PROTOCOLOS PARA EL DESARROLLO DE UN KIT PARA LA DETECCION DE LA HIPOXIA EN TEJIDOS DE CAMARONES EN CULTIVO. DEMANDA: EXPRESION Y CARACTERIZACION DE GENES ANTIOXIDANTES EN CONDICIONES DE HIPOXIA EN EL CAMARON BLANCO Litopenaeus vannamei Y SU EFECTO EN LA SUPERVIVENCIA DEL MISMO DRA. ADRIANA MUHLIA ALMAZÁN ING. BIOT. OFELIA A. MÉNDEZ ROMERO LABORATORIO DE BIOENERGETICA Y GENETICA MOLECULAR. CENTRO DE INVESTIGACION EN ALIMENTACIÓN Y DESARROLLO, A.C.
ÍNDICE 1. PROTOCOLO 1. CUANTIFICACION DE LACTATO EN EL PLASMA DE LOS CAMARONES EN NORMOXIA/ HIPOXIA.. 1 2. PROTOCOLO 2. AISLAMIENTO DEL ARN DE LAS MUESTRAS DE BRANQUIAS DE CAMARONES EN NORMOXIA / HIPOXIA 3 3. PROTOCOLO. CUANTIFICACIÓN DE ARN TOTAL POR METODO ESPECTOFOTOMETRICO 7 4. PROTOCOLO. EVALUACION DE LA INTEGRIDAD DEL ARN TOTAL DEL CAMARON EN GELES DE AGAROSA... 12 5. PROTOCOLO. DIGESTION DE ADNg CONTAMINANTE EN LAS MUESTRAS DEL ARN DEL CAMARON.... 14 6. PROTOCOLO. CUANTIFICACION DE LA EXPRESION DE GENES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES POR PCR EN TIEMPO REAL.... 16 7. EXPERIMENTO NORMOXIA/HIPOXIA/REOXIGENACION. ANALISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS.. 23
PROTOCOLO 1. CUANTIFICACION DE LACTATO DE LOS CAMARONES EN HIPOXIA OBJETIVO: El lactato es el producto principal del metabolismo anaerobio en los crustáceos, varias especies presentan una alta concentración de este metabolito cuando se enfrentan a condiciones de hipoxia; por lo tanto, se ha demostrado que un incremento en la concentración de lactato en el plasma de estos organismos es un método rápido y sencillo para confirmar que el organismo ha sido sometido a condiciones de hipoxia. El siguiente protocolo describe detalladamente la metodología para la cuantificación de lactato en la hemolinfa del camarón. AGENTES REQUERIDOS: - Kit LACTATE- PAP (RANDOX, USA) Cat. No. LC2389 - Agua estéril - Solución Anticoagulante fría: 300 mm NaCL, 10 mm KCL, 10 mm HEPES, 10 mm EDTA (ph 7.3) (Vargas- Albores et al., 1993). EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO: - Microtubos estériles - Micropipetas y puntas estériles - Microplacas - Lector de microplacas con filtro (55nm) - Guantes de latex - Jeringas de insulina - Microcentrífuga refrigerada - Incubadora a 37 C. OBTENCIÓN DEL PLASMA DEL CAMARON 1 2 3 1. Extraer 400 μl de hemolinfa a partir de la base del quinto pereiópodo del camarón, utilizando una jeringa de 1 ml conteniendo dos volúmenes (800 μl) de solución anticoagulante fría*. 2. Se centrifugar la muestra de hemolinfa a 700 x g por 10 min a 4 C. 3. Separar las dos fases, el plasma (sobrenadante) y los hemocitos (pellet celular al fondo) y se almacenar a - 80 C hasta su uso. 1
CUANTIFICACIÓN DEL LACTATO EN EL PLASMA 4 5 6 1. Colocar 10 μl de plasma y 190 μl del reactivo del *kit en cada pozo. Recomendaciones: 2. Incubar por 30 min a 37 C o a temperatura ambiente. 3. Realizar la medición en el lector de microplacas (espectrofotómetro) a una longitud de onda de 550 nm. - Se recomienda ampliamente hacer determinaciones por triplicado de cada muestra. Nota: El análisis e interpretación de los resultados se presenta al final de este documento. 2
PROTOCOLO 2. AISLAMIENTO DE ARN DE LAS MUESTRAS DE BRANQUIAS DE CAMARONES EN NORMOXIA/ HIPOXIA OBJETIVO: El ARN aislado de los camarones en normoxia/ hipoxia a partir de este procedimiento se utilizara posteriormente para la expresión de los genes antioxidantes en el camarón blanco Litopenaeus vannamei. AGENTES REQUERIDOS Vial 1- Mezcla de tiocianato de guanidinio 4M, citrato de sodio 2 mm, lauryl sarcosinato de sodio 0.5% (w/v) y β- mercaptoetanol 0.1 M. Vial 2- Cloroformo: alcohol isoamilico (49:1, v/v). Vial 3- Etanol Vial 4- Isopropanol Vial 5- Agua tratada con DEPC (dietil pirocarbonato). NOTA: TODOS LOS AGENTES DEBEN DE ESTAR FRÍOS PARA SU USO. EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO - Centrifuga refrigerada (4 C). - Balanza - Micropipetas y puntas estériles - Tijeras de disección - Mascara para gases - Microtubos de 1.7 ml IMPORTANTE Este procedimiento debe realizarse en hielo y con el uso de máscara para gases. Además de tener el cuidado de colocar los tubos adecuadamente en la centrífuga para no tener dificultades a lo largo del procedimiento. Nota: El análisis e interpretación de los resultados se presenta al final de este documento. 3
1 PROCEDIMIENTO PESADO DE LAS MUESTRAS Pesar de 90 a 150 ng de tejido de branquias (o cualquier otro del camarón) disectado, al cual se le extraerá el ARN y cortar en pedazos pequeños con tijeras estériles, colocar en un microtubo. 2 HOMOGENIZACION DE LA MUESTRA 1. Añadir 500 µl del vial 1 (frío) a las muestras 3 2. Moler u homogenizar las muestras con ayuda de un homogenizador KONTES y agregar otros 500 µl del vial 1 (frío) SEPARACION DE FASES 3. Incubar las muestras 5 min.a 25 C 1. Agregar 200 µl del vial 2 (frío) 2. Agitar vigorosamente 15 seg. hasta obtener una homogenización única de aspecto lechoso e incubar 2 a 3 min. a 25 C 3. Centrifugar las muestras a 12,000 x g durante 15 min a 4 C 4
