5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México PRODUCCIÓN DE β-glucosidasa MEDIANTE FERMENTACIÓN SUMERGIDA POR ASPERGILLUS NIGER CDBB-H-176 Cristian Alarid García a, Marcos Daniel González Llanes a, Jesús Raúl Ortiz del Castillo b, Eleazar Máximo Escamilla Silva a, * a Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y García Cubas S/N, Celaya, Guanajuato, C.P. 381, México. cristian.alarid@iqcelaya.itc.mx b Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, Ave. de las Américas y Josefa Ortiz de Domínguez, Culiacán, Sinaloa, C.P. 81, México. Resumen Se utilizó Aspergillus niger CDBB-H-176 para la producción de β-glucosidasa extracelular. Mediante la aplicación de un diseño experimental ortogonal (L 9 ) se optimizaron los parámetros del medio de cultivo que maximizara la actividad β-glucosidasa. Las condiciones óptimas una vez realizados 18 experimentos, fueron las siguientes: temperatura, 3 C; ph 6; agitación orbital, 2 rpm; concentración de sacarosa,.5% W/V. El valor máximo estadístico esperado con estas condiciones de trabajo fue de 652.4 U/mL, obteniéndose un valor experimental confirmatorio de 657.9 U/mL. Así mismo, se determinó la temperatura y el ph óptimo de la β-glucosidasa mediante ensayos enzimáticos; los cuales resultaron ser 6 C y un ph de 5.. Introducción La glucohidrolasa β-glucósido, más conocida como β-glucosidasa, pertenece a la familia de las β- glucanasas, y son responsables del catabolismo de una amplia gama de hidratos de carbono [1]. La β- glucosidasa ha sido ampliamente usada en la producción de bioetanol utilizando residuos agrícolas, tales como: rastrojo de maíz, paja y bagazo [2]. Diversos microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) han sido empleados para producir la enzima β-glucosidasa [3]. En el presente trabajo se utilizó la cepa fúngica Aspergillus niger CDBB-H-176. El objetivo principal fue optimizar los parámetros de cultivo para la máxima producción de β-glucosidasa. Metodología Se utilizó Aspergillus niger CDBB H-176, (CINVESTAV-IPN), México. El hongo se conservó en tubo inclinado de agar papa dextrosa (PDA) no comercial a 4 C y se resembró cada dos meses. El medio de fermentación utilizado para la producción de β-glucosidasa está basado en el reportado por Riou et al [4]. Inoculación y fermentación: La fermentación se llevó a cabo en matraz agitado erlenmeyer de 5 ml, y con un volumen de trabajo de 25 ml. Cada matraz fue inoculado con 2 ml de una resuspensión de esporas de los tubos inclinados. El proceso se llevó a cabo en una agitadora con control automático de temperatura y velocidad de agitación marca Lab. Companion SI-6R. Se utilizó un diseño experimental ortogonal, L 9 (con una réplica por experimento). Los factores a estudiar fueron los siguientes: A- temperatura (28-32 C), B-pH inicial del medio de cultivo (5-7), C-velocidad de agitación (-2 rpm) y D-concentración de sacarosa (.5-1.5 % W/V), el resto de los nutrientes del medio de cultivo se mantuvieron fijos, y el tiempo de fermentación fue de 4 días. La variable de respuesta fue la actividad enzimática β-glucosidasa. Ensayos enzimáticos: El ensayo de actividad β-glucosidasa fue basado en el procedimiento descrito por Riou et al [4], sin embargo, en este trabajo se le hicieron algunas modificaciones. Se mezcló.9 ml de 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-67-95593-3-5 1154
5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México p-nitro phenyl β-d-glucopyranoside (pnpg) 5 mm y 1 ml de una solución buffer de acetato de sodio.1 M ph 5.; posteriormente se le agregó.1 ml de la fuente enzimática (medio de cultivo filtrado). Enseguida se incubó a 5 C durante 3 minutos, y finalmente, la reacción fue detenida adicionando 3 ml de carbonato de sodio 1 M. El producto formado (p-nitro fenol) fue monitoreado a 42 nm. Una unidad de actividad β-glucosidasa corresponde a la generación de 1 µmol de p-nitro fenol min -1 bajo las condiciones de ensayo mencionadas arriba. La actividad β-glucosidasa extracelular fue reportada en unidades/ml/min del filtrado (U/mL). Resultados Las mejores condiciones experimentales resultaron ser las siguientes: temperatura, 3 C; ph 6; agitación orbital, 2 rpm; concentración de sacarosa,.5% W/V. El valor estadístico máximo esperado de β-glucosidasa con dichas condiciones de trabajo fue de 652.4 U/mL, obteniéndose un valor experimental confirmatorio de 657.9 U/mL. Las superficies de respuesta muestran que a niveles medios de ph y temperatura se alcanza la mayor actividad enzimática (Figura 1). Por otro lado, a niveles altos de agitación y niveles medios de temperatura se obtendría también la mayor actividad β-glucosidasa. (Figura 2). 2 - -2-3 4 3 2 Figura 1. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y B. Figura 2. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y C. Estos resultados muestran que el ph que reportó Riou et al [4] (ph 6), en su medio de cultivo, para la producción de β-glucosidasa también fue el mejor en este trabajo, a pesar de haber utilizado diferentes microorganismos. Así mismo, se puede observar que los valores más altos de actividad β-glucosidasa se obtienen al utilizar los niveles más bajos de concentración de sacarosa (Figura 3). Esto debido a que a menor concentración de fuente de carbono, los microorganismos agotan los nutrientes de manera más rápida; lo cual hace que A. niger CDBB-H-176 comience a producir enzimas que hidrolicen disacáridos y polisacáridos, buscando así su supervivencia. Finalmente, en la última superficie de respuesta de este trabajo, podemos apreciar que la manera de esperar la mayor producción de β-glucosidasa es con combinaciones de niveles altos de agitación y niveles bajos de sacarosa (Figura 4). Mediante este 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-67-95593-3-5 1155
