Diagnóstico de PRRSV : su importancia Fernando A. Osorio Professor Nebraska Center for Virology and School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences University of Nebraska-Lincoln fosorio1@unl.edu Esta platica incluirá: Diagnostico serológico Diagnostico por aislamiento viral Diagnostico molecular
PRRSV en un cerdo : Efectividad de diferentes tecnicas de diagnostico en diferentes fases de la infeccion Diagnos(co Infeccion por bioensayo o cerdos cen(nelas Carga viral en tejidos Infeccion con PRRSV Viremia Diagnos(co por necropsia y muestreo de animales clinicamente infectados: PCR/AV/IHC/ISH Respuesta total de An@cuerpos (ELISA Idexx) 0 1 mo. 2 mos. +/- 5 mos. +1 yr Diagnos(co por serologia ELISA en suero o fluidos orales Diagnos(co viremia PCR/Aislamiento Viral Diagnos(co Infeccion por analisis de fluidos orales PCR
Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA Singleton
Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA Alternativas: 1. Repetir ensayo (singleton y sus contactos) 2.Ensayo serologico alternativo Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ELISAs de bloqueo o competitivas 3. Bio-ensayo in vivo
Immunofluorescencia Indirecta para Serologia de PRRSV 3. Ig andti-ig procina marcada con fluoresceina 2. Suero del porcino 1. Celulas infectadas con PRRSV y fijadas (Ag)
Animales Reactores Positivos Unicos al PRRS ELISA Resultado del Primer test de ELISA Posibles resultados de la repeticion del ensayo
Deteccion de PRRSV Por bio-ensayo Cerdo 1: Sospechado de infeccion Necropsia: Linfonodos Pulmon Tonsilas Bazo/Otros tejidos Homogenaado del pool de tejidos Cerdo 2: 100% susceptible (libre de PRRSV) Inoculacion IP /IM ELISA sseroconverssion Viremia Respuesta positiva en Cerdo 2
Que lineas celulares se pueden usar para aislar PRRSV de muestras clinicas? MARC celulas de riñón de mono (Kwang et al 1993) riñón Macrofagos alveolares del cerdo ZMAC Cells 18h ZMAC Zuckermann et al (UIUC, 2010) No inoculadas Inoculadas con PRRSV
Eficiencia superior de la linea macrofagica porcina ZMAC para aislar PRRSV, comparada con las celulas MARC-145 y los cultivos de macrofagos alveolares (PAM) Cortesia de Dr. Federico Zuckermann (UIUC)
Aislamiento de PRRSV en celulas Practicidad vs. Eficacia Pros Contras Celulas MARC 145 Cul(vos de Macrofagos Alveolares Porcinos ( PAM) Linea celular mas accesible a laboratorios Sensibles a las mayoria de cepas de PRRSV No son sensibles a muchas cepas de PRRSV Solo 30 % de las PAM replican PRRSV Dificiles de preparar Linea de macrofagos porcinos ZMAC MUY sensibles a la mayoria de cepas de PRRSV/Op(ma sensibilidad Mas dificiles de crecer mantener y estandardizar en diferentes laboratorios
RT-PCR para deteccion de PRRSV RT PRRSV PRRSV RNA PRRSV cdna PCR
Plataforma Para el Test de PCR Tiempo Real Cepheid Smart Cycler Cortesia Dra. Jane Christopher- Hennings SDSU
Reac(vos listos para su uso. pre- montados en el tubo de reaccion y liofilizados Cortesia Dra. Jane Christopher- Hennings SDSU
Presentacion como kit comercial Cortesia Dra. Jane Christopher- Hennings SDSU
Principio de Accion de la 5 nuclease (Real- Time) PCR Argon Laser Add polymerase, dntps, primers, and Taqman probe Begin PCR Charge coupled device DNA denature R R Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA anneal Cortesia Dra. Jane Christopher- Hennings SDSU
Principio de accion del sistema de faro molecular ( molecular beacon )para Real- Add polymerase, dntps, primers, and molecular beacon Time PCR Argon Laser Charge coupled device DNA Molecular beacon R Q R Q Each reporter dye represents one strand of amplified DNA Cortesia Dra. Jane Christopher- Hennings SDSU
Results North American PRRSV Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Curva estandar para cuantificar ARN de PRRSV Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Muestras de campo (semen). Curva de amplificacion Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Carga viral en suero y semen por PCR Boar 1 Boar 2 10000000 10000000 copies/ml 100000 1000 copies/ml 100000 1000 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 Days post inoculation 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 Days post inoculation Boar 3 Boar 4 10000000 10000000 copies/ml 100000 1000 copies/ml 100000 1000 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 Days post inoculation 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 Days post inoculation Boar 5 Boar 6 10000000 10000000 copies/ml 100000 1000 copies/ml 100000 1000 10 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 1 5 10 15 19 24 29 36 44 58 72 86 Days post inoculation Days post inoculation 10 Cortesia Dra. Jane Christopher-Hennings SDSU
Cuantificacion molecular de PRRSV in vivo (viremia) PCR cuantitativa de ultima generacion: PCR digital a gotita (droplet digital PCR ddpcr) La muestra amplificar es dividida en 20.000 goticulas identicas ( los DNAs background y el target se distribuyen aleatoriamente) positiva negativa Amplificacion cada gota es una medicion digital independiente Resultado : X copias target (concentracion directa)