El volumen de la fase acuosa recuperada es más o menos el 60% del volumen de vial 1 usado La fase acuosa (que contien el ARN) se pasa a un microtubo limpio de 1.7mL etiquetado 4 HOMOGENIZACIÓN Y SEPARACIÓN ADICIONALES 1. Tratar la fase acuosa con 500 µl del vial 1 (frío), agitar e incubar durante 5 min a 25 C 2. Agregar de nuevo 200 µl del vial 2 (frío), agitar 15 seg. e incubar durante 2-3 min a 25 C 3. Centrifugar las muestras a 12,000 x g durante 15 min a 4 C Se recupera de nuevo la fase acuosa que es la que contiene el ARN en un nuevo tubo 5 PRECIPITACION DE ARN 1. Tratar la fase acuosa con 500 µl del vial 3 (frío) 2. Incubar 24 h a - 20 C 3. Centrifugar las muestras a 12,000 x g durante 10 min a 4 C 5
El precipitado de ARN es incoloro y se observa adherido al lado o al fondo del tubo como un boton blanco IMPORTANTE: Antes de la centrifugación colocar los tubos de tal forma que la pestaña quede hacia adentro como se muestra en la imagen, así se evitara complicaciones para los siguientes pasos). 6 LAVADO DE ARN 1. Eliminar el sobrenadante, cuidando de no despegar el pequeño boton de ARN x 2 2. Lavar la muestra de ARN con 1 ml del vial 4 (frío) 3. Centrifugar las muestras a 7,500 x g durante 5 min a 4 C Hacer otro lavado siguiendo los pasos anteriores 7 DISOLUCION DE ARN 1. Decantar el sobrenadante cuidando de no despegar el pequeño boton blanco (pellet) 2. Dejar secar los pellets al aire durante 10 min. 3. Resuspender el pellet agregando 30 µl del vial 5 y agitar suavemente Guardar el ARN a - 20 C hasta su posterior uso. 6
PROTOCOLO 3. CUANTIFICACIÓN DE ARN POR METODO ESPECTROFOTOMETRICO (NANODROP) OBJETIVO: Una vez aislado, el ARN debe cuantificarse para la concentracion (ng/µl) del ARN aislado de los camarones. EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO - Guantes - Micropipetas y puntas estériles - Agua estéril y agua DEPC - Espectrofotómetro Nanodrop A continuación se describe de manera breve y gráfica el procedimiento. Posteriormente, se describe el uso del software. Brazo Lector 1 2 3 4 ESPECTOFOTOMETRO NANODROP Limpiar el sensor y el sitio donde se deposita la muestra con agua limpia libre de pirógenos CARGA 1 µl DEL BLANCO Colocar 1 μl de agua que servirá como blanco y leer LIMPIA DEL LECTOR Limpiar de nuevo el lector con agua CARGA 1 µl DEL ARN Colocar 1 μl de la muestra de ARN aislada y leer. Recomendaciones: Se recomienda ampliamente hacer determinaciones por triplicado de cada muestra. USO DEL SOFTWARE: 1. Dar doble click sobre el icono del software ND- 100 V3.5.2 que se instala en cualquier computadora junto con el equipo. 2. Seleccionar la opción NUCLEIC ACID 7
3. En la pantalla aparecerá un cuadro como en el que se muestra en la imagen, antes de dar click en ok, levantar el brazo y limpiar el lector; después cargar 1 µl de H 2 O estéril evitando la formación de burbujas. Dar click en OK de nuevo. 4. Seleccionar el tipo de muestra a evaluar, en este caso RNA- 40 (color rosa) 5. Levantar el brazo del equipo y limpiar el agua que colocó en el paso 3. Cargar 1 µl de H 2 O DEPC para utilizarlo como blanco y dar click en BLANK. Aparecerá un recuadro como el de la imagen, diciendo que está haciendo el blanco 8
Esta es la pantalla del blanco. Todas las casillas deben de aparecer en cero. A excepción de la longitud de onda que debe de estar en 230 nm. 6. Se limpia el lector igual que en los pasos anteriores y se carga 1 µl de la muestra de RNA. Se declara el nombre de la muestra en SAMPLE ID, bajar el brazo del equipo y dar click en MEASURE. Aparecerá un recuadro igual a este: 9
7. Al concluir el aparato con la lectura muestra una gráfica, la concentración de la muestra de ARN (ng/µl) y la relación 260/280 nm y 260/230 nm. Para una medición posterior se limpia el lector y se carga la muestra. Si son muestras diferentes se recomienda poner un blanco entre cada una de ellas igual que en el paso 5. 8. Para guardar las cuantificaciones realizadas dar click en SHOW REPORT y aparecerá esta nueva pestaña en la cual están todas las mediciones realizadas. Después dar click en REPORTS/ SAVE REPORT Al dar clic en SAVE REPORT nos arrojara un nuevo recuadro, en el cual daremos clic en EXPORT REPORT & STANDARDS TABLES 10
Se abre la ventana para guardar nuestro archivo. Se asigna un nombre al archivo y dar click en ok. Después click en EXIT (para salir de esta ventana). Nos regresa a la ventana original, para salir del programa damos click en EXIT. Nota: El análisis e interpretación de los resultados se presenta al final de este documento. 11
PROTOCOLO 4. EVALUACION DE LA INTEGRIDAD DEL ARN TOTAL EN GELES DE AGAROSA OBJETIVO: Comprobar la integridad del ARN total aislado previamente de los camarones para utilizarse como templado en la evaluación de la expresión de los genes antioxidantes en el camarón blanco Litopenaeus vannamei. AGENTES REQUERIDOS - Agua tratada con DEPC (dietil pirocarbonato) - Geles de agarosa pre- armados (2%) EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO - Guantes - Micropipetas y puntas estériles - Agua estéril y agua DEPC - Cámara E- Gel Agarose Gel Electrophoresis System - Sistema de Fotodocumentación - Geles de agarosa al 2% Enseguida se describe de manera gráfica y breve el procedimiento para la verificación de la integridad del ARN. 1 2 3 1. A partir del ARN extraído se preparan alícuotas de 2000 ng de ARN en un volumen de 10 µl con agua DEPC. 12