5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México estudio se logró observar que a rpm de agitación orbital fueron demasiado bajos los valores de actividad β-glucosidasa, además que el crecimiento del hongo no fue homogéneo en el medio de cultivo; mientras que para las agitaciones de 15 y 2 rpm el crecimiento fue en forma de pellet, reflejado en una mejor producción enzimática (Tabla 1). 529.6854 5 4 3 2 7 6 5 4 3 2 Figura 3. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y D. Figura 4. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de C y D. Tabla 1. Efecto de los factores estudiados para la producción de β-glucosidasa. Agitación Temperatura, orbital, Sacarosa, C ph rpm % W/V Actividad β-glucosidasa, U/mL Exp 1 3 5 15 1.5.1933 2 32 6 1.5.435 3 3 7 1. 1.6682 4 28 7 2 1.5 93.6123 5 3 5 15 1.5.4345 6 28 6 15 1. 12.8269 7 32 6 1.5 1.366 8 28 6 15 1. 7.1866 9 28 7 2 1.5 32.2321 1 3 6 2.5 6.3268 11 3 6 2.5 74.5151 12 32 5 2 1. 4.1795 13 28 5.5 1.5872 14 32 5 2 1. 5.6115 15 32 7 15.5 11.9634 16 32 7 15.5 11.23 17 3 7 1. 5.3991 18 28 5.5 2.2461 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-67-95593-3-5 1156
5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México La Tabla 2 muestra el análisis de varianza para los datos de actividad β-glucosidasa, el cual arrojó que los cuatro factores estudiados fueron significativos en la variable de respuesta (confianza del 95%). El factor D (% W/W sacarosa) resultó el más significativo en el proceso; la siguiente variable en importancia fue el factor C (agitación orbital), seguida del factor B (ph); mientras que la variable con menor peso, pero significativa, fue el factor A (temperatura). Tabla 2. Análisis de varianza para la la producción de β-glucosidasa (diseño L 9 ). Factor SS df MS F p A-Temperatura 142333.3 2 71166.6 87.343.1 B-pH 155962.1 2 77981.1 95.664.1 C-Agitación 197992.2 2 98996.1 121.4444. D-% sacarosa 227622.5 2 113811.2 139.619. Error 7336.4 9 815.2 Total SS 731246.5 17 Respecto a los ensayos enzimáticos, se trabajó con el filtrado del caldo de fermentación obtenido a los 4 días de haber iniciado el experimento. Esto con la finalidad de comparar los valores óptimos de ph y temperatura que habían obtenido otros autores al caracterizar la enzima β-glucosidasa producida por microorganismos diferentes al que se utilizó en este trabajo. Para encontrar el ph óptimo se prepararon diferentes buffers (2 ph 7) para llevar a cabo los ensayos enzimáticos; en la Figura 5 se puede apreciar que el mejor amortiguador para llevar a cabo la reacción catalítica enzimática es el buffer de ph 5.. Mientras que para los buffers cercanos al óptimo se observa que son aproximadamente el 8% de éste valor. Ac#vidad rela#va, % 9 8 7 6 5 4 3 2 1 2 3 4 5 6 7 ph Figura 5. Efecto del ph sobre la actividad b-glucosidasa de A. niger CDBB-H-176 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-67-95593-3-5 1157
5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México Así mismo, se llevó a cabo un barrido de temperatura desde 5 hasta 9 C para encontrar la temperatura óptima que reflejara la mayor actividad β-glucosidasa. Se determinó que a 6 C es donde mayor actividad enzimática se presentó (Figura 6); mientras que para temperaturas menores a 4 C y/o mayores a 8 C, la enzima β-glucosidasa presenta una muy baja actividad. Ac#vidad rela#va, % 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 T, C Figura 6. Efecto de la temperatura sobre la actividad β-glucosidasa de A. niger CDBB-H-176 Conclusiones Los resultados muestran que el ph y la concentración de sacarosa que utilizaron Riou et al [4] en su trabajo, también son los óptimos para la producción de β-glucosidasa por Aspergillus niger CDBB-H- 176. El diseño experimental permitió observar que a 3 C y 2 rpm, se puede incrementar la producción de la enzima. Se estandarizó un método para la determinación de la actividad β-glucosidasa. Mediante la caracterización de la enzima, se pudo concluir que los valores óptimos de ph y temperatura para la actividad de β-glucosidasa producida por Aspergillus niger CDBB-H-176 son 5. y 6 C, respectivamente; valores muy similares a los reportados por Hui-Lei Yu et al [5]. Referencias 1. Schomburg D., Schomburg I., Class 3.2. Hydrolases VII. EC 3.2.1.1-3.2.1.47, Springer Handbook of Enzymes, Vol. 12, Ed. Dietmar Schomburg and Ida Schomburg, 23. 2. Bothast, R.J., Saha, B.C., Ethanol production from agricultural biomass substrates, Adv. Appl. Microbiol., Vol. 44, p. 261-286, 1997. 3. Saloheimo, M. et al, Enzymatic Properties and intracellular localization of the Noval Trichoderma reesei β-glucosidase BGL II (cel 1A), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, p. 4546-4553, 22. 4. Riou C. et al, Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose tolerant β-glucosidase from Aspergillus oryzae, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 64, p. 367-3614, 1998. 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-67-95593-3-5 1158