Tlamati Sabiduría, Vol. 8 Número Especial 3 (2017) 5 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT 12 Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación Acapulco, Guerrero 4, 5 y 6 de octubre 2017 Memorias La exposición crónica de cadmio induce Transición Epitelio-Mesenquimal en células epiteliales de mama MCF10A Rubén Núñez Leonardo (Becario) leonardo.nu29@hotmail.com Unidad Académica Preparatoria No.16, Universidad Autónoma de Guerrero. Juan Carlos Juárez Cruz (Asesor) jcjuarezc91@gmail.com Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero Introducción Dr. Napoleón Navarro Tito (Asesor) nnavarro@uagro.com Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. El estado de Guerrero es una de las entidades con mayor riqueza de minerales y debido a las grandes explotaciones de minerías se han obtenido muchos recursos monetarios, pero también muchos contaminantes que son liberados y esparcidos en el medio ambiental llegando a ocasionar graves daños a la salud humana (SGM, 2016). El cadmio (Cd) es un metal pesado no esencial, altamente toxico, bioacumulable y considerado por la Agencia Internacional de Investigación en el Cáncer como un carcinógeno de tipo I (Sarkar et al., 2013). Estudios epidemiológicos han asociado a los niveles de Cd como un factor de riesgo para el cáncer de mama (CaMa). Una de las evidencias más relevantes es que pacientes con CaMa presentan altas concentraciones de Cd en tejido tumoral y orina en comparación con tejido de pacientes sanas (Ionescu et al., 2006; Gallagher et al., 2010; Strumylaite et al., 2011). Sin embargo, los estudios en modelos in vitro de CaMa, son necesarios para esclarecer el papel de Cd en el desarrollo y progresión de esta enfermedad. Los principales mecanismos moleculares del Cd en la carcinogénesis del CaMa, involucran el estrés oxidativo, ya que esto
Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 potencia la disfusión mitocondrial y daño al DNA, resultando en muerte o transformación celular. Estudios experimentales en la línea celular MCF7 de CaMa, muestran que una exposición aguda de Cd, promueve la proliferación celular a través del receptor de estrógenos, por lo que el Cd se considera un metaloestrógeno (Siewit et al., 2010). Adicionalmente se ha observado que la exposición aguda de Cd induce un aumento en la tasa de migración celular de la línea celular MDA- MB-231 de CaMa (Wei and Shaikh, 2017). El CaMa es el principal tipo de cáncer invasivo y una causa importante de muerte en mujeres de todo el mundo. En México el CaMa constituye desde el 2005 la primera causa de muerte por cáncer invasivo en mujeres mayores de 25 años (Marie et al., 2009). La mortalidad del CaMa se basa en la capacidad de las células cancerosas de realizar metástasis a órganos como hueso, hígado, pulmón y cerebro (Kimbung et al., 2015). Uno de los principales mecanismos celulares implicados en la metástasis de células cancerosas es la Transición Epitelio-Mesenquimal (EMT por sus siglas en inglés) (Kalluri and Weinberg, 2009). La EMT es un proceso biológico en el que las células epiteliales experimentan cambios a un fenotipo mesenquimal, adquiriendo de manera primaria una alta capacidad migratoria e invasiva importante para el inicio y progresión de la metástasis (Heerboth et al., 2015). Este cambio en el fenotipo de las células es acompañado de expresión diferencial de diversas proteínas, conocidos como marcadores moleculares de la EMT (Kalluri and Weinberg, 2009). E-cadherina es una proteína de 120 kda, encargada de la adhesión célula-célula de manera dependiente de calcio, que se expresa en células epiteliales, por lo que se considera un marcador epitelial (van Roy and Berx, 2008). Vimentina es un filamento intermedio de 57 kda, su principal función es regular la arquitectura y rigidez en la células migratorias mesenquimales, por lo que se considera como un marcador mesenquimal. FAK es una tirosina cinasa de peso molecular de 125 kda, que se localiza en la parte media de la membrana celular y se encarga de regular la formación de las adhesiones focales, estructuras multimoleculares formadas en el frente de migración de las células mesenquimales; además de desempeñar un papel crítico en múltiples aspectos en la progresión tumoral como proliferación, supervivencia, invasión y metástasis (Zhao and Guan, 2011). La relación de Cd y cáncer de mama se ha reportado principalmente en una exposición aguda a Cd sobre diversos procesos celulares. No obstante, la exposición crónica de Cd sobre procesos celulares como la EMT en modelos celulares de CaMa, no han sido del todo explorados, por lo que es necesario realizar una mayor investigación.