NOTA: estos cálculos se basan en la concentración que se obtuvo en la cuantificación del RNA por espectrofotometría en el NANODROP. Ejemplo: Muestra Concentración ng/µl Volumen equivalente a 2000ng de ARN Volumen necesario de agua DEPC Volumen Final 1 1378.01 1.45 µl 8.55 µl 10 µl 2. Colocar el E- Gel Agarosa 2% en la cámara y cargar uno a uno los pozos con los 10 µl en el gel con la muestra de ARN correspondiente. NOTA: Todos los pozos deberán cargarse, si es necesario poner 10µL de agua DEPC sin muestra. 3. Correr el ARN utilizando el programa E- Gel (programa 7) durante 10 minutos. NOTA: La cámara ya trae prediseñados los programas, solo hay que verificar estar usando el adecuado. 4. Al finalizar, se visualizan las bandas del ARN directamente en el equipo o tomar una fotografía del gel en un sistema fotodocumentador. Nota: El análisis e interpretación de los resultados se presenta al final de este documento. 13
PROTOCOLO 5. DIGESTION DEL ADNg CONTAMINANTE EN LAS MUESTRAS DE ARN DEL CAMARON OBJETIVO: Debido a que existe ADN genómico contaminante en las muestras extraídas de ARN total, es necesario eliminarlo para evitar resultados erróneos durante la cuantificación del ARNm de las enzimas antioxidantes. Así que se pretende digerir el ADNg en fragmentos muy pequeños utilizando una enzima DNAsa comercial. AGENTES REQUERIDOS - Agua tratada con DEPC (dietil pirocarbonato) - DNAsa comercial (DNasa I recombinant, RNase- free) ROCHE, Cat. No. 04 716 728 001 - ARN total extraido - Buffer de Incubación 10X (Tris- HCl 400 mm, NaCl 100 mm, MgCl 2 60 mm, CaCl 2 10 mm, ph 7.9) - Kit Taq PCR Master Mix (250 U, QIAGEN), Cat. No. 20144 EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO - Guantes - Micropipetas y puntas estériles - Agua estéril y agua DEPC - Sistema de Fotodocumentación - Geles de agarosa al 2% - Equipo termociclador Enseguida se describe el procedimiento. 1. Mezclar los componentes utilizando micropipetas, según indica la tabla. ARN [ng/µl] ARN 6000ng (µl) DNasa (µl) Buffer 10X (µl) H 2 O DEPC (µl) Volumen Final (µl) 1 1865,45 3,21 2 1,09 4,6 10,9 Concentración final del ARN: (6000 ng inicial/ 10.9 volumen final) = 550.45 ng/µl La DNAsa se utiliza en una relación 0.33 U/ 1000 ng de ARN total 2. Incubar la mezcla a 35 C por 20 minutos 3. Inmediatamente incubar a 75 C por 10 minutos. 4. Después del tratamiento con la DNAsa se realiza un PCR para confirmar la ausencia del ADNg, usando el ARN total tratado como templado, y como 14
control positivo la amplificación de un producto conocido (tripsina) a partir de ADNg del camarón. (Se utiliza ADN genómico de la glándula digestiva de camarón previamente aislado). 5. Cada reacción de PCR se lleva a cabo utilizando 12.5 µl de la mezcla con la polimerasa, adicionando 1 µl de cada oligonucleótido especifico 20 mm (Forward y Reverse) para amplificar el gen de la tripsina del camarón. Agregar 200 ng de ARN total como templado. Cada reacción de PCR se lleva a un volumen final de 25 µl con agua DEPC. Las condiciones de amplificación del PCR son de 95 C por 3 min (1 ciclo), 95 C por 45 seg, 50 C por 1 min y 72 C por 2 min (33 ciclos) y un tiempo de extensión final a 72 C por 10 min. Los amplicones logrados se observan en un gel de agarosa al 1% teñido con SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen). 15
PROTOCOLO 6. SINTESIS DE ADNc Y PCR EN TIEMPO REAL PARA LA CUANTIFICACION DE TRANSCRITOS DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES. OBJETIVO: Evaluar la expresión de los genes antioxidantes en el camarón blanco Litopenaeus vannamei en PCR tiempo real, utilizando como templado las muestras de ARN total aisladas y evaluadas en los protocolos anteriores. AGENTES REQUERIDOS - Agua esteril - ARN tota libre de ADNg - 2x Brilliant II QRT- PCR Low ROX 1- Step Master Mix 2.5 ml (Agilent Cat Log No. 60083751) - Sonda TaqMan Probe (CAT, MnSOD, GPX, TRX, COX 1, L8) EQUIPAMIENTO Y MATERIAL BASICO - Guantes - Micropipetas y puntas estériles - Equipo termociclador en tiempo real StepOne ( Applied Biosystems) La cuantificación del ARNm de las enzimas antioxidantes catalasa (CAT), superoxido dismutasa de manganeso (MnSOD), glutatión- peroxidasa (GPX), tiorredoxina (TRX) y citocromo c oxidasa subunidad 1 (COX 1) se realiza usando sondas TaqMan específicas para cada uno de los transcritos que codifican a las enzimas antioxidantes y un sistema de detección de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems). Además, se evalua la expresión del gen de la proteína ribosomal L8 (DQ316258) para normalizar la expresión génica de cada una de las enzimas antioxidantes. La cuantificación del ARNm de cada muestra se lleva a cabo por triplicado. PROCEDIMIENTO: I.REACCIONES DE PCR. Cada una de las reacciones de amplificación deberá incluir: 1. 10 μl de mezcla 2x Brilliant II QRT- PCR Low ROX 1- Step Master Mix (Agilent, USA) 2. 1 μl de TaqMan probe 3. 0.8 μl de la enzima RT/RNase Block 4. 150 ng de ARN total (libres de ADNg contaminante) 5. Agua hasta un volumen final de 20 μl. Se recomienda incluir tres réplicas de cada muestra, es decir, tres reacciones con el mismo ARN de cada muestra tomada. También deberá incluirse en cada experimento, un control negativo, que contiene los mismos componentes de las reacciones, excepto 16
