo tubo eppendorf tapa rosca estéril. (Si no se usa inmediatamente congelar en nitrógeno liquido y almacenar a -20 C) 6. Alistar columnas plásticas de 1ml con tapones de algodón estéril en la punta 7. Adicionar sephadex (2.5gr de sephadex G-50 en 50 ml de buffer TE ph 8.0 autoclavado, con dos lavados en buffer TE y almacenado a 4 C) con pipeta Pasteur hasta completar el volumen de la columna sin hacer burbujas. Centrifugar 900rpm por 4 minutos (repetir varias veces hasta que la columna tenga el volumen de 1 ml) 8. Cuando las columnas se encuentren listas realizar 2 lavados con 150 µl de TE centrifugando entre cada lavado 9. Colocar tubos eppendorf estériles (sin tapas y debidamente marcados) dentro de tubos falcon de 15ml y dentro de estos las columnas plásticas de 1 ml 10. Cargar el sobrenadante obtenido en el paso 5 en las columnas y centrifugar 900rpm por 4 minutos. 11. Descartar las columnas plásticas y recolectar los tubos eppendorf con el extracto (dsrna) purificado 12. Almacenar a -20 C o a -80 C 116
B. Anexo: Condiciones reacción RT-PCR RT Casa comercial Concentración inicial Concentración final Buffer Epicentre 10X 1X dntps Bioline 10mM 1mM Primer R Invitrogen 10µM 0.24µM Agua RNA sin Fermentas 40U/µl 4U MMLV Epicentre 200Uµl 20U Molde Volumen final Programa termociclador: 42 C por una hora PCR Casa comercial Concentración inicial Buffer Bioline 10X 1X MgCl 2 Bioline 50Mm 1mM dntps Bioline 10Mm 0.4mM Primer F Invitrogen 10µM 0.4µM Primer R Invitrogen 10µM 0.4µM Agua DNA pol Molde Volumen final Bioline Acuzyme 2.5U/µl Concentración final 3.75U Biolasa 5U/µl 1.875U Perfil térmico: GEN PROGRAMA Tº Y TIEMPO Nº CICLOS Denaturación inicial 94ºC por 3 minutos Hsp70 Denaturación 94ºC por 1 minuto CP Annealing 55ºC por 1 minuto 35 ciclos Extensión 68ºC por 1 minuto Extensión final 68ºC por 10 minutos Denaturación inicial 94ºC por 3 minutos Denaturación 94ºC por 1 minuto CPm Annealing 55ºC por 1 minuto 35 ciclos Extensión 68ºC por 1:30 minutos Extensión final 68ºC por 10 minutos 117
C. Anexo: Digestión virtual con la enzima BstYI del gen CPm y EcoRI del gen Hsp70 (Programa NEBCutter) GEN CPm Cortes de la enzima BstyI: 636nt 1164nt 1786nt GEN Hsp70h Corte de la enzima EcoRI: 924nt 118
D. Anexo: Protocolo de purificación de productos de PCR 119
E. Anexo: Protocolo para cuantificación con QUBIT TM 120
F. Anexo: Tinción con plata 1. Fijación toda la noche a 4 C: Acido acético 10% Agua HPLC 3 ml 27 ml Formaldehído 45 µl 2. Dejar en agitación 1 hora. 3. Etanol 50% en agua HPLC por 20 minutos en agitación 4. Tres lavados: Tiosulfato de sodio (1g/Lt) por 20 segundos c/u en agitación. 5. Tres lavados: Con agua HPLC por 20 segundos c/u en agitación. 6. Tinción, 1 hora en agitación y en oscuridad: Nitrato de plata Agua HPLC 0.06 gr 30 ml Formaldehído 45 µl 7. Dos lavados: Con agua HPLC por 20 segundos c/u en agitación 8. Revelado: Carbonato de sodio 3.6 gr Tiosulfato de sodio Agua HPLC 1.2 ml 60 ml Formaldehído 45 µl 9. Detección de la reacción: Acido acético 10% Agua HPLC 3 ml 27 ml Formaldehído 45 µl Nota. Revisar fichas de seguridad para el adecuado manejo de los reactivos. 121
G. Anexo: Identificación de perfiles de SSCP por programa Quantiti One 122
H. Anexo: Alineamiento de secuencias nucleotídicas del gen Hsp70 en S. tuberosum Grupo Andígena 123
124
125
I. Anexo: Alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen Hsp70 en S. tuberosum Grupo Andígena 126
J. Anexo: Alineamiento de secuencias nucleotídicas del gen CPm en S. tuberosum Grupo Phureja 127
128
129
130
K. Anexo: Alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CPm de S.tuberosum Grupo Phureja 131
132
L. Anexo: Alineamiento de secuencias nucleotídicas del gen CPm en S. tuberosum Grupo Andígena 133
134
135
136
M. Anexo: Alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CPm de S.tuberosum Grupo Andígena 137
138
N. Anexo: Alineamiento de secuencias nucleotidicas del gen CP en S. tuberosum Grupo Phureja 139
O. Anexo: Alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CP en S. tuberosum Grupo Phureja 140
P. Anexo: Alineamiento de secuencias nucleotidicas del gen CP en S. tuberosum Grupo Andígena 141
Q. Anexo: Alineamientos de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CP en S. tuberosum Grupo Andígena 142