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4,5 y 6 de Octubre 2016 Objetivos Evaluar el efecto crónico de la exposición de Cd sobre marcadores clásicos de la EMT en la línea no tumoral de epitelio mamario, MCF10A. Metodología Cultivo celular: La línea celular MCF10A se cultivó en medio DMEM/F12 (1:1) (Sigma- Aldrich) suplementado con 5 % de suero fetal bovino (SFB) (ByProductos), 10 µg/ml de insulina, 0.5 µg/ml de hidrocortisona, 20 ng/ml de EGF (Sigma-Aldrich) y antibióticos (Gibco). Los cultivos se incubaron en una atmósfera húmeda de 5% de CO2 y una temperatura de 37 C. Para las condiciones experimentales las células se cultivaron en presencia o ausencia de 10 µm de CdCl2 durante 4 semanas. Western blot: Los extractos de proteínas totales de células cultivadas en presencia o ausencia de CdCl2 (10 µm), fueron separadas por SDS-PAGE al 10% y transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente la membrana se bloqueó con 3% de BSA en solución de lavado (TBS/Tween-20 0.05%) y se incubaron con el anticuerpo primario anti-e-cadherina (sc- 7870), anti-vimentina (sc-5565), anti-fak (sc-558) (dilución 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) y anti-gapdh (3863S) (dilución 1:1000; Cell Signalling), a 4 C durante 12 horas. Terminado este tiempo de incubación, las membranas fueron lavadas e incubadas con anticuerpo secundario anti- Rabbit y anti-mouse (dilución 1:5000) (Santa Cruz Biotechnology) por 2 horas a 22 C. Finalmente, se realizó la inmunodetección usando un estuche de quimioluminiscencia y placas autoradiográficas. La intensidad relativa de las bandas se determinó por medio de análisis densitométrico empleando el software ImageJ. Inmunofluorescencia: Las células se crecieron en cubreobjetos de 12 mm hasta una confluencia de 60% en presencia o ausencia de CdCl2 (10 µm). Las células fueron fijadas y permeabilizadas con formaldehído al 4% y Triton X-100 al 0.5% respectivamente. Posteriormente las células se bloquearon con BSA al 3% durante 12 horas a 4 C. Terminado el bloqueo las células se incubaron con los anticuerpos primarios específicos para E-cadherina, Vimentina y FAK así como con anticuerpo secundario anti-mouse Alexa488 e incubación con Faloidina-Rodaminada para la tinción de filamentos de actina. Finalmente los cubreobjetos se montaron en un portaobjeto
Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 con la solución de montaje Fluoroshield con DAPI (Sigma-Aldrich) y visualizando las laminillas en un microscopio de fluorescencia. Resultados La exposición crónica de Cd induce cambios morfológicos en la línea celular MCF10A La exposición crónica de Cd se ha reportado en células de CaMa como MCF7 y MDA-MB- 231 evidenciando su efecto sobre procesos proliferación, migración e invasión celular (Ponce, 2013; Wei and Shaikh, 2017). Sin embargo, existen pocos reportes de la exposición crónica de Cd sobre modelos de CaMa no tumorales que evidencian el efecto de Cd sobre la EMT (Benbrahim- Tallaa, 2009). Para determinar el efecto de Cd sobre el fenotipo de las células epiteliales de mama MCF10A, se estimuló con una dosis de 10 µm de CdCl2 durante 4 semanas. Las células estimuladas con CdCl2 presentan una forma alargada o en forma de huso, en comparación con las células control cultivadas sin CdCl2 las cuales conservan la morfología cuboide característica de una célula epitelial (Figura 1A y 1B). Adicionalmente se observa que las células estimuladas con CdCl2 presentan un aumento en la separación intercelular en comparación con las células control que se mantienen estrechamente unidas. Estos resultados evidencian que la exposición crónica a Cd induce cambios en el fenotipo de células epiteliales. A B Fig. 1. Efecto de la exposición crónica de Cadmio sobre la morfología de las células MCF10A. Las células se cultivaron con 10 μm de CdCl 2 durante 4 semanas, utilizando como control células no cultivadas con CdCl 2. Las imágenes se capturaron con microscopio de contraste de fases. A. Células no tratadas con CdCl 2. B. Células tratadas con CdCl 2, observando cambio morfológico asociado con la EMT. La presencia de células en forma de huso (Flecha roja) y el aumento de la separación intercelular (Flecha naranja), se observaron en las células cultivadas con CdCl 2 pero no en células no cultivadas con CdCl 2.