el ARN total (esto para verificar que los diferentes componentes de la reacción, no estén contaminados con otro ADN o ARN). Las condiciones de amplificación son: 30 min a 50 C, 15 min a 95 C, seguido por 45 ciclos de 15 seg a 95 C y 1 min a 60 C. II. USO DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA DISEÑAR EL EXPERIMENTO EN EL TERMOCICLADOR, PREVIO AL ANALISIS DE LAS MUESTRAS: 1. Dar doble clic sobre el icono y abrir el software (StepOne v2.1) 2. Seleccionar el usuario, para iniciar el programa. 3. Se mostrara una pantalla como la siguiente. Seleccionar NEW EXPERIMENT 17
4. En la siguiente pantalla llenar con los datos de la corrida siendo obligatorio el nombre del experimento. Los otros comandos se dejan tal cual determina el aparato y dar NEXT. 5. En la pantalla siguiente, se seleccionan los siguientes comandos. Y después se da click en NEXT. 6. En esta pantalla se selecciona el número de genes que estarán en la corrida, y posteriormente se da click en NEXT. 18
7. Posteriormente se seleccionan el número de muestras de ARN que se evaluaran, y el número de réplicas (generalmente se recomienda sean triplicados), así como los Controles Negativos (que incluyen todos los reactivos de una reacción, excepto el ARN total). La muestras se nombran o declaran en la placa del experimento y se les asigna un color a cada una, dar click en NEXT en esta pantalla y en la que le sigue. 8. En la siguiente pantalla se seleccionan las condiciones de amplificación, tal y como fueron descritas previamente y dar click en FINISH DESIGNING EXPERIMENT 19
9. Salvar las condiciones del experimento que se ha diseñado en SAVE EXPERIMENT. III: PARA CORRER EL EXPERIMENTO CON LAS REACCIONES YA PREPARADAS COMO SE INDICO AL INICIO DE ESTE PROTOCOLO: 1. Abrir el archivo del experimento que ya tiene un NOMBRE asignado desde la opción de OPEN, como se observa en la siguiente pantalla. 20
1. Colocar la placa o los tubos de las reacciones ya preparadas dentro del equipo (de acuerdo al lugar previamente asignado durante el diseño de la corrida), e iniciar la corrida en START RUN. 2. Al finalizar la corrida se mostrará una pantalla como la siguiente, en donde aparecerán los datos obtenidos. Se sacan los tubos del equipo y posteriormente se apaga. 21
3. Para salvar el reporte en formato pdf dar clic en imprimir y seleccionar los parámetros que deseas que muestre, después dar clic en PRINT PREVIEW, el cual abrirá una ventana con la vista previa de la impresión en formato pdf el cual puedes guardar. 22
EXPERIMENTO NORMOXIA/HIPOXIA/REOXIGENACION. ANALISIS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Parte I. Ensayo Normoxia/ Hipoxia El estudio propuso un bioensayo con camarones juveniles L. vannamei, de acuerdo a los objetivos comprometidos. Se obtuvieron 45 organismos experimentales vivos y se mantuvieron en el laboratorio húmedo del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR) Unidad Hermosillo, en condiciones controladas de salinidad (34 ppm), temperatura (28 C) y oxígeno (normoxia considerada en 6 mg/l) para un periodo de aclimatación de 10 días. Los camarones fueron alimentados con alimento comercial ad libitum, y los restos de alimento y heces se retiraron diariamente por sifoneo. Un recambio del 100% del volumen total de agua marina se realizó diariamente. Después del periodo de aclimatación y cuarentena de 10 días que aseguraron la salud de los camarones experimentales, se llevó a cabo el ensayo para determinar el efecto de la hipoxia en los organismos expuestos a diferentes tiempos y niveles de hipoxia, incluyendo un nivel mínimo de 1.5 mg/l de O2, que representa una condición de hipoxia aguda fuera del límite inferior del rango reportado como óptimo para esta especie (Guadagnoli et al., 2005). Se utilizaron 9 acuarios y cada uno fue acondicionado con un volumen total y constante de agua marina (60 L), con una concentración inicial de oxígeno en el agua de 6 mg/l (normoxia). Los aireadores fueron retirados en 6 de los 9 acuarios y una mezcla de gases con 90% nitrógeno y 10% aire les fue suministrada usando un medidor de flujos de gas (GF- 3; Cameron Instruments, Port Arkansas, TX, USA) para desplazar el oxígeno del agua y generar las condiciones de hipoxia. Al inicio del experimento se tomaron las muestras de organismos en condiciones de normoxia, posteriormente, se indujo la hipoxia y 6 h después, cuando la concentración de oxígeno disuelto descendió hasta 2 mg/l se tomaron muestras nuevamente. La concentraciones de oxígeno disuelto se redijeron hasta 1.5 mg/l y después de 6 h de mantener a los organismos en esa condición se tomaron nuevas muestras. Posteriormente, el suministro de oxígeno se re- estableció en los tanques y cuando alcanzo un estado re- oxigenado (7 mg/l) después de 6 h se tomaron las ultimas muestras de camarón. Al final del experimento se realizó el conteo de los organismos vivos, después de la fase de reoxigenación. La tasa calculada de sobrevivencia fue de 86.6% (39 organismos vivos, 6 muertos). Se obtuvieron un total de 39 muestras, las cuales se 23
utilizaron para la determinación de lactato y para evaluar la expresión de los genes de las enzimas antioxidantes. Parte II. Cuantificación del lactato en el plasma de camarones en normoxia/hipoxia/reoxigenación. La figura 1 muestra el incremento en la concentración de Lactato en el plasma de los camarones sometidos a normoxia (6mg/L), hipoxia (2 y 1.5 mg/l) y reoxigenación (7 mg/l). 400 350 300 Lacato mg/ml 250 200 150 100 50 Controles Hipoxia 0 6 mg/l 2 mg/l 1.5 mg/l 7 mg/l Concentración de oxígeno disuelto Figura 1. Concentración de lactato en el plasma de los camarones en condiciones de normoxia, hipoxia y reoxigenación. Los valores representan la media de 4 organismos evaluados por triplicado (n=12). Como se puede observar en la gráfica, la concentración de lactato incrementó significativamente cuando los organismos estuvieron expuestos a la mínima concentración de oxígeno disuelto en el agua (1.5 mg/l). Estos resultados sugieren que las concentraciones de lactato en el plasma de los camarones, son un indicador importante de la ausencia de oxígeno en el agua. 24
Parte III. Aislamiento del ARN total, evaluación de la integridad y eliminación del ADNg contaminante de las muestras del ensayo normoxia/ hipoxia/ reoxigenación Cada una de las muestras obtenidas del ensayo fue utilizada para el aislamiento del ARN total, siguiendo el protocolo 2 de la página 3 de este documento. A continuación se muestran los resultados obtenidos. Tabla 1. Cuantificación de las muestras de ARN total aislado de las branquias de camarones sometidos a diferentes condiciones de normoxia/ hipoxia / reoxigenación, utilizando el Nanodrop. ARN total de Branquias ARN total de Branquias Normoxia [ng/µl] Normoxia [ng/µl] 1cb 1865.45 1hb 915.21 1cc 1378.01 1hc 1802.87 1cd 871.05 1hd 2357.30 1cf 724.58 1he 1202.47 Hipoxia [ng/µl] Hipoxia [ng/µl] 3ca 1328.18 3ha 1653.89 3cb 896.14 3hc2 1028.7 3cc 2343.61 3hd2 865.37 3cd 864.92 3he 944.41 Hipoxia [ng/µl] Hipoxia [ng/µl] 4cc 2351.75 4hb 1939.12 4cd2 1674.25 4hc 1137.73 4ce 3002.38 4hd 765.77 4cg 2089.48 4he 1793.30 Reoxigenados [ng/µl] Reoxigenados [ng/µl] 7ca 1396.83 7ha 1279.51 7cb 827.54 7hb 1471.24 7cc 1342.23 7hc2 1135.5 7cd 1671.05 7hfBr 933.385 Posterior a la cuantificación de los ARNs por un método espectrofotométrico, (protocolo 3 de este documento), se evaluó la integridad del ARN total de cada muestra de manera individual en geles de agarosa de acuerdo a la metodología del protocolo 4, (página 13) en donde se observan las bandas de las dos subunidades del ARN ribosomal (Figura 2). 25
Figura 2. Integridad del ARN de las muestras de branquias de camarones sometidos a diferentes condiciones de normoxia/ hipoxia / reoxigenación. Una vez confirmada la integridad del ARN de las muestras del ensayo, se procedió a eliminar el ADNg presente en las preparaciones (protocolo 5, página 14). La presencia de ADN es no deseada en las muestras de ARN, debido a que puede afectar los resultados de la evaluación pues puede ser también detectado por las sondas taqman que fueron diseñadas para cada gen. Tabla 2. Muestras de ARN total de camarones en condiciones de normoxia/ hipoxia / reoxigenación, tratadas para la eliminación de ADNg. ARN [ng/µl] ARN 6000ng (µl) Dnasa (µl) Buffer 10X (µl) H2O DEPC (µl) Volumen Final (µl) 1cb 1865,45 3,21 2 1,09 4,6 10,9 1cc 1378,01 4,35 2 1,09 3,46 10,9 1cd 871,05 6,88 2 1,09 0,93 10,9 1cf 724,58 8,28 2 1,09 0 11,37 3ca 1328,18 4,51 2 1,09 3,3 10,9 3cb 896,14 6,69 2 1,09 1,12 10,9 3cc 2343,61 2,56 2 1,09 5,25 10,9 3cd 864,92 6,93 2 1,09 0,88 10,9 4cc 2351,75 2,55 2 1,09 5,26 10,9 4cd2 1674,25 3,58 2 1,09 4,23 10,9 4ce 3002,38 1,99 2 1,09 5,82 10,9 4cg 2089,48 2,87 2 1,09 4,94 10,9 7ca 1396,83 4,29 2 1,09 3,52 10,9 7cb 827,54 7,25 2 1,09 0,56 10,9 7cc 1342,23 4,47 2 1,09 3,34 10,9 7cd 1971,05 3,59 2 1,09 4,22 10,9 1hb 915,21 6,55 2 1,09 1,26 10,9 26
1hc 1802,87 3,32 2 1,09 4,49 10,9 1hd 2357,3 2,54 2 1,09 5,27 10,9 1he 1202,47 4,98 2 1,09 2,83 10,9 3ha 1653,89 3,62 2 1,09 4,19 10,9 3hc2 1028,7 5,83 2 1,09 1,98 10,9 3hd2 865,37 6,93 2 1,09 0,88 10,9 3he 944,41 6,35 2 1,09 1,46 10,9 4hb 1939,12 3,09 2 1,09 4,72 10,9 4hc 1137,73 5,27 2 1,09 2,54 10,9 4hd 765,77 7,83 2 1,09 0 10,92 4he 1793,305 3,34 2 1,09 4,47 10,9 7ha 1279,51 4,68 2 1,09 3,13 10,9 7hb 1471,24 4,07 2 1,09 3,74 10,9 7hc2 1135,5 5,28 2 1,09 2,53 10,9 7hfBr 933.385 6,42 2 1,09 1,39 10,9 Posterior al tratamiento de las muestras se realizó un PCR confirmatorio, utilizando como control positivo ADNg del camarón amplificado con oligonucleótidos específicos para el gen de la tripsina. La figura 4 muestra un gel de agarosa en donde la banda positiva, que confirma la presencia de ADNg, esta ausente en las muestras de ARN. Figura 4. Integridad del ARN de las muestras de branquias de camarones sometidos a diferentes condiciones de normoxia/ hipoxia / reoxigenación. Linea 1. Marcador de peso molecular. Líneas 3hc2 a 4hc, muestras de ARN total libre de ADN genómico. Línea (+). Amplicon de 430 pb de la tripsina de camarón. 27