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4,5 y 6 de Octubre 2016 La exposición crónica a Cd induce cambios en la expresión de marcadores de EMT en células epiteliales MCF10A Para determinar el efecto de la exposición crónica de Cd sobre la expresión de marcadores proteicos de EMT, se realizó la técnica de Western blot para el marcador epitelial E-cadherina, así como para los marcadores mesenquimales, Vimentina y FAK. Los resultados muestran que células con exposición crónica a CdCl2 presentan una disminución en los niveles de expresión de E- cadherina, y un incremento en los niveles de expresión de Vimentina y FAK (Figura 2A-2D). Estos resultados evidencian que la exposición crónica a Cd induce cambios en los niveles de expresión de marcadores como E-cadherina, Vimentina y FAK, lo cual evidencia al programa de EMT activo. A B C D Fig. 2. Efecto de la exposición crónica de Cadmio sobre marcadores de la EMT en c<élulas MCF10A. Las células se estimularon con 10 μm de CdCl 2 durante 4 semanas, utilizando como control células no estimuladas con CdCl 2. A. Western blot de E-cadherina, Vimentina, FAK y GAPDH. B, C, D. Grafica del análisis densitométrico de las bandas. La exposición crónica a Cd induce cambios en la localización subcelular de marcadores de EMT en células epiteliales MCF10A Para determinar el efecto de la exposición crónica de Cd sobre la localización subcelular de de marcadores proteicos de EMT, se realizó la técnica de inmunofluorescencia para el marcador los mismos marcadores evaluados por Western blot. Los resultados muestran que células con exposición crónica a CdCl2 presentan una redistribución en los niveles de E-cadherina a una distribución citoplasmática en comparación con células no expuestas a CdCl2 (Figura 3A) Así
Tlamati Sabiduría Volumen 8 Número Especial 2, 2017 mismo se observó en células expuestas a CdCl2 que la redistribución de los filamentos de Vimentina cambian manteniendo una distribución citoplasmática en comparación con células no expuestas a CdCl2 (Figura 3B). En células expuestas a CdCl2 se observa que existe una distribución de FAK en las adhesiones focales lo cual se relaciona con un aumento en la polimerización de los filamentos de actina (Figura 3C). Estos resultados evidencian que la exposición crónica a Cd induce cambios en la localización subcelular de marcadores de EMT. A B C Fig. 3. Efecto de la exposición crónica de Cadmio sobre la expresión y localización subcelular de marcadores de la EMT en células MCF10A. Inmunofluorescencia de E-cadherina, Vimentina, FAK y filamentos de actina. Las células se cultivaron con 10 μm de CdCl 2 durante 4 semanas, utilizando como control células no cultivadas con CdCl 2. A. Redistribución de membrana a citoplasma de E-cadherina (Flechas verdes), en células cultivadas con CdCl 2. B. Redistribución de filamentos intermedios de Vimentina (Flechas verdes) en celular cultivadas con CdCl 2. C. Redistribución de FAK a adhesiones focales (Flechas verdes) y alteraciones en la organización de filamentos de actina (Flechas rojas) en células cultivadas con CdCl 2 Los núcleos fueron visualizados con DAPI,
Memorias del 3 er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT Acapulco, Guerrero 4,5 y 6 de Octubre 2016 Cultivo celular Western blot Microscopia Rubén Núñez Leonardo Conclusiones La exposición crónica a Cd induce cambios en la morfología celular de la línea MCF10A, así como la regulación de la expresión y localización subcelular de marcadores de la EMT. Agradecimiento El presente trabajo fue financiado por el proyecto SEP/Conacyt con clave: CB-2014-01-239870 otorgado al Dr. Napoleón Navarro Tito. Referencias bibliográficas Benbrahim-Tallaa L., Tokar E., Diwan B., Dill A., Coppin J. and Waalkes M. (2009) Cadmium malignantly transforms normal human breast epithelial cells into a basal-like phenotype. Environ Health Perspect. 117(12):1847-52. Gallagher C., Chen J. and Kovach JS. (2010). Environmental cadmium and breast cancer risk. Aging (Albany NY), 2(11): 804-14. Heerboth S., Housman G., Leary M., Longacre M., Byler S., Lapinska K., et al. (2015). EMT and tumor metástasis. Clin Trans Med. 4(6): 1-13. Ionescu J., Novotny J., Stejskal V., Lätsch A., Blaurock-Busch E and Eisenmann-Klein M. (2006). Increased levels of transition metals in breast cancer tissue. Neuro Endocrinol Lett. 28(5): 36-9. Kalluri R. and Weinberg R. (2009). The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119(6): 1420-1428.
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