Nombre Parte IV. Cuantificación de la Expresión de los Genes de las Enzimas Antioxidantes del camarón en condiciones de normoxia/ hipoxia/ reoxigenación. De acuerdo al protocolo 6 establecido en este documento, para amplificar los genes de las enzimas antioxidantes del camarón en PCR tiempo real se diseñaron sondas Taqman específicas para cada gen incluyendo: citocromo c oxidasa subunidad I (COX1LV), tiorredoxina (TRXLV), glutatión- peroxidasa (GPXLV), superoxido dismutasa de manganeso (SODLV), catalasa (CATLV) y proteína ribosomal L8 como gen de referencia. La tabla 3 muestra los números de acceso al GenBank de cada uno de los genes de las enzimas antioxidantes del camarón que fueron utilizados como templados para el diseño de las sondas taqman. Tabla 3. Listado de las principales enzimas antioxidantes reportadas en el camarón blanco Litopenaeus vannamei. Enzima Catalasa (CAT) Super oxido dismutasa (SOD) Glutation Peroxidasa (GPX) Tiorredoxina (TRX) Citocromo C oxidasa 1 (COX1) No. Acceso al Genbank AY518322.1 DQ005531.1 AY973252.2 EU499301.1 DQ534543.1 Referencia Tavares- Sanchez et al., 2004 Gomez- Anduro et al., 2006 Liu et al., 2007. Aispuro- Hernández et al., 2008 Shen et al., 2007 Nota: Los genes de las principales enzimas antioxidantes ya han sido caracterizados y se encuentran reportados en las bases de datos como el genbank y el Penaeus Genome database. La tabla 4 por su parte, incluye las características y secuencias de cada una de las sondas taqman utilizadas en el ensayo de expresión. Todas las sondas contaban con una concentración 20X. El marcaje de la sonda se realizó con el fluoróforo FAM y el opacador NFQ en todas las sondas y las concentraciones de los oligonucleótidos y la sonda incluidos en la mezcla fueron 18 μm y 5 μm, respectivamente. Tabla 4. Secuencias de las Sondas Taqman diseñadas para la amplificación de las enzimas antioxidantes del camarón. Oligonucléotido Forward Oligonucleótido Reverse Secuencia Sonda COX1 LV CCACTATGTTCTTTCAATAGGAGCTGTA GGGTTTAAGGTAAGCCCCGTAA ATCAGTGGGCAATACC TRX LV GTGGATGTGGATGAATGTGAAGAC CAAGCTTCTGGCCATTCTTCATG ATTGCCCAAGATAACC GPX LV TGCATCATTTGGACACCTGTCT GCCGATGAGGAATTTCTCGAAGTT CCGCTCTGACATTGC SOD Lv AACATGGCTCCCGATGCT CGTCAATGGCTTGTGCAACAG CCTTGCGGCTCGCCAC CAT LV ACATGGTGCCGGGTATTGAG AGAAAAGAGGCGACCTTGCA TTCCCCTGACAAAATG 28
A continuación se muestra la localización de las secuencias en donde se alinean los oligonucleótidos y las sondas en cada transcrito específico de las enzimas antioxidantes. COX1 >gi 109692170 gb DQ534543.1 Litopenaeusvannamei mitochondrion, complete genome GCGCAACGATGATTATTTTCTACAAACCACAAAGACATTGGAACATTATACTTTATCTTCGGAGCTTGAGCTGG AATAGTAGGTACCGCTCTTAGACTTATTATCCGAGCTGAATTAGGTCAACCAGGAAGTCTCATTGGGGATGATC AAATTTATAACGTAGTTGTTACAGCTCATGCTTTTGTCATAATTTTCTTTATGGTTATGCCAATTATAATTGGA GGATTCGGTAATTGATTAGTACCCTTAATGTTAGGTGCTCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATGAATAATATAAG CTTCTGACTCTTGCCTCCTTCTCTCACATTACTTTTATCAAGAGGAATAGTTGAAAGAGGTGTCGGAACAGGAT GAACAGTATACCCTCCTTTATCTGCCAGTATCGCTCACGCTGGAGCTTCAGTAGATCTTGGAATTTTCTCTCTT CACCTAGCTGGAGTATCTTCTATTCTAGGAGCAGTAAACTTTATAACAACTGTGATTAATATACGATCTATGGG AATAACTATAGACCGAATACCTATATTTGTTTGAGCAGTATTTATTACTGCTTTATTACTACTTTTATCCTTAC CAGTCTTAGCAGGGGCTATTACTATGCTTTTAACAGACCGTAATCTTAACACATCATTCTTCGACCCAGCAGGG GGAGGTGATCCAGTCCTATACCAACATTTATTCTGATTCTTCGGTCACCCAGAAGTATATATTTTAATTTTACC TGCTTTTGGTATAATTTCCCAAGTTATTAGGCAAGAATCAGGTAAAAAAGAAGCATTCGGAACACTTGGGATGA TTTATGCTATGCTTGCTATTGGTGTTCTAGAGTTCGTAGTATGAGCACACCATATATTTACAGTAGGTATGGAT GTTGACACTCGTGCTTATTGTACATCTGCAACAATAATTATTGCCGTGCCTACAGGTATTAAAATTTTCAGTTG ACTAGGTACTCTTCATGGTACTCAACTAAACTATAGTCCTTCTCTCATTTGGGCCCTAGGATTTGTATTTCTAT TTACAGTAGGGGGTTTAACTGGAGGTGTACTAGCTAATTCTTCAATCGACATTATTTTACATGATACATATTAT GTAGTAGCACATTTCCACTATGTTCTTTCAATAGGATCTGTATTTGGTATTTTCGCAGGTATTGCCCACTGATT CCCCTTATTTACAGGACTTACCTTAAATCCTAAATGATTGAAAATTCATTTCCTTGTTATATTCATTGGAGTAA ATATTACATTCTTCCCCCAACATTTCTTAGGTCTTAATGGAATACCTCGACGATACTCAGACTACCCAGATGCT TATTCAGCATGAAATGTTGTATCTTCCATTGGATCAACGGTATCCCTAATTGCCGTATTAGGCTTTGTTATAAT CGTCTGAGAGGCATTAACTGCTGCTCGGCCTGTAGTTTTTTCACTGTTCTTACCAACTTCGATC GAATGACAGCATAACCTTCCACCAGCAGATCATAGTTATATAGAAATTCCATTAATTACTAATTTCTAA TRX >gi 169639274 gb EU499301.1 Litopenaeusvannamei thioredoxin 1 mrna, complete cds ACTCGAGCGTAGACTGCCGCCGGGACAACAGTGACAGAAAATTTCCGTCCTCCTCTTCCCACATTCGCCAAGAT GGTTTACCAAGTGAAAGACCAGGAAGATTCCACTAAGCAGCTTAACGAGGCTGGAAACAAGCTGGTTGTCATCG ACTTCTACGCCACCTGGTGTGGGCCGTGCAAAATGATCGCACCTAAGCTGGAGGAGCTAAGTCAGTCTATGAGC GATGTCGTTTTCCTGAAGGTGGATGTGGATGAATGTGAAGACATTGCCCAAGATAACCAGATTGCATGCATGCC TACTTTTCTATTCATGAAGAATGGCCAGAAGCTTGACAGCTTGTCTGGTGCCAACTATGATAAGCTCCTCGAAC TCGTTGAGAAGAACAAGTAAACCATTCCACTGCTCTCTCTGGCACCAAGAGCATGAAAGATGGACCATCTTTGC AAATTAGATCTGCTAATAGTATTTTGTTTTAGATTCATTGTGTGTGATTAAAGACAAAAATGGAGCTGTTTTGT TATTTATTTTGTCATAGATGTTCACTTTTTTCCAAATTTCTCGGTAAAAGATGATATAGCACCTCTTTATTGAA AATTTATCATTGTTTTGATAGAAGGTAGTTTAGGCGGCTAATTATTTCAGGTGAATATCCAAGATCTTTTCATT ATTGCATTATATTTAGTACCAGTGACTGTTTGTGCCTTCCTATGTAATGTTGAACTTGGATTTATAAGATTTCA ATAAAGTCTGAATATCTACCGAAA GPX >gi 118193729 gb AY973252.2 Litopenaeusvannamei glutathione peroxidase mrna, complete cds GATAGTCGGGTCTAGGAGAGACCCGGACTGGCAATGAGAAGGATCCTCTCTCCCAAAATTAGTGTTTGAAAGGA AGAAAAGAGATTTTTTTTACCCCAACCATGGCTTCCTCAGCTATCAAGTCCTTTTACGACCTGAGCGCCAAGGC TCTGAGCGGCGAGATGGTGTCGTTCAAGAAGTTCCAGGGGAAGGTGGTGCTGGTGCAGAACACGGCGTCGCTCT GAGGGACGACCACCAGGGACTTCCACCAGATGAACCAACTCAAAGAAGAGTTCGGCGACAAGCTGGAGGTCCTG GCCTTCCCCTGCAACCAGTTCGGGCACCAGGAGAACACTACCGAAGGGGAGTTGTTGAGCTCCCTCCGCCACGT CCGTCCTGGGAACAACTTCGAGCCCAAGATGGTTATGTTCGGCAAAGTCGACGTCAACGGGTCAACAGCTGATC CCGTCTTTAAGTACCTGAAGGAGCGACTGCCACTGCCAGCTGACGACAGCGTGAGTTTTATGTCAGATCCAAAG 29
TGCATCATTTGGACACCTGTCTGCCGCTCTGACATTGCCTGGAACTTCGAGAAATTCCTCATCGGCAAGGATGG GCAGCCGTTTAAGAGGTTCAGCAAGAAGTATGAAACCATATTGCTTAAAGATGAAATCGCAAACTTGCTGAAAG CTTAAAGAAAGAAGATAAGAGAAGACCCGGTGACCCAAAATTGTAGGAAAAAAAGAAAAACAAACATGAAATAA CCAGCAACCTGCAACAAAACAACAGAAAACGGAGAGCGGAGAAACAGAAAACGGAAAACCATTCCAACCGCCAA CCAGCTGATCCTTTTTCCGTGCAAAAAGGACCTTGGGACCTCAACAATGAAGGGAATCCTACAAACACTCTTAA GTGCTAGGGTTCTTGGATGATACATTTCGAGGTCCTAGGGTTCCAGGATTTATTTTTTTTTTTGCATGGGGGTA GGATCAGTTAAGAGTTCCTTTAGATACCTTTGAAGAGATAAAGTCAAAAAATATTTTCTTTTCTTTTATAAATG TCTTGTGTGTTAGGGGCATCGCGTATTATATATTTGGAGCAAGTCGATGTGATTTTTTTTTTTTTTAAAAAGGA CATAAGTTACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SOD >gi 66864636 gb DQ005531.1 Litopenaeusvannamei cytosolic MnSOD mrna, complete cds GACAGCTTCACCAACCTGCTTGCGCGTTAGACGTCCCCTCGAATAAGTAAAATCATGGCTGAGGCAAAGGAAGC TTACATCTCCATCCTGGAGAAGAAGTTAGCTGAGCTGACTGGAATTGAGGTGGATCAGATCAAGAAGAATCAGT TCGCAAATGCAGCAGATGAGGCTGTCGCCATCCGTGAGATGGCTTCATACGTAGAGGGTATTGTCGTACAGCAG GCTGGTGTTGCTCAGGCTGGCACAGTCAGTCCTCAGATTGCACAGATGTTTGCCCATATCAATGCTGAATTGGG TGAGGAACGAGGTGCTCATGCTTTGCCACCCCTCAAGTATGATTTCAACGCCCTTGAACCTCACATCTCCGGCA TGATCATGGAGATCCACCACACAAAGCATCACCAGGGCTACATTAACAACCTAATTGCCGCTACGAAGAAGTTG GTTGAGGCGGAGGCAGCCAATGACGTAAGCGCAATGAATGCCCTTCTACCAGCTATCAAGTTCAATGGAGGCGG CCACTTGAACCACACCATCTTCTGGACCAACATGGCTCCCGATGCTGGTGGCGAGCCGCAAGGAGCTGTTGCAC AAGCCATTGACGAGAGCTTTGGATCATTCCAGTCCTTCAAGGACAAATTTTCTGCTGCCAGCGTTGGAGTGAAA GGCTCTGGCTGGGGATGGCTCGGCTATTGCCCCAATCAGAACAAGCTTGAGATCGCCACTTGCCAGAACCAGGA TCCCTTGCAAATCACTCACGGACTGGTTCCGTTGCTTGGCCTTGACGTCTGGGAGCATGCTTACTACCTTCAGT ACAAGAACCTCCGTGCAGATTACGTGAAGGCCTTCTTCAATGTCATTAACTGGGAGAACGTGAATGAGCGTTAT GAGAATGCTCGTAAGAATGCAGGTCATTGACTTCTCGTGGCGACCAAAGATCCAATTCAGTGTCACAAGGGCGT TTCTCTCACATTGTAACTCAGAAGCTGACCGGCTATTGTGATAGTGCACTACTGCTGTCTTCACGTTAATCTTG TAAGGTGCCCTCTAAAACATGAAACAAACACAAGATAATTTTTTTTGTCTTTTGAAGACCACAGAAGTTGCCTC TTATTTTTAGTTGAAAATACTCAGCAAAGACATTCTTTGCTGTCACTAAAAGGGCATGGTCTTGTGTATTGGTA TTTAAGTACATTTATGTAAGCTTGTATCTGGTCATGTGTTTATATGTTGAAGTATTAAAACACCCCCTTTAAGT ATTACAATATAAGGGATTTATAAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CAT >gi 41323498 gb AY518322.1 Litopenaeusvannameicatalase (Cat) mrna, complete cds TCCTTCTTCTGCAGCCTCAGTTGGACGTTCTAGGATATTTTACGTCTCTGTTTTCACCTCTAAATCTTCAAGAT GCCGCGTGACAAGTGTGCAGAGCAATTGAATGACTTCAAGAAACAACAGACGGCTCCCGATAACCTGACCACGA GCCATGGGTGCCCACTTGCGGACAAGCTTAATTCCCTGACTGTAGGTCCAAGGGGCCCCATCCTCCTGCAGGAC ATTCAACTCCTTGATGAGATGGCTCACTTCGACCGTGAGCGCATCCCAGAGAGGGTTGTGCATGCTAAGGGAGC AGGTGCCTTTGGTTATTTTGAGGTAACACATGATATATCCAAGTATTGTAAGGCTGCTTTGTTCAGTGAGATTG GGAAACGAACTCCTATTGCTGTTCGTTACTCCACTGTAGGAGGTGAGAGTGGATCAACTGACACTGCCAGGGAT CCTCGAGGCTTTGCCGTGAAGTTTTACACAGAAGAAGGAAATTGGGATCTTGTGGGGAACAACACTCCCATTTT CTTCATCAGGGATCCTATTCTGTTCCCATCCTTCATTCACACGCAGAAGAGGAATCCTGCAACTCATCTAAAGG ATTGTGACATGTTTTGGGACTTCATTAGTTTGCGACCAGAAACAACACACCAAGTGTCATTCCTCTTCTCTGAC AGAGGAACCCCTGATGGCTATCGTCACATGAATGGCTATGGTTCTCGTACTTCCAAGCTTGTCAATGAAAAGGG AGAGGCCGTCTACTGCAAGTTCCATTACAAGACGGACCAAGGCATCAAGTGTCTTAGCAGCAAGAAGGCTGATG AACTGGCAGGTTCTGACCCAGATTATGCAACAAGGGACCTATACAATGCGATTTCAAGTGGCGATTACCCCTCA TACACTATGTGTATTCAGGTGATGACATTCGAAGAAGCAGAGAAGTGGAAGTTTAATCCATTCGACCTTACCAA AGTATGGCCTCATGGGGAATTCCCACTCATCCCAGTAGGCCGTCTTACTTTTGACCGCAATCCAAAGAATTACT TTGCTGAGGTGGAGCAGATTGCGTTCTCTTCTGCCAACATGGTGCCGGGTATTGAGGCTTCCCCTGACAAAATG TTGCAAGGTCGCCTCTTTTCTTACAACGACACTCACCGTCACCGTCTGGGTGCCAACTACACCCAGATCCCCGT GAACTGCCCGTACCGTGCCCGTACAAGGAACTACCAGAGAGATGGCCCCATGTGTGTTGATGGCAATCAGGAAA GTGCTCCTAACTACTTCCCCAACAGCTTTAGTGGCCCACAGGACTGCAGGAAACACACTGCTCCTAAATTTTCT GTTTCTGCTGATGTTGATCGCTACAACAGTGCTGATGAGGACAACTTTACCCAAGTTGGCATTTTCTATCGTCA GGTGCTGAATGAGGCAGAACGTCAGCGTTTGGTGGAGAACATTGCTGGTCACATGGTTGGAGCCCAAGAGTTCA 30
TCCAGGATCGAGCAATCAAAAACTTTACCCAGGCTGATCCAGAATATGGTGCTAACATCCGGCGTGCGATTGAC AAGATAAAGATGAGCCAGGCTTCATCTAAAACTTAACATATTCATGCTCTAGCTGCATCAAGCAATGGGGCCAA GTTATAGATGTGGAAGGTGTTGGTTGTAATATAACTTATCCAGAAGTTGGATGCGACATTTTGA Un ejemplo de los cálculos realizados para la amplificación por PCR en tiempo real de cada gen se muestran a continuación: 15 RNAs a analizar por triplicado con CORRIDA FINAL TRX 6 mg/l 2 mg/l 1.2 mg/l 7 mg/l 1cb 1cd 1hc 3ca 3cc 3ha 3hc2 4cc 4ce 4hb 4hc 7ca 7cc 7ha 7hb à 1 placa solo tiene 48 pozos Por lo que se pueden amplificar 15 RNAs en una placa (45 Rxs), y tres reacciones para los controles negativos o NTCs. Distribución placa 1: 1 2 3 4 5 6 7 8 A NTC NTC NTC 1cb 1cb 1cb 1cd 1cd B 1cd 1hc 1hc 1hc 3ca 3ca 3ca 3cc C 3cc 3cc 3ha 3ha 3ha 3hc2 3hc2 3hc2 D 4cc 4cc 4cc 4ce 4ce 4ce 4hb 4hb E 4hb 4hc 4hc 4hc 7ca 7ca 7ca 7cc F 7cc 7cc 7ha 7ha 7ha 7hb 7hb 7hb 1 rnx 50 rnxs NTCS 4 rnxs Enzima RT 0.8 µl 40 µl 0.8 µl 3.2 µl Sonda 0.5 µl 25 µl 0.5 µl 2 µl Fw TRXLv 0.9 µl 45 µl 0.9 µl 3.6 µl Rv TRXLv 0.9 µl 45 µl 0.9 µl 3.6 µl Mezcla One- Step 10 µl 500 µl 10 µl 40 µl Agua 5.9 µl 295 µl 6.9 µl 27.6 µl ARN (150ng) 1 µl - 0 µl 0 µl Para hacer los triplicados. Se tomarán 63 µl de la mix 50 Rxns y se agregara Para las 50 Rxs se tomaran 63 µl MIX y adicionaran 3.3 µl ARN à 3 Rxs de 20 µl cada una 50 Rxs 19 µl 1 µl ARN 63 µl 3.3 µl ARN 31
Se realizaron 6 experimentos individuales, uno para cada una de las enzimas antioxidantes y el del gen de referencia L8. La figura 5 muestra como ejemplo los resultados arrojados por el equipo de PCR en tiempo real, sobre la amplificación de la sonda TRX, tomando los valores de los CTs (ciclo de amplificación por encima de la fluorescencia base) de cada reacción amplificada. Figura 5. Resultados de la amplificación en PCR tiempo real de la sonda TRX del camarón. Figura 6. Graficas de amplificación de los productos de las muestras de ARN del camarón sometido a diferentes condiciones de normoxia- hipoxia- reoxigenación. 32
La figura 6 muestra el conjunto de curvas de amplificación logradas del ARN total aislado de los camarones en diferentes condiciones experimentales. Los resultados de las corridas fueron analizados utilizando el método de 2 - deltact como sigue: Expresion Relasva MnSOD 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 6 mg/l 2mg/L 1.5 mg/l 7 mg/l Hipoxia Normoxia Reoxigenación Concentración de Oxígeno en el Agua Figura 7. Expresión relativa de la enzima Superoxido Dismutasa de Manganeso del camarón blanco Litopenaeus vannamei en condiciones variables de oxígeno disuelto en el agua. Los datos representan las medias expresadas en unidades arbitrarias. Expresión Relasva Catalasa 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 6 mg/l 2mg/L 1.5 mg/l 7 mg/l Concentración de Oxígeno en el Agua Hipoxia Normoxia Reoxigenación Figura 8. Expresión relativa de la enzima Catalasa del camarón blanco Litopenaeus vannamei en condiciones variables de oxígeno disuelto en el agua. Los datos representan las medias expresadas en unidades arbitrarias. 33
2.5 Expresión Relasva GPX 2 1.5 1 0.5 Hipoxia Normoxia Reoxigenación 0 6 mg/l 2mg/L 1.5 mg/l 7 mg/l Concentración de Oxígeno en el Agua Figura 9. Expresión relativa de la enzima Glutatión Peroxidasa del camarón blanco Litopenaeus vannamei en condiciones variables de oxígeno disuelto en el agua. Los datos representan las medias expresadas en unidades arbitrarias. 14 Expresión Relasva TRX 12 10 8 6 4 2 Hipoxia Normoxia Reoxigenación 0 6 mg/l 2mg/L 1.5 mg/l 7 mg/l Concentración de Oxígeno en el Agua Figura 10. Expresión relativa de la enzima Tiorredoxina del camarón blanco Litopenaeus vannamei en condiciones variables de oxígeno disuelto en el agua. Los datos representan las medias expresadas en unidades arbitrarias. 34
Expresión Realsva de COX1 700 600 500 400 300 200 100 0 6 mg/l 2mg/L 1.5 mg/l 7 mg/l Concentración de Oxígeno en el Agua Hipoxia Normoxia Reoxigenación Figura 11. Expresión relativa de la enzima Citocromo C oxidasa del camarón blanco Litopenaeus vannamei en condiciones variables de oxígeno disuelto en el agua. Los datos representan las medias expresadas en unidades arbitrarias. De acuerdo a los resultados observados en este estudio, la hipoxia afecta la sobrevivencia de los camarones, sin embargo, en el experimento llevado a cabo en esta investigación, no se observaron tasas de mortalidad masivas como se esperaba, indicando que el camarón es un organismo capaz de enfrentar los cambios en las concentraciones de oxígeno disuelto que se llevan a cabo a lo largo de un periodo diurno, con sobrevivencias por encima del 80%. Los resultados de la concentración del lactato en el plasma del camarón mostraron incrementos importantes en la condición de hipoxia mas aguda, justo cuando el organismo esta sometido a concentración de oxígeno por debajo del rango considerado como mínimo para esta especie. De tal forma que la facilidad de tomar muestras de lactato y realizar la medición de este metabolito en el plasma, podría ser uno de los parámetros a considerar en las granjas camaronícolas del estado de Sonora, para la temprana detección de niveles muy bajos de oxígeno en el agua, y prevenir el efecto que la hipoxia tiene en la sobrevivencia de los camarones. Esta investigación demostró que existe un efecto significativo de la hipoxia en la concentración de ARNm de las enzimas antioxidantes del camarón, sin embargo, también se encontraron diferencias en los organismos en normoxia y en los reoxigenados. Estas diferencias pueden ser atribuidas al efecto de estrés que les produjo a los organismos la manipulación constante durante el bioensayo. Sin embargo, se vieron incrementos importantes en la expresión de enzimas como catalasa, glutation peroxidasa y citocromo C oxidasa en condiciones de hipoxia. Lo anterior sugiere en primer lugar que existe una respuesta antioxidante del camarón a las condiciones de hipoxia a nivel transcripcional, en donde los genes de estas enzimas se ven sobreexpresados o en su caso, reprimidos, por la ausencia de oxígeno en el agua. 35
Es importante también resaltar que la enzima citocromo c oxidasa (COX1), representada en este estudio por su subunidad 1, y cuya función esta directamente relacionada con el uso de las moléculas de oxígeno como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial, es una enzima expresada en un alto numero de copias, como consta en la figura 11, mostrando estar sobreexpresada en la hipoxia mas severa (1.5mg/L) por encima de las 480, 000 unidades arbitrarias, lo cual no se observa en los resultados de las otras enzimas antioxidantes, por lo que partiendo de este resultado, se propone la evaluación de este transcrito como un posible marcador de hipoxia en los camarones. Entre las enzimas evaluadas, la glutatión peroxidasa (Figura 9), mostró menor variación en los organismos en normoxia y diferencias importantes entre los organismos en hipoxia y los reoxigenados. Lo anterior la coloca como una de las enzimas antioxidantes con mayor respuesta al efecto de la hipoxia a nivel transcripcional. 36